技术领域
本发明涉及一株高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，属于微生物领域。
背景技术
酱油是我国的传统发酵调味品，我国是酱油生产及出口大国。酱油是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用，经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。酱油中含有多种可溶性蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、醇类、酯类、有机酸以及丰富的维生素、无机盐等，营养价值十分丰富。
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)是发酵食品和酒精饮料生产过程中自然产生的副产物，具有致癌性和遗传毒性，能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险。氨基甲酸乙酯的存在，给酱油带来了安全隐患，将使我国的酱油出口行业面临新的考验，影响我国的酱油出口经济，从而降低我国传统发酵文化的影响力。近年来，我国的重大食品安全问题屡有发生，食品安全关系到消费者的身体健康和生命安全，关系到社会稳定和国家信誉，从严控制及消除发酵制品中氨基甲酸乙酯含量是食品安全发展的必然趋势。
在酱油生产前期，原料水解出大量精氨酸，这些精氨酸在一些乳酸菌和其他细菌的作用下，通过精氨酸脱亚氨基途径(Arginine deiminase pathway，简称ADI途径)被转化为瓜氨酸。有研究表明在高盐稀态酱油发酵过程中，氨基甲酸乙酯的前体物质是瓜氨酸和乙醇等。具体反应如下面的反应式所示：
酱油发酵是一个食品混菌发酵体系，生产上不允许使用基因工程菌或用基因工程手段改造生产菌株。因此寻找来源于酱醪微生物体系可降解精氨酸且不积累瓜氨酸的菌株，通过强化这一菌株来降低酱油中的EC和其前体瓜氨酸，可为建立消除食品混菌发酵体系中的有害微生物代谢物的方法提供研究基础和理论支持。
嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)是一种革兰氏阳性乳酸菌。主要存在于高盐或高糖环境中，存在于酱醪发酵中后期，是产生风味物质的主要微生物之一，可以应用于酱油行业。在前期研究中，发明人筛选得到的嗜盐四联球菌R23CCTCC NO:M2013480，拥有完整ADI途径，可以利用精氨酸且不积累瓜氨酸，是目前利用精氨酸与瓜氨酸能力最强的嗜盐四联球菌，但是其利用精氨酸和瓜氨酸的能力受精氨酸浓度、葡萄糖浓度及环境因素等影响较大。R23在3g/L以上精氨酸的环境中就表现为瓜氨酸积累，不能再消耗体系中的瓜氨酸，但在实际酱醪发酵环境中精氨酸浓度平均为5g/L，R23已不满足工业应用要求。
表1 嗜盐四联球菌R23及ATCC保藏嗜盐四联球菌利用精氨酸能力
注：ΔArg为精氨酸消耗量；ΔCit为瓜氨酸积累量；ΔOrn为鸟氨酸生成量
因此，筛选或者通过育种来获得精氨酸和瓜氨酸利用能力增强的菌株，以有效减少酱醪中的瓜氨酸含量，从而减少酱油中EC含量，并且提高酱油的风味，对于提高嗜盐四联球菌的工业应用性能以及发展酱油产业，控制或减少发酵体系中的EC含量，提高发酵食品的安全性具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一株在高盐和高精氨酸浓度下仍能高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，符合酱油生产环境要求，能有效降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量。
本发明提供了一株在高盐环境和高精氨酸环境下能够高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，本发明的嗜盐四联球菌L3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017250。
在本发明的一种实施方式中，诱变原始菌株为嗜盐四联球菌BBE R23。
本发明第二个目的是提供一种所述嗜盐四联球菌的培养方法，所述方法是将嗜盐四联球菌接种至含NaCl的MRS培养基中，于30℃培养4-6天。
本发明第三个目的是提供一种所述嗜盐四联球菌的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述嗜盐四联球菌应用于降低发酵食品中瓜氨酸的含量。
本发明第四个目的是提供所述嗜盐四联球菌在制备调味品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括降低酱油中氨基甲酸乙酯含量。
本发明的第五个目的是提供一种含有所述嗜盐四联球菌的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂能够用于发酵食品中。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂为固态菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂为液体菌剂。
本发明的有益效果
