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1、(10)授权公告号 CN 101333436 B (45)授权公告日 2011.03.16 CN 101333436 B *CN101333436B* (21)申请号 200810032009.5 (22)申请日 2008.08.06 C09K 11/02(2006.01) C09K 11/07(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 33/52(2006.01) (73)专利权人 湖南大学 地址 410082 湖南省长沙市河西岳麓山湖南 大学化学生物传感与计量学国家重点 实验室 (72)发明人 王柯敏 何晓晓 秦迪岚 谭蔚泓 (74)专利代理机构 湖南兆弘专利事务。
2、所 43008 代理人 赵洪 CN 1392097 A,2003.01.22, CN 1831082 A,2006.09.13, WO 2008084247 A1,2008.07.17, (54) 发明名称 多色光学编码硅壳纳米棒及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种多色光学编码硅壳纳米 棒， 该多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型结构， 其 外壳材料为二氧化硅， 内核材料为荧光编码的多 聚赖氨酸， 荧光编码的多聚赖氨酸含有荧光染料 A 和荧光染料 B， 荧光染料 A 和荧光染料 B 是荧光 共振能量转移供体 - 受体对。本发明还公开了一 种多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法， 它是将 荧光染。
3、料 A 和荧光染料 B 与多聚赖氨酸反应制备 荧光编码的多聚赖氨酸， 以荧光编码的多聚赖氨 酸为内核材料采用反向微乳液法将其包裹在二氧 化硅基质中制备成多色光学编码硅壳纳米棒。本 发明的多色光学编码硅壳纳米棒具有荧光强、 生 物相容性好、 亲水性好、 染料泄露少、 性质稳定等 优点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101333436 B1/2 页 2 1. 一种多色光学编码硅壳纳米棒， 其特征在于所述多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型 结构， 其外壳材料为二氧化。
4、硅， 内核材料为荧光编码的多聚赖氨酸， 荧光编码的多聚赖氨酸 含有荧光染料 A 和荧光染料 B， 荧光染料 A 和荧光染料 B 是荧光共振能量转移供体 - 受体 对 ； 所述荧光编码的多聚赖氨酸是荧光染料 A 和荧光染料 B 通过其各自所带有的活性基团 与多聚赖氨酸的胺基共价连接而成 ； 所述活性基团为异硫氰酸酯基或琥珀酰亚胺酯基 ； 所 述荧光共振能量转移供体 - 受体对为下述各荧光染料配对组合中的任意一种 ： 组合 1 ： 荧光染料 A 为荧光素异硫氰酸酯， 荧光染料 B 为四甲基罗丹明异硫氰酸酯 ； 组合 2 ： 荧光染料 A 为羧基荧光素琥珀酰亚胺酯， 荧光染料 B 为羧基罗丹明 6G。
5、 琥珀酰 亚胺酯 ； 组合 3 ： 荧光染料 A 为羧基罗丹明 6G 琥珀酰亚胺酯， 荧光染料 B 为羧基 -X- 罗丹明琥 珀酰亚胺酯 ； 组合 4 ： 荧光染料 A 为荧光素异硫氰酸酯， 荧光染料 B 为 5- 羧基四甲基罗丹明琥珀酰 亚胺酯 ； 组合 5 ： 荧光染料 A 为 Cy2， NHS， 荧光染料 B 为 Cy3， NHS ； 组合 6 ： 荧光染料 A 为 Cy3， NHS， 荧光染料 B 为 Cy5， NHS ； 组合7 ： 荧光染料A为Alexa Fluor 488 dye， SE， 荧光染料B为Alexa Fluor 555 dye， SE ； 组合8 ： 荧光染料A为A。
6、lexa Fluor 555 dye， SE， 荧光染料B为Alexa Fluor 647 dye， SE ； 组合 9 ： 荧光染料 A 为TR， SE， 荧光染料 B 为650/655-X， SE。 2. 一种如权利要求 1 所述的多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法， 其特征在于将荧光 染料 A 和荧光染料 B 与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸， 以荧光编码的多聚赖 氨酸为内核材料用反向微乳液法将其包裹在二氧化硅基质中制备成多色光学编码硅壳纳 米棒。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于具体包括以下步骤 ： (1) 荧光编码多聚赖氨酸的制备 ： 将荧光染料 A 和荧光。
