弯曲杆菌属免疫原性组合物及其用途.pdf

本发明提供针对弯曲杆菌属的免疫原性组合物和使用所述免疫原性组合物产生针对弯曲杆菌属的免疫反应和/或减少弯曲杆菌属肠道定居的方法。

1.  一种免疫原性组合物，其包含一种或多种表达载体，所述表达载体包含：
(a)编码蛋白质或其抗原性部分的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)与所述多核苷酸有效连接的启动子，其中所述启动子区能够指导编码的蛋白质的表达。

2.  根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含编码两种或更多种所述蛋白质或其抗原性部分的一种或多种多核苷酸。

3.  根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含编码全部三种所述蛋白质或其抗原性部分的一种或多种多核苷酸。

4.  根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的一种或多种蛋白质或其抗原性部分。

5.  根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO:10-106的氨基酸序列的一种或多种蛋白质。

6.  根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)的氨基酸序列的蛋白质。

7.  根据权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其还包 含一种或多种表达载体，所述载体包含编码蛋白质或其抗原性片段的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含与SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(Cj1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(Cj0428蛋白)、SEQ ID NO:112(Cj0168c蛋白)、SEQ ID NO:114(Cj0427蛋白)、SEQ ID NO:116(Cj0113蛋白)、SEQ ID NO:118(Cj0982c蛋白)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白)的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质。

8.  根据权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含一种或多种表达载体，所述载体包含编码蛋白质的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(Cj1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(Cj0428蛋白)、SEQ ID NO:112(Cj0168c蛋白)、SEQ ID NO:114(Cj0427蛋白)、SEQ ID NO:116(Cj0113蛋白)、SEQ ID NO：118(Cj0982c蛋白)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白)的氨基酸序列。

9.  一种免疫原性组合物，其包含一种或多种表达载体，所述载体包含：
(a)编码蛋白质的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含与SEQ ID NO:10-106至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)与所述多核苷酸有效连接的启动子，其中所述启动子区能够指导编码的蛋白质的表达。

10.  根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物存在于无毒力、非弯曲杆菌属细菌载体细胞中。

11.  根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中无毒力、非弯曲杆菌属细菌载体细胞选自减毒的单核增生李斯特菌(L.monocytogenes)、减毒的沙门氏菌属(Salmonella)、减毒的霍乱弧菌(V.cholerae)、减毒的志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、减毒的牛分支杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、减毒的小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)、减毒的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、戈登链球菌(S.gordonii)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)和葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)。

12.  根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中无毒力、非弯曲杆菌属细菌载体细胞是减毒的沙门氏菌。

13.  一种免疫原性组合物，其包含
(a)一种或多种分离的蛋白质或其抗原性部分，所述分离的蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)可药用载体。

14.  根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含两种或更多种所述蛋白质或其抗原性部分。

15.  根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含全部三种所述蛋白质或其抗原性部分。

16.  根据权利要求13-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中一种或多种分离的蛋白质包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其抗原性部分。

17.  根据权利要求13-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中一种或多种分离的蛋白质包含选自SEQ ID NO:10-106的氨基酸序列。

18.  根据权利要求13-16中任一项所述的免疫原性组合物，其中一种或多种分离的蛋白质具有选自SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)的氨基酸序列。

19.  根据权利要求13-18中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含一种或多种蛋白质或其抗原性片段，所述蛋白质具有与选自以下的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(Cj1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(Cj0428蛋白)、SEQ ID NO:112(Cj0168c蛋白)、SEQ ID NO:114(Cj0427蛋白)、SEQ ID NO:116(Cj0113蛋白)、SEQ ID NO:118(Cj0982c蛋白)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白)。

20.  根据权利要求13-18中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含一种或多种蛋白质，所述蛋白质具有选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(Cj1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(Cj0428蛋白)、SEQ ID NO:112(Cj0168c蛋白)、SEQ ID NO:114(Cj0427蛋白)、SEQ ID NO:116(Cj0113蛋白)、SEQ ID NO:118(Cj0982c蛋白)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白)。

21.  根据权利要求1-20中任一项所述的免疫原性组合物，其中将免疫原性组合物配制用于经口递送或粘膜递送。

22.  根据权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。

23.  用于刺激针对弯曲杆菌属的免疫反应的方法，包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-22中任一项所述的免疫原性组合物以产生针对弯曲杆菌的免疫反应。

24.  用于减少受试者中弯曲杆菌属肠道定居的方法，包括施用有效量的根据权利要求1-22中任一项所述的免疫原性组合物以减少受试者中的弯曲杆菌属肠道定居。

25.  根据权利要求23或24所述的方法，其中受试者选自鸡、火鸡、鸟、牛、羊、猪、犬、猫和人。

26.  根据权利要求23或24所述的方法，其中受试者选自鸡和火鸡。

27.  根据权利要求26所述的方法，其中施用最初在鸡或火鸡孵化后截至14日实施。

28.  根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中施用包括经口或粘膜施用。

29.  根据权利要求26或27所述的方法，其中施用包括在饮用水中口服施用。

30.  根据权利要求26或27所述的方法，其中施用包括在受试者的身体上以喷雾剂施用所述免疫原性组合物。

31.  根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中所述方法用于诱导针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)和/或乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)的免疫反应或减少其肠道定居。

