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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510423414.X (22)申请日 2015.07.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105039439 A (43)申请公布日 2015.11.11 (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学 府大道999号 (72)发明人 刘晓华李海星 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (51)Int.Cl. C12P 7/64(2006.01) C12R 1/245(2006.01。
2、) 审查员 贾麒 (54)发明名称 包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油 酸异构体的方法 (57)摘要 包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油 酸异构体的方法， 包括以下步骤：（1） 将每克干酪 乳杆菌CGMCC1.574菌体重悬于5mL透性化处理 液中， 37处理20min， 离心收集透性化菌体；（2） 用50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后， 离心收集 菌体， 将每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液中， 加入菌悬液体积0.5- 2.0%的吐温-20混合均匀， 4-40处理2-6h， 离心 收集菌体， 冷冻干燥后得到包衣菌体；（3） 将每克 包衣菌体加入到6。
3、00mL正己烷中， 搅拌均匀， 加入 正己烷体积0.1-0.3%的亚油酸， 4-40下反应1- 12h；（4） 离心分离包衣菌体， 回收正己烷， 产物为 c9,t11-共轭亚油酸异构体。 本发明反应时间短， 包衣菌体可重复使用多次， 产量得到了显著提 高， 无环境污染， 显著降低生产成本。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105039439 B 2018.06.08 CN 105039439 B 1.包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是包括以下步 骤： （1） 收集处于对数生长期的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌体， 。
4、按 每克湿菌体重悬于5mL透性化处理液中计， 将湿菌体重悬于透性化处理液中， 重悬菌体经37 处理20min， 离心收集透性化菌体； （2） 透性化菌体用50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后， 离心收集菌体， 按每克湿菌体重 悬于20mL 50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液中计， 将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中， 加入 菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-20混合均匀， 于4-40处理2-6h， 离心收集菌体， 将菌 体冷冻干燥后得到包衣菌体； （3） 按每克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中计， 将包衣菌体加入到正己烷中， 搅拌 均匀， 加入正己烷体积百分比0.1-0.3%。
5、的亚油酸， 在4-40下反应1-12h； （4） 离心分离包衣菌体， 将正己烷溶液进行减压蒸馏， 回收正己烷， 产物为c9,t11-共轭 亚油酸异构体； 步骤 （1） 所述的透性化处理液为体积百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100， 5-50 M的亚油 酸， 20-200mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液。 2.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是所述的步骤 （1） 中透性化处理液为体积百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100， 15-35 M 的亚油酸， 30-100mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液。 3.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中。
6、生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是所述的步骤 （2） 中吐温-20的加入量为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。 4.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是所述的步骤 （2） 中处理温度为4-25。 5.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是所述的步骤 （2） 中处理时间为3-5h。 6.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法， 其特征是所述的步骤 （3） 中加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的亚油酸， 在15-30下反 应2-6h。 权利要求书 1/1 页。
7、 2 CN 105039439 B 2 包衣菌体在有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 共轭亚油酸(conjugated linoleic acid， CLA) 是一组十八碳共轭二烯酸的统 称， 共轭双键有4种位置异构 （8,10; 9,11; 10,12; 11,13） 和4种几何异构 （cis,cis; cis, trans; trans,cis; trans,trans） ， 共有多达16种异构体， 如：c9,t11-CLA和t10,c12-CLA 异构体等。 研究发现CLA具有抗癌、 预防动脉粥样硬化、 增强机体。
8、免疫力、 抗糖尿病等生理功 能， 且越来越多的研究表明其生理活性具有异构体特异性， 现在普遍认为c9,t11-CLA异构 体具有抗癌和预防动脉粥样硬化的作用。 在自然界中， CLA主要存在于反刍动物的奶和肉中 的脂肪中， 主要由c9,t11-CLA和少量t9,t11-CLA，t10,c11-CLA等异构体构成， 但其含量通 常都小于10mg/g脂肪， 无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。 0003 为实现CLA异构体的大量制备， 人们已对微生物发酵制备CLA进行了较多研究。 目 前， 微生物发酵均在水溶液中进行， 由于所加的发酵底物亚油酸是脂溶性物质， 因此亚油 酸加入发酵液前需经乳化处理，。
