技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言本发明涉及生物标志物，尤其是涉及一种血清miRNA生物标志物及其在肺癌检测中的应用。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，60-70％的患者在初诊时已为晚期，5年生存率仅为16.1％，而Ⅰ期肺癌治疗后的5年生存率可达82％，故早期筛查是提高肺癌生存率的重要手段。目前常用的肺癌筛查手段为低剂量螺旋CT，但该技术也存在明显缺陷：(1)筛查的假阳性率高(特别是5-10mm的纯肺内磨玻璃密度影)且随访筛查时间长，增加了医疗费用及辐射诱发癌变的风险。(2)导致过度的创伤性活检及手术介入。
miRNA是一类长度约为20～24个核苷酸的非编码单链小RNA，广泛存在于动植物和病毒中，通过miRNA剪切和抑制蛋白翻译的方式调控靶基因，参与多种生物学信号通路的调节。研究表明，超过半数的miRNA在基因组上定位于与肿瘤发生相关的区域和脆性位点，与肿瘤的诊断、分期、预后等密切相关。
目前为止还没有特异度和灵敏度好的miRNA适合用来做肺癌检测标志物，特别是血清标志物，更缺乏相关证据。而且，由于血清中miRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的适于肺癌检测的方法是目前血清miRNA应用于临床检测亟待解决的问题，实时荧光定量PCR是目前检测血清miRNA的主要方法，该方法快速、便捷，精确度和灵敏度可满足临床需求。
综上所述，本领域仍然需要一种快速、灵敏、操作简便、成本低廉的肺癌检测方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种miRNA生物标志物、组合物及其用途。
本发明第一方面提供一种miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物包含一个或多个选自以下的序列：
miRNA-7：UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU；
miRNA-17：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG；
miRNA-21：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
miRNA-126：CAUUAUUACUUUUGGUACGCG；
miRNA-145：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC；
miRNA-146a：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；
miRNA-155：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU；
miRNA-182：UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU；
miRNA-200b：CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA；
miRNA-205：UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG；
miRNA-210：CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA；
miRNA-221：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC。
一个优选实施方式中，所述miRNA生物标志物为血清miRNA生物标志物。
本发明第二方面提供本发明第一方面的miRNA生物标志物在制备用于检测和/或诊断肺癌的试剂中的应用。
一个优选实施方式中，所述试剂是试剂盒的形式。
另一个优选实施方式中，所述检测试剂还包含Cel-miRNA-39作为内参miRNA。
本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物包含miRNA生物标志物以及各miRNA对应的正向引物和反向引物的序列，
其中，所述miRNA生物标志物包含一个或多个选自以下的序列：
miRNA-7：UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU；
miRNA-17：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG；
miRNA-21：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
miRNA-126：CAUUAUUACUUUUGGUACGCG；
miRNA-145：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC；
miRNA-146a：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；
miRNA-155：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU；
miRNA-182：UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU；
miRNA-200b：CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA；
miRNA-205：UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG；
miRNA-210：CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA；
miRNA-221：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC；
并且其中，所述各miRNA对应的正向引物和反向引物的序列选自下组：
其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T。
一个优选实施方式中，所述miRNA生物标志物为血清miRNA生物标志物，并且所述组合物还包含Cel-miRNA-39作为内参miRNA和/或包含Cel-miRNA-39对应的正向引物序列TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG(Seq ID No.:13)和反向引物序列ACGACTCACTATAGGGCGAGCACAGAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN(Seq ID No.:14，其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T)。