弯曲杆菌属免疫原性组合物及其用途
交叉引用
本申请要求2012年2月1日提交的美国临时专利申请系列号61/632,888和2012年5月29日提交的美国临时专利申请系列号61/689,078的优先权，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
政府资助声明
本发明以美国农业部孵化基金在编号127032下授予的政府资助作出。美国政府在本发明中享有某些权利。
背景
弯曲杆菌病主要是一种伴随处置和消费家禽的食源性疾病，被视为传播中最突出的风险因子。弯曲杆菌(Campylobacter spp.)感染是细菌性胃肠炎的主导原因之一，每年在美国估计造成130万病例(Scallan等人，2011)，导致每年8-56亿美元卫生保健成本(Buzby等人，1997)。严重并发症如关节炎出现于估计的1-5％病例中(Pope等人，2007)并且Guillain-Barre综合征(神经肌肉瘫痪的一种形式)以每1,000位患者1.0的比率出现(Altekruse和Tollefson，2003)。归因于出现并持续存在与日益增加的产业法规限制相关的抗生素耐药性，迫切需要控制策略如接种。迄今，不存在生产商可用于减少即将加工的家禽中弯曲杆菌数目的介入方法或疫苗。
从2011年7月1日开始，USDA-FSIS(食品安全检验局)已经在屠宰厂对仔鸡冷却胴体执行弯曲杆菌的新实施标准(FSIS NOTICE，31-11，6/30/11)。这些标准将允许51份样品组中不多于8个阳性弯曲杆菌样品，计划最初警告各公司并且在2013年处以罚款。一项大型基线研究在我们的实验室中实施(由USDA资助)以从2007-2009年对屠 宰厂中弯曲杆菌水平定量。我们的研究展示21.9％(213/972)的冷却后胴体淋洗样品呈弯曲杆菌阳性，这等于每个51份样品集合11.17份。显然，这超过来自冷却胴体样品的可允许弯曲杆菌数并且将促进对生产商和加工厂实施罚款，除非可以实现家禽中弯曲杆菌的减少。目前，不存在生产商可获得的用来减少家禽中弯曲杆菌载量的可用介入方法或疫苗。
发明简述
在第一方面，本发明提供免疫原性组合物，其包含一种或多种表达载体，所述表达载体包含：
(a)编码蛋白质或其抗原性部分的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)与所述多核苷酸有效连接的启动子，其中所述启动子区能够指导编码的蛋白质的表达。
在第二方面，本发明提供免疫原性组合物，其包含
(a)一种或多种分离的蛋白质或其抗原性部分，所述分离的蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)可药用载体。
在第三方面，本发明提供用于刺激针对弯曲杆菌的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明任何实施方案的免疫原性组合物以产生针对弯曲杆菌的免疫反应。
在第四方面，本发明提供用于减少受试者中弯曲杆菌肠道定居的方法，包括施用有效量的根据本发明任何实施方案的免疫原性组合物以减少受试者中的弯曲杆菌肠道定居。
附图简述
图1是pYA3493质粒的示意图。
发明详述
所引用的全部参考文献均通过引用的方式完整并入本文。在本申请范围内，除非另外声明，否则所用的技术可以在几种熟知参考文献的任一者中找到，如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,第185卷,D.Goeddel编著,1991.Academic Press,San Diego,CA)、“Guide to Protein Purification”引自Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer编著,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等人1990.Academic Press,San Diego,CA)、Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY)、Gene Transfer and Expression Protocols,第109-128页,E.J.Murray编著,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)和Ambion 1998年目录(Ambion,Austin,TX)。
如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓。除非另外明确地陈述，否则如本文所用的“和”可与“或”互换地使用。
除非上下文另外清楚地说明，否则可以组合使用本发明任何方面的全部实施方案。
在第一方面，本发明提供免疫原性组合物，其包含一种或多种表达载体，所述表达载体包含：
(i)编码蛋白质或其抗原性部分的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(ii)与所述多核苷酸有效连接的启动子，其中所述启动子区能够 指导编码的蛋白质的表达。
发明人已经从空肠弯曲杆菌(C.jejuni)鉴定了三个推定性毒力基因(Cj0248、Cj0588和Cj0998c)，所述基因编码来自细菌外膜的新蛋白质。发明人已经进一步发现，Cj0998c蛋白、Cj0588蛋白和Cj0248蛋白的每一者均是刺激针对空肠弯曲杆菌(“空肠弯曲杆菌”)的有效免疫反应的强力免疫原。例如，如本文中详细公开，与未接种的对照禽的盲肠内容物中空肠弯曲杆菌数目相比时，采用表达Cj0988c蛋白的载体的两个独立鸡接种试验显示攻击后禽中的空肠弯曲杆菌数目降低平均2.5个对数CFU(几何平均数3个对数)。另外，接种试验显示鸡的盲肠内容物中空肠弯曲杆菌显著减少(1-4个对数)(采用异源菌株时1个对数并且采用同源菌株时4个对数)，所述鸡用表达Cj0588蛋白的载体接种并用空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)攻击。每种蛋白质最初从空肠弯曲杆菌生物被膜的外膜(OMP)提取分离。
因而，本发明的免疫原性组合物可以例如用于面临弯曲杆菌感染和/或定居风险的受试者中刺激免疫反应，所述受试者包括但不限于脊椎动物如鸡、火鸡、鸟、牛、羊、猪、犬、猫和人。
在一个实施方案中，一种或多种表达载体编码所述的蛋白质之一或其抗原性片段。在另一个实施方案中，一种或多种表达载体编码了包含与所述的氨基酸序列(即：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6；或SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8)至少80％相同的氨基酸序列的两种蛋白质或其抗原性片段。在这个实施方案中，单个表达载体可以编码两种蛋白质或其抗原性片段，或该组合物可以包含两种表达载体，其中每种表达载体编码所述的蛋白质之一或其抗原性片段。在这个实施方案中，所用的表达载体可以是相同的(除蛋白质编码序列之外)或不同的。
在另一个实施方案中，一种或多种表达载体编码了包含与所述的氨基酸序列(即：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6)至少80％相同的氨基酸序列的全部三种蛋白质或其抗原性片段。在这个实施方案中，单个表达载体可以编码全部三种蛋白质或其抗原性片段。 可选地，该组合物可以包含两种表达载体，一种表达载体编码所述的蛋白质之一或其抗原性片段，并且另一种表达载体编码两种所述的蛋白质或其抗原性片段。在这个实施方案的又一个备选中，组合物可以包含三种表达载体，每种表达载体编码所述的蛋白质之一或其抗原性片段。在这些备选实施方案的每一者中，使用的多种表达载体可以是相同或不同的。本文提供编码一种或多种所述蛋白质的表达载体的非限制性例子。基于本公开，根据全部本发明的实施方案制备表达载体完全处于本领域技术人员的能力范围内。
Cj0998c、Cj0588和Cj0248蛋白存在于不同空肠弯曲杆菌菌株之间高度保守的变体中，并且因此由一种或多种表达载体编码的蛋白质可以在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内是至少80％相同或相似的(具有相似特性即疏水性、亲水性等的残基)。在多种其他实施方案中，由一种或多种表达载体编码的蛋白质在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施方案中，至少一种多核苷酸编码选自以下的蛋白质或其抗原性片段：
(a)SEQ ID NO:7(Cj0998c类属)
MKK(I/V/F)(L/V)(V/A/L)S(V/I)(L/F)S(S/F)CLLASALSAVSFKEDSLK(I/V)SFEGYKTKDM(I/V)G(T/V/I/A)(K/R)GEFKNVEY(K/N)FSK(N/S)(I/T)KD(L/F)ASYLKGAKATI(K/E)PS(N/D)AFM(G/S)EG(N/L)D(I/V)ITNNITKVFFPALLG(D/N)(T/A)DIKVVFQD(V/A/M)I(A/V)GE-X1ITMDKKSTI(V/I)PLTYTIKD(N/D)KFEAKGQ(L/F)DLH(T/A)FKN(G/A)SKALKALSD(V/A)A(A/T/P)GHGGISWPLVDISFNADL(A/T/V)E
其中X1不存在或是
NKGVISAK(SEQ ID NO:135)；
(b)SEQ ID NO:8：(Cj0588类属)
