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1、(10)申请公布号 CN 103555642 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555642 A (21)申请号 201310309931.5 (22)申请日 2013.10.12 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 9/06(2006.01) C12P 7/50(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学国家重点实验室 (72)发明人 刘立明 牛盼清 董晓翔 (54) 发明名称 一株产 L- 氨基酸氧化酶的重组菌株的。
2、构建 方法及其应用 (57) 摘要 本发明阐述了一株产 L- 氨基酸氧化酶的重 组菌株的构建方法及其应用， 属于基因工程与 酶学品领域， 将重组产生的 L- 氨基酸氧化酶包 涵体进行蛋白变性、 复性和浓缩， 使蛋白包涵体 恢复活性 ; 蛋白表达量最佳诱导条件为 37， IPTG0.5mmol/L 诱导 5h ； 通过对重组酶的酶学性 质研究， 发现重组酶最适 pH8.0， 最适温度 45， 外源添加 FAD 对酶活力没有影响 ； 结合酶学特征， 将重组酶添加到含有 10g/L 的谷氨酸钠 pH8.0 的 缓冲液中， 45转化6h可以生成5.3g/L的-酮 戊二酸， 转化率达到 50以上。 (5。
3、1)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103555642 A CN 103555642 A 1/1 页 2 1. 一株产 L- 氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法， 其特征如下 ： 1) 将 L- 氨基酸氧化酶基因与质粒 pET28a 重组构建重组质粒， 表达于 E.coli BL21 中 构建一株重组菌株， 具有产生 L- 谷氨酸氧化酶能力 ; 2) 该菌株蛋白表达量经过优化最佳条件为温度 30-37， 添加 IPTG0.3-0.5mmol。
4、/L 诱 导 4-6h， 目的蛋白含量达到总蛋白 20以上 ； 3) 该菌株生产的 L- 氨基酸氧化酶是包涵体， 没有活性。 2.根据权利要求1所述重组菌株产生的L-氨基酸氧化酶包涵体， 经过蛋白变性， 复性， 浓缩， 使 30以上的蛋白包涵体恢复活性。 3. 根据权利要求 2 得到的具有活性的 L- 氨基酸氧化酶， 其酶学性质如下 ： 1) 最适 pH 范围为 7.0-9.0 ； 2) 最适温度为 35-45， 重组酶在 20-50放置 12h， 酶的比活力保持在 70以上 ； 3) 重组酶底最适底物为 L- 鸟氨酸其次是 L- 赖氨酸、 L- 丙氨酸， 该重组酶底物范围较 广 ； 4) 外。
5、源添加 FAD 对重组酶的活力没有影响。 4. 根据权利要求 1 和 2 得到的有活性的重组酶可以将 L- 谷氨酸和谷氨酸钠转化生成 - 酮戊二酸， 转化率大于 50， 转化条件 ： 底物谷氨酸钠浓度为 7.5-12.5g/L， pH7.0-9.0， 35-45转化 6-8h。 权 利 要 求 书 CN 103555642 A 2 1/3 页 3 一株产 L- 氨基酸氧化酶的重组菌株的构建方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程及酶学领域中一种生产 L- 氨基酸氧化酶的重组菌株及其构 建方法与应用。 背景技术 0002 L- 氨基酸氧化酶是一种黄素蛋白酶， 能立体特异性氧化 L- 。
6、氨基酸脱氨， 生成对应 的 - 酮酸、 氨和过氧化氢， 并伴随氧气的消耗。能被应用于 L- 氨基酸的定量分析、 DL- 氨 基酸的拆分和 - 酮酸的制备。近年来， 有文献报道了 L- 氨基酸氧化酶具有抗菌、 杀虫、 抗 病毒等生物活性， 还具有与血小板相互作用、 细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用， 其在生物医 药领域具有广阔的应用前景。 0003 研究发现 L- 氨基酸氧化酶广泛分布于蛇科动物中， 后来发现在细菌 Rhodococus opacus、 Pseudoalteromonas luteoviolacea、 Bacillus carotarum 及一些海洋微生物中， 不同物种来源的 L- 。