9、 且添加量受到限制， 从发酵液中获得CLA产物需经有机溶剂 萃取 ， 整 个 生 产工 艺 存 在发 酵 周期长 、 生 产成 本高 、 产量 低的 缺 点 。 发明 专 利 CN201110105610提出了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法， 底物添加量为25mg/ mL， 发酵时间长达120h， CLA的产量只有1.02mg/mL， 底物的转化率只有4%。 发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提出一种包衣菌体在有机介质中生物合成 共轭亚油酸异构体的方法， 显著缩短合成时间、 提高产量和转化率、 降低生产成本。 0005 本发明包括以下步骤。 0006 （1） 菌体。
10、的透性化处理： 收集处于对数生长期的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌体， 按每克湿菌体重悬于5mL透性化处理液中计， 将湿菌体重悬于透 性化处理液中 （所述的透性化处理液为体积百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100， 5-50 M的亚油 酸， 20-200mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液） ， 重悬菌体经37处理20min， 离心收集透性化菌体。 0007 （2） 菌体包衣处理： 透性化菌体用50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后， 离心收集菌 体， 按每克湿菌体重悬于20mL50mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液中计， 将透性化湿菌体重悬于。
11、磷 酸盐缓冲液中， 加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-20混合均匀， 于4-40处理2-6h， 离心收集菌体， 将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。 0008 （3） 有机介质中生物合成： 按每克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中计， 将包衣 菌体加入到正己烷中， 搅拌均匀， 加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的亚油酸， 在4-40下反 应1-12h。 0009 （4） 产物收集： 离心分离包衣菌体， 将正己烷溶液进行减压蒸馏， 回收正己烷， 产物 为c9,t11-共轭亚油酸异构体。 说明书 1/4 页 3 CN 105039439 B 3 0010 本发明所述的步骤 （1） 中透性化。
12、处理液优选为体积百分比1.0-2.0%的曲拉通X- 100， 15-35 M的亚油酸， 30-100mM、 pH5.8的磷酸盐缓冲液。 0011 本发明所述的步骤 （2） 中吐温-20的加入量优选为菌悬液体积百分比的0.75- 1.5%。 0012 本发明所述的步骤 （2） 中处理温度优选为4-25。 0013 本发明所述的步骤 （2） 中处理时间优选为3-5h。 0014 本发明所述的步骤 （3） 中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的亚油酸， 在 15-30下反应2-6h。 0015 本发明所述的步骤 （4） 中包衣菌体可重复用于有机介质中生物合成c9,t11-共轭 亚油酸异构。
13、体。 0016 本发明所用的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574， 系中国普通微生 物菌种保藏管理中心 （CGMCC） 保藏菌株， 编号为1.574， 该菌株能产生特异性的亚油酸异构 酶， 通过生物异构化可将亚油酸转化成c9,t11-CLA异构体。 目前， 还没有分离到有确切催化 活性的亚油酸异构酶纯品。 因此， 该异构化反应可能是由多酶体系共同催化完成。 0017 通过该包衣菌体在有机介质中生物合成方法， 在优化条件下， 含体积百分比0.15% 亚油酸的正己烷溶液反应后所合成c9,t11-CLA异构体的含量为体积百分比0.1395%， 亚油 酸的转化。
14、率为93.0%。 本发明所述的步骤 （4） 中包衣菌体可重复用于步骤 （3） 的有机介质中 生物合成c9,t11-CLA异构体， 包衣菌体重复使用五次后， 其催化活性仍大于90%。 0018 针对现有微生物发酵合成CLA均在水溶液中进行， 整个生产工艺存在发酵周期长， 从发酵液中提取CLA产物困难， 菌体不能重复使用， 生产成本高， 产量低等诸多缺点。 本发明 提出了通过微生物菌体在有机介质中将亚油酸催化合成c9,t11-CLA的新方法。 该方法首先 通过曲拉通X-100处理干酪乳杆菌CGMCC 1.574， 在保持菌体完整性的同时， 提高菌体细胞 壁和细胞膜的通透性， 一方面可以确保在后续包。
15、衣处理时细胞内的亚油酸异构酶表面能形 成完整包衣层， 另一方面可以提高反应底物亚油酸和产物CLA进出菌体的速率， 减少高浓度 底物和产物对催化反应的抑制作用， 大大缩短反应时间。 0019 本发明在透性化处理菌体时， 加入5-50 M的亚油酸， 亚油酸可以和菌体中亚油酸 异构酶催化活性中心结合， 在菌体包衣处理时， 能在酶的催化活性中心形成分子印迹， 使菌 体在冷冻干燥后酶的催化活性中心构象不变， 能在有机介质中保持较高的催化活性。 同时， 本发明结合在菌体包衣处理过程中选用合适的磷酸盐缓冲液、 吐温-20浓度和包衣温度、 时 间， 使所得包衣菌体在有机介质中仍具有较高的催化能力。 包衣后菌体。
16、中酶的热稳定性提 高， 每批次反应时间仅需4h， 远小于传统水溶液中批次发酵所需的数天时间。 0020 本发明所得包衣菌体在正己烷中有较高催化活性， 只需离心分离包衣菌体， 将正 己烷溶液进行减压蒸馏， 回收正己烷， 即可得到产物c9,t11-CLA。 离心所得包衣菌体可多次 重复用于有机介质中生物合成c9,t11-CLA异构体， 显著缩短了生产时间， 提高了产量， 降低 了生产成本。 此外， 正己烷是食用油脂工业常用的有机溶剂， 这也保证了本发明所得c9, t11-CLA的使用安全性。 0021 本发明与现有技术相比具有如下优点。 0022 本发明直接对菌体进行包衣处理， 作为固定化酶用于催。
17、化反应， 一方面减少了酶 分离纯化的成本， 避免了酶在提取时活性的损失； 另一方面可以将多酶体系包在一起， 使整 说明书 2/4 页 4 CN 105039439 B 4 个反应过程得以顺利进行； 再者包衣菌体颗粒大于包衣酶， 易于从反应溶液中分离出来， 且 过滤阻力较小， 因此， 包衣菌体更加适合用于连续反应的柱式反应器。 0023 本发明通过包衣菌体在有机介质中进行催化反应， 避免了在传统水溶液反应体系 中底物亚油酸溶解度低和产物CLA提取困难的问题。 包衣菌体中酶的热稳定性提高， 每批次 反应时间仅需4h， 远小于传统水溶液中发酵所需的数天时间。 包衣菌体可重复使用多次， 显 著提高产品。