X1-(L/M)(D/N/E)LL(S/R)EIY(V/I)SRAALKLK(K/N)FLEEN(D/G/N)IE(I/V)(K/N)(H/Q/N)KNCLDIGSSTGGFVQILLEN(Q/K)ALKIT(A/T)LDVG(S/N)NQLH(P/S/L)(S/N)LR(V/A/T)NE(K/I)(I/V)IL(H/Y)EN(T/I)DLR(A/T/V)FKSEEKFE(L/F)(V/I)TCDVSFISL(I/V)NLLYY(I/V)(D/N)NLAL(K/R)EIILLFKPQFEVGKN(I/V)KRDKKGVLKD(D/G)(K/R)(A/V)ILKA(R/K)MDFEK(A/E)CAKL(G/S)W(L/F/I)LKNTQKS(S/C)IKGKEGNVEYFYYYIKN
其中X1不存在或是
M(R/I)(F/-)(D/-)FF(V/I)SKRL(N/D)ISRNKALELIE(N/S)EE(I/V)LLNGK(S/N)FKAS(F/C)DVKN(F/L)LENLKK(T/A/K)QDLN(P/L/S)E(D/E)(I/V)(L/Y)L(A/T/S)(N/D/K)(E/G)L(K/N)(SEQ ID NO:136)；以及
(c)SEQ ID NO:9(Cj0248类属)
(M/-)I(G/-)DMNELLLKSVEVLPPLPDTVSKLRKYVSEANSNIETMKV(A/V)EIISSDPLMTAKLLQLANSPYYGFTREITTI(N/S)QVITLLG(V/I)GNIINIV(M/T)ADSI(R/K)D(N/S)FKIDVSPYGL(N/D)T(Q/K)(N/V)FL(K/R)(T/N)CN(E/D)EATFI(A/V/T)NWLNDEDKKLSHLLVPCAMLLRLGIVIFSNFLIQN(H/Y/F)(K/R)-X1
其中X1不存在或是
(D/E)K(D/E)FL(A/T)FLN(-/E/K)(-/T)K(N/S/I))EN(L/I)ALAENEFLGVDHISFLGFLL(H/Y)RWNFDD(V/I)LIESICFV(R/H)TPHAARE(K/E)VKKSAYALAITDHLF(A/T)PHDGSSPFN(A/V/T)KAAVALL(K/E)EAK-X2(SEQ ID NO:137或138)；和
其中X2不存在或选自
TQGINFDL(N/D)NLLSKLP(N/S)KAKENL(N/D)(K/E)ED(SEQ ID NO:139)和
NSRN(SEQ ID NO:140)。
在多种其他实施方案中，至少一种多核苷酸编码选自SEQ ID NOS:10-106的蛋白质或其抗原性片段。SEQ ID NOS:44-82分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0998c蛋白同源物；SEQ ID NOS:83至106分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0588蛋白同源物；并且SEQ ID NOS:10至43分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0248蛋白同源物。
表达载体可以编码所述蛋白质的“抗原性部分”。如本文所用，“抗原性部分”是在所述氨基酸序列中具有10个或更多个连续氨基酸的任何片段。在多种其他实施方案中，抗原性部分是本发明任何实施方案的具有所述氨基酸序列的15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250或275个连续氨基酸的任何片段。
一种或多种分离的多核苷酸可以是单链或双链DNA、RNA、基因组DNA或cDNA。一种或多种分离的多核苷酸可以是编码所述的一种或多种蛋白质或其抗原性片段的任何核酸。在一个实施方案中，一种或多种分离的多核苷酸是SEQ ID NO:1(Cj0998c基因)、SEQ ID NO:3(Cj0588基因)和SEQ ID NO:5(Cj0248基因)的一者或多者或其编码所述蛋白质的抗原性部分的部分。基于本文中的教导，本领域技术人员将显见何种多核苷酸序列将编码所述的多肽或其抗原性片段。
如本文所用，“分离的多核苷酸”是已经从其在基因组中或在cDNA序列中的正常周围核酸序列取出的那些多核苷酸。这类分离的核酸序列可以包含可用于促进所编码蛋白质表达和/或纯化的额外序列，包括但不限于聚腺苷酸化序列、修饰的Kozak序列以及(如果对给定用途适宜)编码表位标签、输出信号、分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。
适于预期用途的任何表达载体可以用于本发明的免疫原性组合物中。这类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。构建用于转染原核细胞的表达载体也是本领域熟知的并且因此可以通过标准技术完成。(见，例如，Sambrook、Fritsch和Maniatis，引自：Molecular Cloning,A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Gene Transfer and Expression Protocols，第109-128页，E.J.Murray编著，The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)和Ambion 1998年目录(Ambion，Austin，TX)。表达载体必须在宿主生物中作为附加体或通过整合至宿主染色体DNA中是可复制的。在一个优选实施方案中，表达载体包括质粒。然而，本发明是意在包括起到等同功能的其他表达载体，如病毒载体。表达载体的细节将取决于最终的所需用途。基于本文中的教导，针对预期用途设计适宜的表达载体完全处于本领域技术人员的能力范围内。
可以使用可指导编码的蛋白质表达(即：“有效连接”)的任何合适启动子。术语“启动子”包括足以指导所编码蛋白质表达的任何核酸序列，包括诱导型启动子、阻遏型启动子和组成型启动子。如果诱导性启动子，则存在介导蛋白质表达调节的序列，从而多核苷酸仅当诱导物分子存在时才转录。用于已结合多核苷酸响应于环境信号的调节型表达的这类顺式活性序列是本领域熟知的。表达载体可以包含任何其他控制序列，如可以适于预期用途。控制序列不需要与核苷酸序列连续，只要它们发挥作用以指导其表达即可。因此，例如，不翻译但被转录的间插序列可以存在于启动子序列和核酸序列之间，并且该启动子序列仍可以视为“与编码序列有效连接”。其他这类控制序列包括但不限于多聚腺苷化信号、增强子、终止信号和核糖体结合位点。
本发明的免疫原性组合物还可以包含任何其他合适的组分，如可用于给定的目的。在各种非限制性实施方案中，组合物还可以包含一种或多种表达载体，所述表达载体包含编码蛋白质或其抗原性片段的至少一种多核苷酸，所述蛋白质选自包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白；例如由SEQ ID NO:141编码)、SEQ ID NO:108(1656c蛋白；例如由SEQ ID NO:107编码)、SEQ ID NO:110(0428蛋白；例如由SEQ ID NO:109编码)、SEQ ID NO:112(0168c蛋白；例如由SEQ ID NO:111编码)、SEQ ID NO:114(0427蛋白；例如由SEQ ID NO:113编码)、SEQ ID NO:116 (Cj0113蛋白；例如由SEQ ID NO:115编码)、SEQ ID NO:118(Cj0982c蛋白；例如由SEQ ID NO:117编码)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白；例如由SEQ ID NO:119编码)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白；例如由SEQ ID NO:121编码)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白；例如由SEQ ID NO:123编码)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白；例如由SEQ ID NO:125编码)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白；例如由SEQ ID NO:127编码)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白；例如由SEQ ID NO:129编码)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白；例如由SEQ ID NO:131编码)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白；例如由SEQ ID NO:133编码)的氨基酸序列至少80％相同。