本发明第四方面提供本发明第三方面的组合物在制备用于检测和/或诊断肺癌的试剂中的用途。
一个优选实施方式中，所述试剂是试剂盒的形式。
本发明第五方面提供一种用于检测和/或诊断肺癌的引物组合物，该引物组合物包含一个或多个选自以下的引物：
其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T。
一个优选实施方式中，所述引物组合物还包含作为内参miRNA的Cel-miRNA-39的检测引物，所述检测引物选自正向引物TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG(Seq ID No.:13)和反向引物ACGACTCACTATAGGGCGAGCACAGAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN(Seq ID No.:14，其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T)。
另一个优选实施方式中，所述引物组合物中的引物为荧光定量检测引物，例如荧光定量PCR检测引物。
本发明具有以下有益效果：
首先，血清相对组织样本较易获得，与穿刺相比，来源方便性能稳定，且属于无创(或微创)，减轻了患者的痛苦及穿刺导致的并发症的风险，同时解决了传统穿刺无法取材情况下的取材问题。
其次，本发明确定的miRNA组合与肺癌发生的密切相关，能够作为生物标志物对肺癌进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。
最后，通过实时荧光定量PCR技术对肺癌病人的血清水平miRNA的检测，定量准确，方便可靠。
本发明确定的miRNA组合与肺癌发生密切相关，能够作为生物标志物对肺癌病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。为今后肺癌血清miRNA的研究提供了理论依据，并为肺癌的分子诊断提供了新思路，具有一定的理论意义和潜在的实用价值。
具体实施方式
miRNA在血清中可长期稳定存在，因此血液中肿瘤特异性miRNA可作为肿瘤特异性标志物。分析血液中肺癌特异miRNA的表达，利用miRNA作为分子标志物进行肺癌早期筛查、诊断及疗效预测等，有助于为肺癌的诊断、治疗提供新的途径，为肺癌的预防和早诊早治提供有力的理论和实践依据。
本发明一方面提供一种miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物包含一个或多个选自以下的序列：
miRNA-7：UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU；
miRNA-17：CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG；
miRNA-21：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
miRNA-126：CAUUAUUACUUUUGGUACGCG；
miRNA-145：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC；
miRNA-146a：UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；
miRNA-155：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU；
miRNA-182：UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU；
miRNA-200b：CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA；
miRNA-205：UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG；
miRNA-210：CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA；
miRNA-221：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC。
一个优选实施方式中，所述miRNA生物标志物获得自血清。
上述各miRNA对应的正向引物和反向引物的序列如下所示：
其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T。
本发明的一种或多种miRNA生物标志物和/或其对应的引物可用于检测和/或诊断肺癌，也可用于制备用于检测肺癌的试剂，诸如用于检测的试剂盒例如诊断试剂盒。此类试剂诸如试剂盒中一般还包含内参miRNA，例如可用Cel-miRNA-39作为内参miRNA，Cel-miRNA-39的序列为UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG，其对应的正向引物TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG(Seq ID No.:13)，反向引物ACGACTCACTATAGGGCGAGCACAGAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN(Seq ID No.:14，其中V是A、G、或C，N是A、G、C、或T)。
例如，可以使用本发明所述miRNA生物标志物序列中的一种、两种、三种、四种或更多种和/或它们对应的引物，或者单独用这些miRNA生物标志物对应的正向和/或反向引物，来检测或诊断肺癌，或用于制备检测或诊断肺癌的试剂。
因此，本发明其他方面还提供一种组合物，所述组合物包含miRNA生物标志物以及各miRNA对应的正向引物和反向引物的序列。本发明另外还提供一种引物组合物，该引物组合物包含本说明书所述引物的一种或多种，所述引物组合物可用于检测和/或诊断肺癌。在另外的方面，本发明还提供根据本发明的miRNA生物标志物、根据本发明的组合物、根据本发明的引物组合物在制备用于检测和/或诊断肺癌的试剂(例如试剂盒)中的应用。
在本发明上下文中，术语“肺癌”包括所有形式的肺癌，包括但不限于小细胞肺癌、非小小肺癌，诸如肺腺癌、鳞状上皮细胞癌、支气管肺泡细胞癌等。