7、氨基酸氧化酶底物差异性较大， 有些作用于几种甚至十几种氨基酸， 有 些只作用于一种氨基酸， 等电点、 稳定性等理化性质不尽相同， 基因序列也有差异， 生理及 生物活性不一样， 结构也不尽相同。 0004 目前为止， 只有很少的 L- 氨基酸氧化酶异源表达的报道， 2003 年， 第一个 L- 氨基 酸氧化酶细菌异源表达系统被报道， 研究人员将浑浊红球菌 L- 氨基酸氧化酶基因序列克 隆到大肠杆菌中， 发现在大肠杆菌表达系统中获得了大量的包涵体。之后也有一些异源表 达的报道， 虽然 L- 氨基酸氧化酶的异源表达是一大挑战， 不过还是有成功潜力的， 利用生 物信息学方法仪器突变技术， 选择合适的表。
8、达载体与系统， 有望极大的提高 L- 氨基酸氧化 酶异源表达成功率。 0005 L- 氨基酸氧化酶催化 L- 氨基酸生成 - 酮酸的开发是值得关注的， 可以用 L- 氨 基酸氧化酶的高选择性来生产有较高生物医药价值的 - 酮酸， 酶法转化法具有操作简 单、 条件温和、 高选择性、 高效、 无毒、 无污染等优点。目前关于利用 L- 氨基酸氧化酶催化谷 氨酸生产 - 酮戊二酸的方法国内外尚无报道， 因此利用这种方法生产 - 酮戊二酸对环 境不会有太大影响， 具有很高的市场应用前景。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种重组生产 L- 氨基酸氧化酶菌株的构建方法， 及重组酶 的性质和应用。 0。
9、007 本发明的技术方案 ： 0008 1.将来自于Rhodococus opacus DSM43250菌株的L-氨基酸氧化酶基因(NCBI序 列号 ： AY053450.1)提取出来与表达载体pET28a(重组蛋白形成于胞内)连接， 导入E.coli BL21 中构建一株重组菌株。 0009 重组菌株构建方法 ： 1) 将 PCR 得到的 LAAO 目的基因与载体 pET28a 用 Nco I 和 HindIII 酶切 2h， 然后连接 10h， 用转入大肠杆菌 JM109 中验证。2) 将构建好的重组质粒转 说 明 书 CN 103555642 A 3 2/3 页 4 入表达菌株E.col。
10、i BL21中， 得到重组菌株， 转化方法包括化学转化法， 电转法， 冷冻法及结 合转化法， 并对构建好的菌株进行测序验证。 0010 2. 将构建好的重组菌株， 0.4mM IPTG 诱导表达 4-6h， 发现重组产生酶的是包涵体 没有活性， 蛋白大小为 58KDa， 蛋白经过复性， 有 30的蛋白恢复了活性， 蛋白电泳图谱如 图 1， 蛋白复性过程如图 2 所示。 0011 3. 蛋白包涵体有易纯化、 抵御胞内蛋白酶降解及减少杂质的优点， 因此通过不同 的诱导方法来提高诱导表达量， 发现最佳培养温度 37， OD600为 0.5-0.6 时添加 0.4mmol/ L 的 IPTG 诱导培养。
11、 5h， 此时目的蛋白表达量达到最大。 0012 4. 对复性得到的 L- 氨基酸氧化酶进行生物化学特性研究， 该酶最适 Ph8.0， pH7-pH9 之间活力保持在 90以上 ； 最适温度 45， 在 20-50下放置 12h， 酶活力在 80 以上 ； 重组酶底物特异性实验发现最适底物为 L- 鸟氨酸其次是 L- 半胱氨酸和 L- 丙氨酸， 外源添加 FAD 对该重组酶活性没有影响。 0013 5.将纯化获得的有活性的L-氨基酸氧化酶进行转化实验， 以10g/L谷氨酸钠为转 化底物， pH8.0 磷酸盐缓冲液中 45转化 6h， 可以得到 - 酮戊二酸 5.3g/L。 附图说明 0014 。