一种或多种表达载体可以是相同或不同的一种或多种表达载体，所述载体包含编码SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)、SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)或其片段的至少一种多核苷酸。上文公开的一种或多种表达载体的全部实施方案均同等地适用于这些其它组分。通过非限制性例子，一种或多种表达载体可以是1、2、3或4种其它载体，所述的其它载体编码SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(0428蛋白)、SEQ ID NO:112(0168c蛋白)和SEQ ID NO:114(0427蛋白)或其抗原性片段。本领域技术人员将理解可以根据本发明方法使用的多种其他组合。基于本公开，根据全部本发明的实施方案制备表达载体完全处于本领域技术人员的能力范围内。
与上文提及的免疫原相似，任选的蛋白质免疫原存在于不同空肠弯曲杆菌菌株之间高度保守的变体中，并且因此由一种或多种表达载体编码的蛋白质可以在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内是至少80％相同。在多种其他实施方案中，由一种或多种表达载体编码的蛋白质在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
通过使用标准方法如通过肠胃外递送作为裸DNA施用，本发明的免疫原性组合物可以用于诱导免疫反应。可选地，表达载体可以包括病毒表达载体，包括但不限于重组腺联病毒(AAV)基因递送载体。在这个实施方案中，表达载体在5'和3'末端上由有功能的AAV反向末端重复(ITR)序列界定。“有功能的AAV ITR序列”意指ITR序列如预期那样发挥拯救、复制和包装AAV病毒粒的作用。可以使用标准方法产生将本发明表达载体包入衣壳的重组AAV(rAAV)病毒粒。在一个实施方案中，将本发明AAV表达载体引入生产细胞中，随后引入AAV辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中被表达并且补足AAV载体中缺少的AAV辅助病毒功能的AAV编码区。随后将辅助病毒和/或额外载体引入生产细胞中，其中辅助病毒和/或额外载体提供能够支持高效rAAV病毒产生的附属功能。随后培养生产细胞以产生rAAV。使用标准方法实施这些步骤。使用AAV包装细胞和包装技术，通过本领域已知的标准技术产生将本发明重组AAV载体包入衣壳的复制缺陷型AAV病毒粒。这些方法的例子可以例如在美国专利号5,436,146；5,753,500、6,040,183、6,093,570和6,548,286中找到，所述专利明确地通过引用的方式完整并入本文。用于包装的其他组合物和方法在Wang等人(US2002/0168342)中描述，所述文献也通过引用的方式完整并入本文。可以使用用于产生递送用病毒粒子的任何合适方法。
在另一个实施方案中，一种或多种表达载体存在于载体细胞中，所述载体细胞包括但不限于无毒力、非弯曲杆菌属细菌载体细胞。活细菌疫苗“载体”(即：包含免疫原性组合物的细菌细胞)已经成功地用来激发有效免疫反应以阻止感染。已经改造减毒细菌细胞递送的重组疫苗以按高水平稳定表达保护性抗原。它们能够在无明显组织损伤或其他性能降低作用的情况下刺激强烈的初次体液免疫反应、粘膜免疫反应和持久性记忆免疫反应。在多种非限制性实施方案中，细菌载体细胞是选自减毒单核增生李斯特菌(L.monocytogenes)、减毒沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、减毒霍乱弧菌(V.cholerae)、减毒志贺氏菌 属物种(Shigella spp.)、减毒牛分支杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、减毒小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)、减毒炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、戈登链球菌(S.gordonii)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)和葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)的无毒力细菌细胞。如本文所用，“减毒”意指与未减毒的细菌载体相比，细菌在对其递送细菌的宿主中造成疾病症状方面被减弱。合适的减毒细菌可以是任何物种或菌株，所述物种或菌株经充分减毒或可以经充分减毒以允许其以活细胞和/或死亡形式不致病地施用至人和/或动物。在一个实施方案中，使用减毒沙门氏菌物种。在示例性实施方案中，可以使用的沙门氏菌包括但不限于肠道沙门氏菌菌株，其选自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)、海德堡沙门氏菌(S.Heidelberg)、鸡伤寒沙门氏菌(S.Gallinarum)、哈达尔沙门氏菌(S.hadar)、阿贡纳沙门氏菌(S.Agona)、肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi)和婴儿沙门氏菌(S.Infantis)。鼠伤寒沙门氏菌特别地可用于接种目的，因为其基因组序列充分表征并且许多动物研究证实其安全的医学用途。已经构建重组减毒沙门氏菌疫苗(RASV)以递送来自其他病原体的抗原以在接种的宿主中诱导针对这些病原体的免疫力；见，例如，Curtiss等人，Crit Rev Immunol.2010；30(3):255-70；2010；Qiu等人，J.Virological Methods 188:108；Strugnell等人，Infect.Immunol.1992,60:3994；Layton等人，Clinical and Vaccine Immunology march 2011,449-454；Al-Ojali等人，Microbial Pathogenesis 52:326(2012)；和(Wyszynska等人，2004)Wyszyńska等人，(2004)。在一个实施方案中，RASV包含在pmi(甘露糖-6-磷酸异构酶)基因、fur(铁吸收调节蛋白)基因和crp(cAMP调节蛋白)基因中的致弱突变(见，例如，Li等人，PNAS106:592-5972009，Curtiss等人，2009和US 8,133,493)。在另一个实施方案中，RASV包含US 8,133,493中公开的χ9992载体。在另一个实施方案中，RASV是可商业获得的那一种，如(Lohman Animal Health,US)。
减毒的细菌细胞可以使用本领域标准技术，与一种或多种表达载体一起转染。
在第二方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含
(a)一种或多种分离的蛋白质或其抗原性部分，所述分离的蛋白质选自包含与SEQ ID NO:2(Cj0998c蛋白)、SEQ ID NO:4(Cj0588蛋白)和SEQ ID NO:6(Cj0248蛋白)至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)可药用载体。
如上文对本发明的第一方面所公开，本发明第二方面的免疫原性组合物可以例如用于面临空肠弯曲杆菌感染或定居风险的受试者中刺激免疫反应，所述受试者包括但不限于脊椎动物如鸡、火鸡、牛、羊、猪和人。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含所述的蛋白质之一或其抗原性片段。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含所述蛋白质的两种或其抗原性片段，其中所述蛋白质包含与所述氨基酸序列(即：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6；或SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8)至少80％相同的氨基酸序列。在又一个实施方案中，免疫原性组合物包含与所述的氨基酸序列(即：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6)至少80％相同的氨基酸序列的全部三种蛋白质或其抗原性片段。
Cj0998c、Cj0588和Cj0248蛋白存在于不同空肠弯曲杆菌菌株之间高度保守的变体中，并且因此这些蛋白质可以在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内是至少80％相同的。在多种其他实施方案中，所述蛋白质在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施方案中，至少一种蛋白质选自以下或其抗原性片段：
(a)SEQ ID NO:7(Cj0998c类属)
MKK(I/V/F)(L/V)(V/A/L)S(V/I)(L/F)S(S/F)CLLASALSAVSFKEDSLK(I/V)SFEGYKTKDM(I/V)G(T/V/I/A)(K/R)GEFKNVEY(K/N)FSK(N/S)(I/T)KD(L/F)ASYLKGAKATI(K/E)PS(N/D)AFM(G/S)EG(N/L)D(I/V)ITNNITKVFFPALLG(D/N)(T/A)DIKVVFQD(V/A/M)I(A/V)GE-X1ITMDKKSTI(V/I)PLTYTIKD(N/D)KFEAKGQ(L/F)DLH(T/A)FKN(G/A)SKALKALSD(V/A)A(A/T/P)GHGGISWPLVDISFNADL(A/T/V)E
其中X1不存在或是
NKGVISAK(SEQ ID NO:135)；
(b)SEQ ID NO:8：(Cj0588类属)