7、染料 B 按要求的比例同时或依 次与多聚赖氨酸在碳酸盐缓冲液中于室温下反应 2 3h， 用透析法除去过量的荧光染料， 制得荧光编码的多聚赖氨酸 ； (2) 编码多聚赖氨酸的包壳 ： 将 7.2 7.5 体积的环己烷、 1.6 1.8 体积的表面活性 剂曲拉通X-100和1.61.8体积的正己醇混合均匀， 往混合液中加入0.40.8体积的水 作为分散相， 搅拌均匀后形成反相微乳液 ； 加入 0.2 0.6 体积 4.010-5 8.010-4mol/ L 的荧光编码多聚赖氨酸的水溶液， 搅拌均匀后再加入 0.2 0.4 体积的正硅酸乙酯和 0.1 0.2 体积的氨水， 反应 20 24h 后加入。
8、丙酮或乙醇破乳， 离心收集纳米棒并洗涤， 最 后得到多色光学编码硅壳纳米棒。 4. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于所述碳酸盐缓冲液的浓度为 0.01 0.1mol/L。 5. 根据权利要求 4 所述的制备方法， 其特征在于当荧光染料的活性基团为异硫氰酸酯 基时， 碳酸盐缓冲液的 pH 值为 9.0 9.5 ； 当荧光染料的活性基团为琥珀酰亚胺酯基时， 碳 酸盐缓冲液的 pH 值为 8.0 8.5。 权 利 要 求 书 CN 101333436 B2/2 页 3 6. 根据权利要求 2 5 中任意一项所述的制备方法， 其特征在于 ： 当荧光染料 A 与荧 光染料 B 所带的活性基。
9、团不同时， 将荧光染料 A 与荧光染料 B 依次与多聚赖氨酸反应制备 荧光编码的多聚赖氨酸。 权 利 要 求 书 CN 101333436 B1/4 页 4 多色光学编码硅壳纳米棒及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种纳米技术领域光致发光材料及其制备方法， 具体涉及一种可用于 多元生物分析与荧光成像中信号编码的光致发光材料及其制备方法。 背景技术 0002 生命科学技术的迅速发展给分析技术提出了新的挑战。面对分析对象的日益增 多， 需要有与之相适应的分析手段相配合， 特别需要有能够对同一样品中多种组分进行同 时测定的多元分析技术。 在多元分析中， 往往需要使用多种荧光标记物， 最好是。
10、仅用一个波 长的光就能有效激发出各个标记物的荧光， 这要求被选用的标记物具有相近的最大激发波 长和明显不同的最大发射波长， 然而这样的染料并不多。此外， 多数染料分子的荧光并不 强， 而且易于受到不可逆的光漂白作用。最近发展起来的光学编码技术为多元分析提供了 更为广泛的荧光标记物。该技术通常在聚合物微球中包裹两种或多种荧光染料或量子点， 通过控制各种染料的比例来实现编码。 目前常用于光学编码的材料主要有聚合物荧光编码 微球和量子点编码微球。 聚合物材料易于发生溶胀而引起染料泄露， 亲水性不好， 在水溶液 中易于团聚 ； 量子点存在着制备条件苛刻， 毒性大等问题。 发明内容 0003 本发明要解。
11、决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种染料泄露少、 生物相 容性好、 亲水性好、 荧光强、 性质稳定的多色光学编码硅壳纳米棒， 还提供一种工艺简单、 染 料包裹效率高的多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法。 0004 为解决上述技术问题， 本发明提出的技术方案为一种多色光学编码硅壳纳米棒， 其特征在于所述多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型结构， 其外壳材料为二氧化硅， 内核材 料为荧光编码的多聚赖氨酸， 荧光编码的多聚赖氨酸含有荧光染料 A 和荧光染料 B， 荧光染 料 A 和荧光染料 B 是荧光共振能量转移供体 - 受体对 ； 所述荧光编码的多聚赖氨酸是荧光 染料 A 和荧光染料 B 通过其各。