12、图 1 诱导表达的重组谷氨酸氧化酶蛋白电泳图谱。 0015 图 2 蛋白复性流程图。 0016 图 3 重组酶最适 pH 测定结果。 0017 图 4 重组酶最适温度测定结果。 0018 图 5 重组酶温度稳定性测定结果。 0019 图 6 不同底物浓度对重组酶转化测定结果。 具体实施方式 ： 0020 1. 重组菌株的构建 ： 0021 1) 用 引 物 1 ： 5 CATGCCATGGCATTGGCATTCACACGTAGATCTTT3 和 引 物 2 ： 5CCCAAGCTTGGGCTTCCTGGGCCACGC3将来自于Rhodococus opacus DSM43250的基因组进 行 。
13、PCR 扩增 ： 体系中加入 EX taq 酶， 95预处理 3min， 95解链 30s， 60退火 30s， 72延 伸 1.8min， 30 个循环 ; 0022 2)用限制性内切酶Nco I和HindIII将目的基因和表达载体pET28a37酶切2h ； 0023 3) 用 T4 连接酶将酶切后的目的基因和质粒 pET28a16连接 10h 用化学转化法转 入表达菌株 E.coli BL21 中， 并涂布于含卡纳青霉素的 LB 平板中培养 12h ； 0024 4) 将平板中长出的菌落进行 PCR 及酶切验证， 将含有目的基因的质粒进行测序验 证， 选出目的基因完全正确的一株菌株 ； 。
14、将菌株接种于含有相应抗生素的 LB 培养基中 37 诱导5h， 进行蛋白电泳， 发现目的条带大小在58KDa如图1所示， 并形成的是包涵体， 没有活 性。 0025 2. 包涵体的复性 ： 0026 将构建好的重组菌株接种于 LB 培养基中， OD600为 0.5-0.6 之间时， 加入 0.4mmol/ L IPTG37诱导 5h， 收集菌体超声破碎 30min ； 破碎后的细胞 8000rpm 离心 30min， 沉淀用 说 明 书 CN 103555642 A 4 3/3 页 5 缓冲液 20mM Tris-HCl， 2M urea， 2mM EDTA， pH8.0 洗涤两次， 8000。
15、rpm 离心 30min 倒掉上清 液 ； 沉淀用缓冲液20mM Tris-HCl， 8M urea， 10uM FAD， 50mM DTT溶解， 4放置15h ； 8000rpm 离心 30min 取上清液用缓冲液 20mM Tris-HCl， 8M urea， 10uM FAD， 50mMDTT 稀释至蛋白浓 度小于 0.1mg/mL 后， 取 20mL 加入透析袋中， 用缓冲液 20mM Tris-HCl， 1M NaCl 于 4流速 0.4mL/min 逐步稀释 40h ； 将复性好的蛋白用超滤管浓缩至 1-1.5mL， 得到有活性的重组氨 基酸氧化酶。 0027 3. 蛋白表达量实验。
16、 0028 通过对诱导时间、 诱导温度和 IPTG 添加量进行优化， 发现最佳诱导条件为 ： IPTG0.5mmol/L、 温度 37诱导 5h， 目的蛋白表达量为 1.36mg/mL， 占到菌体总蛋白 23。 0029 0030 0031 0032 4. 酶学性质研究 0033 对复性得到的 L- 氨基酸氧化酶进行生物化学特性研究， 如图 3 所示该酶最适 Ph8.0， pH7-pH9 之间酶活力保持在 90以上 ； 如图 4 所示最适温度 45， 如图 5 所示在 20-50下放置12h， 酶活力在70以上 ； 重组酶底物特异性实验发现最适底物为L-鸟氨酸 其次是 L- 赖氨酸和 L- 丙。
17、氨酸， 外源添加 FAD 对该重组酶活性没有影响。 0034 0035 5. 转化谷氨酸钠生产 - 酮戊二酸 0036 将复性后的重组酶加入到含有不同浓度的谷氨酸钠 pH8.0 缓冲液中， 45转化 6h， 结果如图 6 所示， 谷氨酸钠浓度小于 10g/L 时， - 酮戊二酸产量随着底物浓度的增大 而增加， 谷氨酸钠浓度为 10g/L 时， - 酮戊二酸产量达到最大值 5.3g/L， 谷氨酸钠浓度大 于 10g/L 时， - 酮戊二酸产量不再增加。 说 明 书 CN 103555642 A 5 1/3 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103555642 A 6 2/3 页 7 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103555642 A 7 3/3 页 8 图 6 说 明 书 附 图 CN 103555642 A 8 。