本发明的一株能高效利用环境中精氨酸和瓜氨酸的嗜盐四联球菌，耐盐，能在较高精氨酸浓度下消耗氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸，从而降低环境中的氨基甲酸乙酯含量，在提高嗜盐四联球菌的工业应用性能以及发展酱油产业，控制或减少发酵体系中的EC含量，提高发酵食品的安全性上有潜在应用价值。本发明的嗜盐四联球菌是通过诱变育种的方法获得，不采用基因工程菌或用基因工程手段改造生产菌株，符合食品行业要求，同时也提高了菌株效能。
生物材料保藏
嗜盐四联球菌L3H9Tetragenococcus halophilus L3H9，于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017250。
附图说明
图1嗜盐四联球菌L3H9在不同温度下利用精氨酸能力分析。
图2不同盐浓度下嗜盐四联球菌L3H9盐度耐受情况。
具体实施方式
氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，FeSO40.4g/L，柠檬酸三胺2g/L，CaCO30.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HPO42g/L，pH 5.5。根据检测需要添加相应氨基酸。
实施例1 嗜盐四联球菌的诱变育种
将嗜盐四联球菌R23接种至含100g/L NaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养至对数生长期，离心后弃上清，用PBS缓冲液(pH7.0)清洗菌体2～3次后，向离心管中加入5mLPBS缓冲液悬浮菌体，然后分别进行紫外诱变和等离子诱变。
(1)嗜盐四联球菌R23紫外诱变
①取5mL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的培养皿上，在紫外光下进行紫外诱变，诱变时间分别为。置于15w紫外灯下30cm处，分别照射处理：60s、90s、120s，每个处理重复3次，每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30min。
②将诱变后的菌悬液在黑暗中稀释至10-4、10-5倍，分别取0.1mL涂于平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。将涂匀的平板，置于30℃恒温培养箱中避光培养4d。
③计算存活率，得出诱变致死曲线。将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。致死率(％)＝100－(处理后每0.2mL菌落数/对照每0.2mL菌落数)×100。
④根据致死率，选择诱变时间为120s的处理条件下所得的突变株，进行高通量筛选。
(2)嗜盐四联球菌R23等离子诱变
①取10μL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用ARTP进行等离子诱变，在100W和10SLM的条件下诱变，诱变时间分别为3s、4s、5s。
②将诱变后的菌悬液转移至装有1mL生理盐水的无菌管中，然后将样品稀释至10-1～10-3三个浓度，取稀释液涂布于筛选培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养，每个处理重复三次。
③挑取菌落进行初筛(高通量筛选)。
从生长良好的平板上挑取单菌落转接入含100g/LNaCl的MRS培养基中，在30℃静置培养四天，取500μL至30％甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。
将保藏的所述嗜盐四联球菌在含100g/LNaCl的MRS固体培养基上划线培养，于30℃静置培养4天，挑取单菌落接入含100g/LNaCl的MRS液体培养基的深96孔板中，平行3组，30℃静置培养4天，8000rpm离心10min后去上清获得菌体，用盐酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)悬浮菌体。分别向3组深96孔板中加入3mL含0.5g/L瓜氨酸的3g/L精氨酸、3.5g/L精氨酸、4g/L精氨酸的氨基酸利用培养基，30℃静置培养5天后，利用二乙酰一肟—氨基硫脲比色法测定培养液中L-瓜氨酸含量，复筛获得优势突变株4株。
利用高效液相色谱的方法测定优势突变株培养体系中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸含量，与原始菌株比较，选择利用效率最高的突变株L3H9为目的菌株，观测到精氨酸瓜氨酸利用率大大增高，鸟氨酸大量积累，且精氨酸利用率大于瓜氨酸利用率，因此，在高盐和高精氨酸条件下所述嗜盐四联球菌L3H9能高效利用精氨酸且不积累瓜氨酸。
嗜盐四联球菌L3H9，已于2017年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017250。
实施例2 嗜盐四联球菌利用精氨酸、瓜氨酸能力分析
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌L3H9单菌落接种于含100g/LNaCl的MRS液体培养基中，30℃静置培养4天，8000rpm离心10min取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)悬浮菌体。