X1-(L/M)(D/N/E)LL(S/R)EIY(V/I)SRAALKLK(K/N)FLEEN(D/G/N)IE(I/V)(K/N)(H/Q/N)KNCLDIGSSTGGFVQILLEN(Q/K)ALKIT(A/T)LDVG(S/N)NQLH(P/S/L)(S/N)LR(V/A/T)NE(K/I)(I/V)IL(H/Y)EN(T/I)DLR(A/T/V)FKSEEKFE(L/F)(V/I)TCDVSFISL(I/V)NLLYY(I/V)(D/N)NLAL(K/R)EIILLFKPQFEVGKN(I/V)KRDKKGVLKD(D/G)(K/R)(A/V)ILKA(R/K)MDFEK(A/E)CAKL(G/S)W(L/F/I)LKNTQKS(S/C)IKGKEGNVEYFYYYIKN
其中X1不存在或是
M(R/I)(F/-)(D/-)FF(V/I)SKRL(N/D)ISRNKALELIE(N/S)EE(I/V)LLNGK(S/N)FKAS(F/C)DVKN(F/L)LENLKK(T/A/K)QDLN(P/L/S)E(D/E)(I/V)(L/Y)L(A/T/S)(N/D/K)(E/G)L(K/N)(SEQ ID NO:136)；和
(c)SEQ ID NO:9(Cj0248类属)
(M/-)I(G/-)DMNELLLKSVEVLPPLPDTVSKLRKYVSEANSNIETMKV(A/V)EIISSDPLMTAKLLQLANSPYYGFTREITTI(N/S)QVITLLG(V/I)GNIINIV(M/T)ADSI(R/K)D(N/S)FKIDVSPYGL(N/D)T(Q/K)(N/V)FL(K/R)(T/N)CN(E/D)EATFI(A/V/T)NWLNDEDKKLSHLLVPCAMLLRLGIVIFSNFLIQN(H/Y/F)(K/R)-X1
其中X1不存在或是
(D/E)K(D/E)FL(A/T)FLN(-/E/K)(-/T)K(N/S/I))EN(L/I)ALAENEFLGVDHISFLGFLL(H/Y)RWNFDD(V/I)LIESICFV(R/H)TPHAARE(K/E)VKKSAYALAITDHLF(A/T)PHDGSSPFN(A/V/T)KAAVALL(K/E)EAK-X2(SEQ ID NO:137或138)；和
其中X2不存在或选自
TQGINFDL(N/D)NLLSKLP(N/S)KAKENL(N/D)(K/E)ED(SEQ IDNO:139)和
NSRN(SEQ ID NO:140)。
在多种其他实施方案中，至少一种多核苷酸编码选自SEQ ID NOS:10-106的蛋白质或其抗原性片段。SEQ ID NOS:44-82分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0998c蛋白同源物(homolog)；SEQ ID NOS:83-106分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0588蛋白同源物；并且SEQ ID NOS:10-43分别是来自其他空肠弯曲杆菌菌株的Cj0248蛋白同源物。
本发明的这个第二方面的任何实施方案的免疫原性组合物可以包含所述蛋白质的“抗原性部分”。如本文所用，“抗原性部分”是在所述氨基酸序列中具有10个或更多个连续氨基酸的任何片段。在多种其他实施方案中，抗原性部分是具有所述氨基酸序列的15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250或275个连续氨基酸的任何片段。
本发明第二方面的免疫原性组合物可以包含以任何合适方式修饰的蛋白质。在一个实施方案中，处理组合物的蛋白质组分以延长体内半寿期，通过例如聚乙二醇化、羟基化、PAS化(PASylation)或糖基化。如认为适宜，蛋白质也可以使用本领域标准技术进行糖基化。在另一个实施方案中，免疫原性组合物中拥有N-糖基化序列(NXS或NXT)的那些蛋白质组分可以糖基化，以帮助进一步刺激免疫反应。
本发明第二方面的免疫原性组合物还可以包含任何其他合适的组分，如可用于给定的目的。在各种非限制性实施方案中，组合物还可以包含一种或多种额外的蛋白质或其抗原性片段，所述蛋白质选自包 含与SEQ ID NO:142(Cj1534c蛋白)、SEQ ID NO:108(Cj1656c蛋白)、SEQ ID NO:110(Cj0428蛋白)、SEQ ID NO:112(Cj0168c蛋白)、SEQ ID NO:114(Cj0427蛋白)、SEQ ID NO:116(Cj0113蛋白)、SEQ ID NO:118(Cj0982c蛋白)、SEQ ID NO:120(Cj0921c蛋白)、SEQ ID NO:122(Cj1259蛋白)、SEQ ID NO:124(Cj1339c蛋白)、SEQ ID NO:126(Cj0034c蛋白)、SEQ ID NO:128(Cj0404蛋白)、SEQ ID NO:130(Cj0365c蛋白)、SEQ ID NO:132(Cj0755蛋白)和SEQ ID NO:134(Cj0420蛋白)的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的蛋白质。与上文提及的免疫原相似，任选的蛋白质免疫原存在于不同空肠弯曲杆菌菌株之间高度保守的变体中，并且因此所述蛋白质可以在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内是至少80％相同。在多种其他实施方案中，由一种或多种表达载体编码的蛋白质在所述氨基酸序列或其抗原性片段的全长范围内至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在另一个实施方案中，本发明第二方面的免疫原性组合物还可以包含如WO 2008/008092中所述的空肠弯曲杆菌菌毛蛋白，所述专利通过引用的方式完整并入本文。显示WO 2008/008092中描述的菌毛蛋白刺激针对空肠弯曲杆菌的免疫反应，并且因此它适于纳入本发明第二方面的免疫原性组合物。WO 2008/008092中描述了用于分离空肠弯曲杆菌菌毛蛋白的方法。
本发明的免疫原性组合物可以包含任何合适量/剂量的确定为最适宜的组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含每个剂量约10⁶–10¹⁰个无毒力细菌细胞。在其中组合物包含免疫原性蛋白的另一个实施方案中，该组合物可以包含约0.1μg/kg-100mg/kg体重的蛋白质；可选地，它可以是0.5μg/kg至50mg/kg；1μg/kg至25mg/kg或5μg/kg至10mg/kg体重的蛋白质。
可以通过本领域已知的任何手段配制本发明的免疫原性组合物(即：本发明第一方面和第二方面的任何实施方案或实施方案组合)。 免疫原性组合物一般配制为药物组合物，如上文公开的那些，并且可以配制用于通过任何合适途径施用，所述途径包括经口、(作为注射剂)肠胃外地、通过吸入喷雾剂、鼻内、直肠、粘膜、局部途径，或用于通过经口灌胃或随意饲喂施用，例如，作为液体溶液剂或混悬剂在饮用水中，在含有常规可药用载体、佐剂和溶媒的剂量单位制剂中。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、椎管内、颅内、胸腔内、输注技术或腹内。也可以制备在注射或其他施用之前适于液体中溶液剂或液体中混悬剂的固态形式。也可以将组合物例如乳化或在脂质体或微粒子中包囊化。免疫原性组合物也可以存在于转基因植物中和/或由转基因植物表达。
本发明的免疫原性组合物还可以包含任何合适的佐剂。免疫佐剂通常包括以非特异性方式强化宿主的免疫反应的物质。许多不同的佐剂是本领域已知的。佐剂的例子是弗氏完全佐剂和不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物和多胺如硫酸葡聚糖、卡波普和吡喃、寡肽、乳化石蜡-Emulsigen^TM(MVP Labs,Ralston,Nebr.)、含有氢氧化铝的L80佐剂(Reheis,N.J.)、Quil A^TM(Superphos)；表面活性物质如Span^TM、Tween^TM、十六胺、溶血卵磷脂(lysolecitin)、甲氧基十六烷基甘油和皂素；肽类如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽；免疫刺激复合物(ISCOMS)、矿物油例如Bayol或Markol、植物油或其乳液、氢氧化铝；N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称作nor-MDP)；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油酰-3羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP19835A，称作MTP-PE)；和在2％鲨烯/Tween 80乳液中含有从细菌提取的三种组分：单磷酸酯类脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)的RIBI。在设计用于粘膜施用的实施方案中，免疫原性组合物还可以包含佐剂，包括但不限于如无毒霍乱毒素B亚基(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.)和有机金属聚合物，包括在聚合物末端或沿其长度与粒子或其核芯结合的线型、分枝或交联硅氧 烷。这类聚硅氧烷可以在分子量方面从约400道尔顿直至约1,000,000道尔顿变动；优选的长度范围是从约700道尔顿至约60,000道尔顿。合适的官能化硅氧烷包括(三烷氧基甲硅烷基)烷基封端的聚二烷基硅氧烷和三烷氧基甲硅烷基封端的聚二烷基硅氧烷，例如，3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基封端的聚二甲基硅氧烷。见通过引用方式并入本文的美国专利号5,571,531。也可以将磷腈(phosphazene)聚电解质掺入免疫原性组合物中用于粘膜施用(见，例如，美国专利号5,562,909)。