18、产量， 且无环境污染， 可显著降低生产成本； 而传统水溶液体系发酵液中的菌体 只能使用一次， 生产成本高， 且发酵废液处理费用高， 易污染环境。 具体实施方式 0024 本发明通过以下实施例作进一步地说明。 0025 实施例1。 0026 将活化的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基 中， 于30下培养20h， 5000g离心10min收集菌体， 将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比 1.5%的曲拉通X-100、 25 M的亚油酸和50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 的透性化处理液中， 37 水浴处理20min， 5000g。
19、离心10min得到透性化菌体。 0027 透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 洗涤后， 6000g离心10min收集菌体， 将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 中， 加入2 mL吐温-20并混合均匀， 于4 搅拌处理4h， 6000g离心10min收集菌体， 菌体经-80预冻后进行冷冻干燥， 得到包衣菌体。 0028 将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中， 搅拌均匀， 加入0.9mL亚油酸， 在25 下搅拌反应4h。 6000g离心分离包衣菌体， 将正己烷溶液在40进行减压蒸馏， 回收正己烷， 得到0.9mL产物， 其中c9,t11-CLA。
20、的含量为93.0%。 将收集到的包衣菌体重复用于上述合成 反应， 连续使用五次时产物中c9,t11-CLA的含量为90.5%。 0029 实施例2。 0030 将活化的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基 中， 于30下培养18h， 4000g离心5min收集菌体， 将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比 3.0%的曲拉通X-100、 5 M的亚油酸和200mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 的透性化处理液中， 37 水浴处理20min， 4000g离心10min得到透性化菌体。 0031 透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液。
21、 （pH5.8） 洗涤后， 5000g离心10min收集菌体， 将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 中， 加入4mL吐温-20并混合均匀， 于4搅 拌处理2h， 5000g离心10min收集菌体， 菌体经-80预冻后进行冷冻干燥， 得到包衣菌体。 0032 将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中， 搅拌均匀， 加入1.8mL亚油酸， 在40 下搅拌反应12h。 6000g离心分离包衣菌体， 将正己烷溶液在40进行减压蒸馏， 回收正己 烷， 得到1.8mL产物， 其中c9,t11-CLA的含量为81.2%。 将收集到的包衣菌体重复用于上述合 成反应， 连续使用五次时。
22、产物中c9,t11-CLA的含量为71.3%。 0033 实施例3。 0034 将活化的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基 中， 于30下培养18h， 4000g离心5min收集菌体， 将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比 0.5%的曲拉通X-100、 50 M的亚油酸和20mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 的透性化处理液中， 37 水浴处理20min， 4000g离心10min得到透性化菌体。 说明书 3/4 页 5 CN 105039439 B 5 0035 透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 洗涤。
23、后， 5000g离心10min收集菌体， 将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 中， 加入1mL吐温-20并混合均匀， 于4搅 拌处理6h， 5000g离心10min收集菌体， 菌体经-80预冻后进行冷冻干燥， 得到包衣菌体。 0036 将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中， 搅拌均匀， 加0.6mL亚油酸， 在4下搅 拌反应6h。 6000g离心分离包衣菌体， 将正己烷溶液在40进行减压蒸馏， 回收正己烷， 得到 0.6mL产物， 其中c9,t11-CLA的含量为90.9%。 将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应， 连续使用五次时产物中c9,t11-CLA的含。
24、量为86.3%。 0037 实施例4。 0038 将活化的干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei） CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基 中， 于30下培养20h， 5000g离心10min收集菌体， 将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比 1.5%的曲拉通X-100、 25 M的亚油酸和50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 的透性化处理液中， 37 水浴处理20min， 5000g离心10min得到透性化菌体。 0039 透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液 （pH5.8） 洗涤后， 6000g离心10min收集菌体， 将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液。
25、 （pH5.8） 中， 加入2 mL吐温-20并混合均匀， 于4 搅拌处理4h， 6000g离心10min收集菌体， 菌体经-80预冻后进行冷冻干燥， 得到包衣菌体。 0040 将1克冻干包衣菌体装入柱式生物反应器中， 将0.9mL亚油酸加入到300mL正己烷 中混匀， 通过泵将含亚油酸的正己烷溶液注入反应器， 流量为3mL/min， 收集流出液， 将流出 液重复注入反应器2次， 收集流出液， 在40进行减压蒸馏， 回收正己烷， 得到0.9mL产物， 其 中c9,t11-CLA的含量为91.5%。 通过将数个柱式生物反应器串联在一起， 可以实现连续生 产。 说明书 4/4 页 6 CN 105039439 B 6 。