向5mL离心管中分别加入3mL含0.5g/L瓜氨酸和3g/L精氨酸、4g/L精氨酸、5g/L精氨酸的氨基酸利用培养基，接种300μL菌液，30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量，观测到精氨酸、瓜氨酸利用率大大增高，鸟氨酸大量积累，且精氨酸利用率大于瓜氨酸利用率，因此，在高盐和高精氨酸条件下这所述嗜盐四联球菌高效利用精氨酸并不积累瓜氨酸。具体数值如下：
表2 野生菌与突变株利用精氨酸、瓜氨酸能力比较
注：ΔArg为精氨酸消耗量；ΔCit为瓜氨酸消耗量；ΔOrn为鸟氨酸生成量
由表2结果可知，突变株L3H9在3g/L、4g/L、5g/L精氨酸环境中较原始菌株R23精氨酸利用能力分别提高60％、154％、249％，且在5g/L精氨酸的环境中仍能表现为降解瓜氨酸，可以适用于酱醪发酵中，避免瓜氨酸积累，有效减少了EC前体物质的生成。
实施例3 嗜盐四联球菌在不同温度下利用精氨酸能力分析
在酱油发酵的实际过程中，会有许多温度变化，因此考察了嗜盐四联球菌L3H9在不同温度下利用精氨酸的能力。
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌L3H9单菌落接种于100g/LNaCl的液体培养基中，30℃静置培养4天，8000rpm离心10min取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)悬浮菌体。
向5mL离心管中加入3mL含5g/L精氨酸和0.5g/L瓜氨酸的氨基酸利用培养基，接种300μL菌液，分别放至20℃、25℃和30℃静置培养5天后，用HPLC的方法检测培养基中精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量，具体结果如图1。由图1结果可知，在各低温情况下，突变株L3H9利用精氨酸能力与原始菌株R23相比均有提高，在20℃、25℃、30℃条件下利用精氨酸能力分别提高57.7％、47.8％、2.3％，更加适应各个温度条件，可以利用精氨酸且基本不积累瓜氨酸，更适合酱醪发酵体系。
实施例4 葡萄糖浓度对于突变株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影响
根据已有研究表明，ADI途径是细菌的一条辅助供能途径，因此细菌的ADI途径会受葡萄糖浓度的影响，因此考察了不同葡萄糖浓度对于嗜盐四联球菌突变株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影响。
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌L3H9单菌落接种于100g/LNaCl的液体培养基中，30℃静置培养4天，8000rpm离心10min取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)悬浮菌体。
在5mL离心管中分别加入含5g/L精氨酸和0.5g/L瓜氨酸，葡萄糖浓度分别为2g/L、3g/L、5g/L、7g/L的氨基酸利用培养基，接种300μL菌液，在30℃静置培养5天后，用HPLC的方法检测培养基中精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量，具体数值如下：
表3 葡萄糖浓度对野生菌与突变株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影响
注：ΔArg、ΔCit、ΔOrn为积累量
由表3结果可知，突变株L3H9在各葡萄糖浓度下利用精氨酸的能力相较于原菌株R23相比均有显著提高，在2g/L、3g/L、5g/L和7g/L葡萄糖环境中利用精氨酸能力较R23相比分别提高5.05g/L、5.62g/L、3.41g/L和1.22g/L，受葡萄糖浓度抑制作用影响更小，且在高糖浓度下仍能利用精氨酸且不积累瓜氨酸，更适合酱醪发酵体系。
实施例5 突变株L3H9耐盐性考察
在酱醪发酵过程中，环境表现为高盐胁迫，是否能耐高盐也关系到嗜盐四联球菌在酱醪发酵中的应用能力，因此考察了突变株L3H9与原始菌株R23在不同盐浓度下的生长情况，具体做法如下：
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌L3H9和R23单菌落分别接种于含100g/L、180g/L、220g/L、250g/LNaCl的MRS液体培养基中，30℃静置培养，在生长过程中记录其在600nm下的吸光值(OD600)，最终获得突变株L3H9与原菌株R23在各盐浓度下的最大OD600值，具体数据如图2。由图2结果可知，突变株L3H9与原始菌株R23相比，在NaCl浓度为180g/L和220g/L时，耐受能力基本相同；在最适生长条件NaCl浓度100g/L和高盐浓度250g/L时，突变株L3H9耐受能力较R23分别提高6.5％和20.9％，在高盐条件下生长能力更强，更适宜于酱醪发酵体系。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。