本发明的免疫原性组合物也可以包含防腐剂如叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、新霉素和多粘菌素。
免疫原性组合物可以与药学上可接受并与待使用的蛋白质免疫原相容的赋形剂或载体混合。合适的赋形剂包括但不限于水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。这种免疫原性组合物可以通过将蛋白质与可药用载体混合容易地制备。将可药用载体理解为是一种化合物，所述化合物没有不利地影响待接种动物的健康，至少不到这样的程度：不良作用比动物不接种时所见到的作用更差。可药用载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以是例如缓冲液。
免疫原性组合物还可以包含稳定剂，例如以保护易降解组分免遭降解，以增强组合物的货架期，或以改善冷冻干燥效率。有用的稳定剂包括而不限于SPGA、脱脂乳、明胶、牛血清白蛋白或其他血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、蛋白质如白蛋白或酪蛋白或其降解产物和缓冲剂如碱金属磷酸盐。在使用白蛋白的情况下，它合乎需要地来自与将施用含有白蛋白的免疫原性组合物的动物(或人)相同的物种。冷冻干燥是一种高效保存方法。冻干的材料可以稳定储存许多年。冻干材料的储存温度可以完全高于零度，而不损害该材料。冷冻干燥可以根据全部熟知的标准冷冻干燥方法进行。然而，本发明的免疫原性组合物可以按任何适合的方式储存。例如，可以将免疫原性组合物冻干或稳定化并储存在食品或水中用于运输。
在设计免疫原性组合物用于施用至非人类受试者如鸡、火鸡、鸟、羊、猪、牛、犬或猫的一个示例性实施方案中，将免疫原性组合物配制 用于粘膜施用，如通过将组合物与饮用水或食物混合，或混合用作喷雾剂，以在动物上方喷雾以便动物在梳理行为期间摄入免疫原性组合物。然而，任何合适的施用方法可以用于任何受试者。因而，在多种实施方案中将免疫原性组合物配制用于眼内、鼻内或经皮施用。
在第三方面，本发明提供用于刺激针对弯曲杆菌的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据本发明第一方面或第二方面的任何实施方案或实施方案组合的免疫原性组合物以产生针对弯曲杆菌的免疫反应。
在第四方面，本发明提供用于减少受试者中弯曲杆菌肠道定居的方法，包括施用有效量的根据本发明第一方面或第二方面的任何实施方案或实施方案组合的免疫原性组合物以减少受试者中的弯曲杆菌肠道定居。
如本文中公开，发明人已经从空肠弯曲杆菌鉴定了三个新的推定性毒力基因(Cj0248、Cj0588和Cj0998c)，所述基因编码来自细菌外膜的新蛋白质。发明人已经进一步发现，Cj0998c蛋白、Cj0588蛋白和Cj0248蛋白的每一者均是刺激针对空肠弯曲杆菌的有效免疫反应的强力免疫原。例如，如本文中详细公开，与未接种的对照禽的盲肠内容物中空肠弯曲杆菌数目相比时，采用表达Cj0988c蛋白的载体的两个独立鸡接种试验显示攻击后禽中的空肠弯曲杆菌数目降低平均2.5个对数CFU(几何平均数3个对数)。另外，接种试验显示鸡的盲肠内容物中空肠弯曲杆菌显著减少(1-4个对数)(采用异源菌株时1个对数并且采用同源菌株时4个对数)，所述鸡用表达Cj0588蛋白的载体接种并攻击。每种蛋白质最初从空肠弯曲杆菌生物被膜的外膜(OMP)提取分离。
弯曲杆菌病是通常主要由空肠弯曲杆菌引起的食源性疾病。罹患本疾病的主要风险因素是处置和消费家禽。然而，弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌定居于家禽的流行病学是极端复杂的。禽在孵化14日以内被定居，在成长期末传播感染遍及群体。基于亚型和/或基因分型分析，在群体之间和在群体内部存在菌株差异。虽然一些群体保持不带弯曲杆 菌，但是截至成长时，大部分群体具有50-100％定居的禽。然而，肉鸡(broiler)(即，根据重量在约5至8周龄待屠宰肉用的任一性别的鸡)遭弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌污染，并且虽然这种微生物充当鸡中的正常菌群，但是轻微烹制的鸡是向人传播弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌的主要媒介并且仍是明显的公共卫生问题。
该方法可以对面临弯曲杆菌感染风险的任何合适受试者使用，所述受试者包括但不限于脊椎动物如鸡、火鸡、鸟、牛、羊、猪、犬、猫和人。在一个非限制性实施方案中，人类受试者可以是消费鸡肉、牛肉、火鸡或猪肉的任何人。在另一个实施方案中，人类受试者可以是与动物如鸡、火鸡、牛、羊和猪一起工作的一位受试者(即：农场工人、在屠宰场和肉类加工厂的工人等)。
在另一个实施方案中，受试者是饲养动物如鸡、火鸡、牛、羊和猪。在一个优选的实施例中，受试者是人。在这些实施方案中，饲养动物可以具有任何合适的年龄。禽在孵化14日以内被空肠弯曲杆菌定居，在成长期之末传播感染遍及群体。因而，在一个实施方案中，这些方法在孵化后截至约14日开始实施。本领域技术人员将理解，可能在初始施用后需要额外的增强施用；这类增强施用可以在任何合适的时间实施，如截至孵化后约21日。
在其中受试者是饲养动物的另一个非限制性实施方案中，这些方法在屠宰之前实施。然而，应当理解如果对给定用途适宜，则这些方法可以在任何合适的时间对鸡或火鸡使用。
弯曲杆菌病目前是美国在人类中最常见的细菌性食源疾病之一并且是每年在美国造成估计130万病例的原因，经常伴发急性胃肠炎。疾病正在形成时的感染剂量是可变的并且范围从500至10⁶个生物。感染剂量的变异据信归因于个体易感性或归因于该生物的相对毒力。潜伏时间是1日至7日，临床症状包括发热、严重腹部痉挛和志贺菌病常见的水样腹泻或痢疾样综合征。本病通常是自限性的，持续2日至7日，但是偶尔是致命的(每年120-360例死亡)，主要地在婴儿和青少年中致命。严重并发症如关节炎出现于估计的1-5％病例中并且 Guillain-Barre综合征(神经肌肉瘫痪的一种形式)以每1,000位患者1例的比率出现。
相反，弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌作为共生物在不产生任何明显疾病体征的情况下定居于家禽。类似地，弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌也可以作为共生物定居于其他饲养动物。但是，感染的牛可以遭遇腹泻、体重减轻并遭遇发热和增加的心率。
本发明第三方面和第四方面的方法可以用来刺激针对弯曲杆菌属任何物种定居肠道的免疫反应或减少这种肠道定居。在优选的实施方案中，本发明第三方面和第四方面的方法用来刺激针对弯曲杆菌变异物种定居肠道的免疫反应或用来减少这种肠道定居，所述弯曲杆菌变异物种包括但不限于空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌(C.coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)和/或乌普萨拉弯曲杆菌(C.upsaliensis)。
如本文所用，用于“刺激免疫反应”的方法对天然免疫或适应性免疫系统的细胞产生一种或多种影响(例如，成熟、增殖、直接呈递或交叉呈递抗原、基因表达谱)。例如，免疫反应可以涉及、影响天然免疫细胞或在其中检测到，所述天然免疫细胞例如是树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞和/或粒细胞(例如，嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞)。免疫反应可以涉及、影响适应性免疫细胞或在其中检测到，所述适应性免疫细胞例如包括淋巴细胞(例如，T细胞和/或B细胞)。可以通过检测这类涉及或影响观察到免疫反应，所述涉及或影响例如包括，一种或多种免疫调节物的表达或活性的存在、不存在或改变(例如，增加或减少)。免疫反应可以刺激从头抗体反应或先前检测不到的抗体反应，或通过例如引起增加的抗体反应(例如，抗体的量、增加的亲和性/亲合力)或增加的细胞反应(例如，增加的活化T细胞数目和/或增加的T细胞受体的亲和性/亲合力)，增强或抑制针对免疫原的现存应答。在某些实施方案中，免疫反应可以是保护性的，意指这种免疫反应可以能够阻止空肠弯曲杆菌感染的起始或持续或空肠弯曲杆菌在宿主内部生长和/或能够从宿主消除空肠弯曲杆菌。在一些情况下，从宿主消除病原体可以意味着该方法具有治疗性，从而该 方法用来治疗已经被空肠弯曲杆菌感染的受试者。当该方法具有治疗性时，方法可以包括治疗空肠弯曲杆菌感染，其中“治疗”意指实现以下一项或多项：(a)减少感染的严重性；(b)限制或阻止作为该感染之特征的症状形成；(c)抑制作为该感染之特征的症状加重；(d)在先前已经具有感染的受试者中限制或防止疾病复发；和(e)在先前出现感染症状的受试者中限制或防止症状的复发。