本发明中所用的所有科学和技术术语，除非另有说明，具有本领域技术人员通常理解的含义。具体实验操作诸如测序等，除非具体说明，均采用本领域技术人员所知的常规操作技术和程序。
用本发明中所述检测或诊断肺癌的试剂来检测或诊断肺癌的步骤如下：
1)血清样本采集和临床分组：从医院采集血清样本，同时系统收集患者的病理学资料；
2)从受试样本血清中提取总RNA，并加入内参cel-miRNA-39；
3)用PolyA聚合酶给各miRNA加PolyA尾；
4)采用实时荧光定量PCR方法检测可用作检测标志物的miRNA及内参cel-miRNA-39。
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例
实施例一 血清miRNA标志物的鉴定
(1)样品收集
收集10例肺癌患者及4例健康人(正常对照)的血清；
(2)RNA的提取：
采用Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit快速提取试剂盒进行RNA提取。每份样本使用200微升血浆上样，最后洗脱体积为50微升。提取RNA样品后通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样品质量，比值在1.8～2.0之间的可获得最优反应结果。
(3)PolyA加尾：
取10μl提取好的RNA样品，加入1x108个拷贝cel-miRNA-39,加入4ul 5×PAP缓冲液，加入2-5U的PolyA聚合酶(Life公司，74225Y/Z)，用去RNA酶水补足到25μl。37℃孵育10-20分钟，然后65℃孵育10分钟。
(4)反转录反应：
取10μl的加PolyA后的产物，加入2μl的RT缓冲液、2μldNTPs(各5mM)、20μM的反向引物，4U的Omniscript(Qiagen公司，Cat No.205111)，用去RNA酶水补足到20μl。37℃，1h；85℃，5min；4℃冷藏待用。
(5)荧光定量PCR反应：
取1μl反转录产物，10μl 2×SYBR Green Mix(Qiagen，Cat No.208054)、10μM正向引物、10μM反向引物，最后加入适量的H2O使得PCR反应的反应总体积为20μl。扩增程序为：1)95℃，2min；2)95℃，5s；3)60℃，10s；重复第2)步到第3)步40个循环。
(6)各miRNA表达量的计算
根据内参miRNA的量对各miRNA进行校正，比较各miRNA在肺癌病人与正常人群中的表达量差异，以表达差异不小于3倍为阳性，小于3倍以内为阴性。
实施例2 血清miRNA标志物对肺癌的检出率结果
将各血清miRNA标志物(如上所述表达差异不小于3倍为阳性，小于3倍以内为阴性)检测结果与依据我国卫生部编写的《中国常见恶性肿瘤诊治规范·第六分册·原发性支气管肺癌》中用于诊断肺癌的金标准-病理诊断结果相比较，计算肺癌检测的敏感度和特异度。
1.计算和统计方法
计算方法如下：
统计分析如下：
(1)敏感度：A/(A+C)
(2)特异度：D/(B+D)
2.各miRNA检测结果
1)miRNA-7：
灵敏度：80％
特异度：100％
2)miRNA-17：
灵敏度：70％
特异度：100％
3)miRNA-21：
灵敏度：50％
特异度：100％
4)miRNA-126：
灵敏度：70％
特异度：100％
5)miRNA-145：
灵敏度：60％
特异度：100％
6)miRNA-146a：
灵敏度：80％
特异度：100％
7)miRNA-155：
灵敏度：90％
特异度：50％
8)miRNA-182：
灵敏度：60％
特异度：100％
9)miRNA-200b：
灵敏度：80％
特异度：75％
10)miRNA-205：
灵敏度：50％
特异度：75％
11)miRNA-210：
灵敏度：80％
特异度：100％
12)miRNA-221：
灵敏度：70％
特异度：75％
从以上结果可见，本发明中所述血清miRNA标志物与肺癌发生密切相关，可以用来作为肺癌检测的标志物，为肺癌诊断和干扰治疗提供有效依据。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。
。
序列表
<110> 上海立迪生物技术股份有限公司
<120> 一种miRNA生物标志物、组合物及其用途
<130> 20170322
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggaagacta gtgattttgt tgt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaagtgctt acagtgcagg tag 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cattattact tttggtacgc g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtccagtttt cccaggaatc cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgagaactga attccatggg tt 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttaatgctaa tcgtgatagg ggt 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tttggcaatg gtagaactca cact 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catcttactg ggcagcattg ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tccttcattc caccggagtc tg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctgtgcgtgt gacagcggct ga 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agctacattg tctgctgggt ttc 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcaccgggtg taaatcagct tg 22
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc-feature
<222> (48)..(49)
<223> v=a、g、或c，n=a、g、c、或t
<400> 14
acgactcact atagggcgag cacagaatta attttttttt ttttttt vn 49