如本文所用，“减少弯曲杆菌肠道定居”意指减少在不施用本发明的一种或多种免疫原性组合物的情况下本来在受试者中会观察到的肠道定居水平。任何水平的减少有益于减少弯曲杆菌传播，例如，从家禽向消费家禽的人传播。在一个实施方案中，减少包括与不治疗的情况下的肠道定居相比，肠道定居减少至少10％；在多种其他实施方案中，与不治疗的情况下的肠道定居相比，肠道定居减少至少20％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。用于定量弯曲杆菌肠道定居水平的技术是本领域熟知的并且包括但不限于检查盲肠或粪便的弯曲杆菌水平。也建立了在多个加工点(如冷却后)确定生产中粪便性弯曲杆菌污染以定量来自饲养动物(如家禽)的胴体淋洗的弯曲杆菌生物水平的技术。
在本发明的第三方面和第四方面的优选实施方案中，一种或多种表达载体存在于载体细胞中，所述载体细胞包括但不限于非弯曲杆菌属细菌载体细胞。在多种非限制性实施方案中，细菌载体细胞是选自减毒单核增生李斯特菌、减毒沙门氏菌属物种、减毒霍乱弧菌、减毒志贺氏菌属物种、减毒牛分支杆菌卡介苗、减毒小肠结肠炎耶尔森氏菌、减毒炭疽芽孢杆菌、戈登链球菌、乳杆菌属物种和葡萄球菌属物种的无毒力细菌细胞。在一个实施方案中，使用减毒沙门氏菌物种。在示例性实施方案中，可以使用的沙门氏菌包括但不限于肠道沙门氏菌菌株，其选自鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌特别地可用于接种目的，因为其基因组序列充分表征并且许多动物 研究证实其安全的医学用途。已经构建重组减毒沙门氏菌疫苗(RASV)以递送来自其他病原体的抗原以在接种的宿主中诱导针对这些病原体的免疫力；见，例如，Curtiss等人，Crit Rev Immunol.2010；30(3):255-70；2010；Qiu等人，J.Virological Methods 188:108；Strugnell等人，Infect.Immunol.1992,60:3994；Layton等人，Clinical and Vaccine Immunology march 2011,449-454；Al-Ojali等人，Microbial Pathogenesis 52:326(2012)；和Wyszyńska等人，(2004)。在一个实施方案中，RASV包含在pmi、fur和crp基因和US 8,133,493中的致弱突变。在另一个实施方案中，RASV包含US 8,133,493中公开的χ9992载体。在另一个实施方案中，RASV是可商业获得的那一种，如(Lohman Animal Health,US)。
免疫原性组合物可以通过任何合适途径施用，所述途径包括经口、(作为注射剂)肠胃外、通过吸入喷雾剂、鼻内、直肠、粘膜、局部途径，或通过经口灌胃或随意饲喂施用，例如，作为液体溶液剂或混悬剂在饮用水中，在含有常规可药用载体、佐剂和溶媒的剂量单位制剂中。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、椎管内、颅内、胸腔内、输注技术或腹内。也可以制备在注射或其他施用之前适于液体中溶液剂或液体中混悬剂的固态形式。也可以将组合物例如乳化或在脂质体中包囊化。
在受试者是非人类受试者如鸡、火鸡、鸟、羊、猪、牛、犬或猫时的一个示例性实施方案中，将免疫原性组合物经口或按粘膜方式施用，如通过将组合物与饮用水或食物混合，或混合用作喷雾剂，以在动物上方喷雾以便动物在梳理行为期间摄入免疫原性组合物。在其中受试者是人的示例性实施方案中，将免疫原性组合物经口或按粘膜方式施用。然而，任何合适的施用方法可以用于任何受试者。
免疫原性组合物以与剂型相容的方式并且以这种量和方式施用，从而根据本领域已知，该组合物将在预防和/或治疗上有效。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统的功能能力、所需的保护程度和其他因素。需要施用的有效成分的精确量可以取决于施用该免 疫原性组合物的个体的判断并且可以对每位个体是独特的，但是基于本文中的教导，这种决定处于本领域技术人员的能力范围内。在一个实施方案中，可以施用每个剂量约10⁶–10¹⁰个无毒力细菌细胞。在施用免疫原性蛋白的另一个实施方案中，合适的剂量范围可以例如是0.1μg/kg-100mg/kg体重；可选地，它可以是0.5μg/kg至50mg/kg；1μg/kg至25mg/kg，或5μg/kg至10mg/kg体重。
如确定为最适宜，免疫原性组合物可以按单剂量或多剂量施用，如一个双剂量方案，例如相隔2周至8周；或多次剂量方案或与其他疫苗组合。多剂量方案是这样一种方案，其中首次接种过程可以包括1至10个或更多个分立剂量，随后是以所需要的后续时间间隔施用的其他剂量以维持和/或强化免疫反应，例如，在1至4个月施用第二个剂量，并且如果需要，在几个月后施用后续剂量。
实施例1基于Cj0988c的免疫原性组合物
Cj0988c的DNA序列和蛋白质序列分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中提供。
鼠伤寒沙门氏菌载体χ9992：
所用的载体是鼠伤寒沙门氏菌载体χ9992(Curtiss等人，2009)，其含有8个突变，其中三个突变是致弱性的：pmi基因、fur基因和crp基因。
1)Δpmi-2426-消除在甘露糖不存下终止LPS-O抗原合成的磷酸甘露糖异构酶；
2)Δgmd-fcl-减少生物被膜形成并阻止辅助asdA突变体存活的结肠酸形成；
3)ΔasdA27-缺失编码对二氨基庚二酸(DAP)而言必需的酶的基因。菌株需要补充性DAP直至质粒引入。这些消除需要抗生素耐药性标记；
4)ΔP_fur77::TT araC P_BAD fur::TT araC P_BAD c2 ΔPcrp527::TTaraC P_BAD crp-仅在阿拉伯糖存在的情况下允许fur和crp基因表达， 产生pYA3493(图1)，一种在细胞分裂后显示减毒表型之前具有最大侵入性的菌株；
5)ΔrelA198::araCP_BADlaclTT-消除relA基因以使生长与蛋白质合成解偶联并且提供LacI阻遏蛋白的阿拉伯糖依赖性合成以造成受调节的重组蛋白体内合成延迟，和
6)ΔaraE25ΔaraBAD23-消除沙门氏菌代谢阿拉伯糖的能力。允许阿拉伯糖在不利用的情况下留在细胞质中。
载体质粒pYA3493含有asd基因以支持染色体性ΔasdA27突变并确保该质粒将不在体内丢失。该质粒还使表达产物与β-内酰胺酶信号序列融合以便蛋白质的周质分泌。最后，该质粒具有在P_trc中的强启动子(trp启动子-35区/lac启动子-10区)(图.1)。使用这个质粒不向沙门氏菌疫苗赋予抗生素耐药性。
我们用于扩增质粒连同插入的空肠弯曲杆菌基因的载体是大肠杆菌χ6212。这个菌株是Asd-允许扩增该质粒，随后将所述质粒提取并电穿孔至沙门氏菌χ9992中。
基因Cj0998c表达一种假定蛋白，所述假定蛋白是细菌外膜的部分。将基因Cj0998c单独克隆至质粒pYA3493中并且从沙门氏菌载体χ9992表达。
A.Cj0998c基因克隆至沙门氏菌载体中
作为载体使用的沙门氏菌菌株(χ9992)具有导致其减毒的三个不同突变。该菌株安全并有免疫原性并且在免疫时充当表型上野生型的菌株，但在定居宿主组织后变得减毒。该质粒含有asd基因，所述asd基因为使用不含DAP的培育含有质粒的菌株的培养基进行实验室区分提供标记。由于这个基因是载体在无DAP的情况下存活所需要的，所以在体内定居期间，质粒在载体中维持。将基因Cj0998c克隆至沙门氏菌χ9992中。基本上，设计针对每个基因的引物并使用PCR扩增基因。将每种基因产物插入质粒pYA3493(asd⁺)中，克隆至大肠杆菌 χ6212(asd^-)中并培养以便扩增。在培育后，将质粒从大肠杆菌菌株提取，克隆至鼠伤寒沙门氏菌载体中，并且将转化体涂布在无DAP的LB培养基上，在37℃在LB琼脂上培养，收获，并在-80℃冷冻贮藏。通过质粒提取和基因的序列分析，接着PCR和凝胶电泳，证实该基因存在于载体中。
B.体外培育沙门氏菌
将表达Cj0998c蛋白的沙门氏菌载体和沙门氏菌空载体在37℃伴随振摇在补充有0.1％葡萄糖、0.05％甘露糖和0.1％阿拉伯糖的Luria Bertani(LB)培养液中培育24小时。在温育后，将过夜培养物沉淀并重悬于PBS中至终浓度1x10¹⁰CFU/ml。
C.接种家禽
与未接种的对照禽的盲肠内空肠弯曲杆菌数相比时，用表达Cj0988c蛋白的沙门氏菌载体接种鸡2次降低禽中盲肠内空肠弯曲杆菌数平均2.5个对数CFU(几何平均数3.0个对数CFU)(表1)。在检查的31只禽中存在一个离群值1.00E+07(突出显示的细胞，表3)。Cornish X Rock鸡从McMurray Hatchery(IA)获得并随机分配至独立的组。对鸡筛查粪便的空肠弯曲杆菌和/或沙门氏菌存在。将鸡在第10日和第16日用1ml表达Cj0988蛋白的沙门氏菌载体(约10¹⁰CFU/ml)或沙门氏菌空载体经口接种，并且在第二次接种后10日用10⁵CFU/ml的空肠弯曲杆菌菌株NCTC11168攻击。在接种和攻击之前，使鸡禁食8小时。接种/攻击后1小时恢复供食。除了这段时间外，食物和水是可随意获得的。在攻击感染后10日对鸡进行尸体剖检。将盲肠内容物稀释10倍并直接铺种在改良Campy Cefex琼脂平板上，所述琼脂平板在10％CO₂微需氧条件温育48小时用于弯曲杆菌计数。
表1.接种试验1和2的空肠弯曲杆菌合并数据

表2.接种试验1–用表达基因Cj0998c的载体或仅沙门氏菌空载体(对照-EV)接种2次的10日龄鸡或未接种的对照

表3.接种试验2–用表达基因Cj0998c的载体(两个组)或仅沙门氏菌空载体(对照-EV)接种2次的10日龄鸡

实施例2.基于Cj0588和Cj0248的免疫原性组合物
1.Cj0588的DNA序列和蛋白质序列分别在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中提供。
2.Cj0248的DNA序列和蛋白质序列分别在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中提供。
3.空肠弯曲杆菌基因的突变
将基因Cj0588和Cj0248克隆并且通过在每个基因的中心插入氯霉素盒进行突变。基本上，针对每种基因设计两组引物以产生由基因的初始15个碱基和终末15个碱基及其相关侧翼区组成的片段。将这些片段克隆至自杀载体中并安置在氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因附近，从而该抗生素盒处于基因的初始区域和末端区域之间，占据每种基因约255个碱基。随后将含有CAT基因和每种基因的侧翼碱基的载体通过电穿孔引入空肠弯曲杆菌菌株M129(Cj0588)或菌株NCTC11168(Cj0248)中，并且通过双交换将突变转移至基因组中。在电穿孔后，将突变株铺种在含有氯霉素的Mueller Hinton琼脂上。随后通过PCR证实在选择性培养基上生长的菌落在染色体中含有处于正确方向的表达盒。随后收获菌落并贮存在-78℃。
4.Cj0588突变对肉鸡定居的影响。
对ΔCj0588突变体和M129空肠弯曲杆菌亲本菌株各自检验在家禽中的定居性状。实施4项独立研究。检测限是小于10个生物。在用M129::tlyA突变体接种的禽的定居方面存在显著减少，表明空肠弯曲杆菌Cj0588基因在家禽的定居中是重要的。
研究1：
获得鸡并如上圈养。在第12日，将鸡用1.0ml每毫升大约1.0x10⁵个活空肠弯曲杆菌M129和M129::tlyA突变体经口接种。在第22日对禽进行尸体剖检，并如上计数弯曲杆菌。在用M129::tlyA突变体接种的禽的定居方面存在显著减少。
表4.空肠弯曲杆菌亲本M129和M129::tlyA菌株对鸡的定居。