12、自所带有的活性基团与多聚赖氨酸的胺基共价连接而成。 0005 上述荧光共振能量转移供体 - 受体对可以为下表中所列的各荧光染料配对组合 中的任意一种 ： 0006 表一 0007 说 明 书 CN 101333436 B2/4 页 5 0008 上述荧光染料所带有的活性基团为异硫氰酸酯基或琥珀酰亚胺酯基。 0009 本发明还提出一种上述多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法， 其特征在于将荧光 染料 A 和荧光染料 B 与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸， 以荧光编码的多聚赖 氨酸为内核材料， 用反向微乳液法将内核材料包裹在二氧化硅基质中制备成多色光学编码 的硅壳纳米棒。 0010 上述制备方。
13、法具体包括以下步骤 ： 0011 (1) 荧光编码多聚赖氨酸的制备 ： 将荧光染料 A 和荧光染料 B 按要求的比例同时 或依次与多聚赖氨酸在碳酸盐缓冲液中于室温下反应 2 3h， 用透析法除去过量的荧光染 料， 制得荧光编码的多聚赖氨酸 ； 0012 (2) 编码多聚赖氨酸的包壳 ： 将 7.2 7.5 体积的环己烷、 1.6 1.8 体积的表 面活性剂曲拉通 X-100 和 1.6 1.8 体积的正己醇混合均匀， 往混合液中加入 0.4 0.8 体积的水作为分散相， 搅拌均匀后形成反相微乳液 ； 加入 0.2 0.6 体积 4.010-5 8.010-4mol/L上述制得的荧光编码多聚赖氨。
14、酸的水溶液， 搅拌均匀后再加入0.20.4体 积的正硅酸乙酯和 0.1 0.2 体积氨水 ( 质量分数 25 28 )， 反应 20 24h 后加入丙 酮或乙醇破乳， 离心收集纳米棒， 并依次用乙醇、 水洗涤收集到的纳米棒， 最后得到多色光 学编码硅壳纳米棒。 0013 上述碳酸盐缓冲液的浓度为 0.01 0.1mol/L。当荧光染料的活性基团为异硫氰 酸酯基时， 碳酸盐缓冲液的 pH 值可以为 9.0 9.5 ； 当荧光染料的活性基团为琥珀酰亚胺 酯基时， 碳酸盐缓冲液的 pH 值可以为 8.0 8.5。 0014 在荧光染料 A 和荧光染料 B 与多聚赖氨酸反应制备荧光编码多聚赖氨酸的过程。
15、 中， 当荧光染料 A 与荧光染料 B 所带的活性基团相同时， 荧光染料 A 与荧光染料 B 可以同时 与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸 ； 当荧光染料 A 与荧光染料 B 所带的活性基 说 明 书 CN 101333436 B3/4 页 6 团不同时， 应当将荧光染料 A 与荧光染料 B 依次与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖 氨酸。 0015 上述荧光染料A和荧光染料B的配比应当根据所要制备的光学编码材料的要求进 行确定， 随着荧光染料A和荧光染料B配比情况的变化， 以供体染料的最大激发波长的光激 发， 所述纳米颗粒可发出不同颜色的荧光， 从而达到多色光学编码的效果。 0016 。
16、本发明针对如何制备硅壳纳米棒以及如何将多色光学编码的思路融合于纳米棒 的制备的问题， 设计了一种简单易行的制备方案。与现有技术相比， 本发明不仅克服了现 有光学编码材料易于溶胀引起染料泄露、 亲水性不好、 毒性大等技术缺陷， 也改进了现有制 备工艺中常见的工艺过程复杂、 制备条件苛刻等不足， 提供了一种简便易行、 染料包裹效率 高、 染料泄露少的多色光学编码硅壳纳米棒的制备工艺。通过改变硅壳纳米棒中各种染料 的配比， 而制得的系列性的多色光学编码硅壳纳米棒， 在某一特定波长光的激发下， 各个纳 米棒能发出不同颜色的荧光， 光强度较高， 具有较好的生物相容性和亲水性， 且性质较为稳 定。 此外，。
17、 由于硅壳纳米棒表面有硅网结构的存在， 可以利用表面硅烷化修饰方法对本发明 的硅壳纳米棒表面进行进一步处理， 使其带上氨基、 羧基等基团， 以便于蛋白质、 核酸等生 物分子的接枝。因此， 本发明的多色光学编码硅壳纳米棒在多基因表达分析、 蛋白质多元 分析、 高通量筛选、 多通道生物学测定、 医学诊断学和组合化学等方面都有着广阔的应用前 景。 附图说明 0017 图 1 为多色光学编码硅壳纳米棒 ( 实施例中第 c 种硅壳纳米棒 ) 的透射电子显微 镜成像图 ； 0018 图 2 为实施例中制备的七种多色光学编码硅壳纳米棒的荧光发射光谱图 ； 0019 图 3 为由活体荧光成像仪所拍摄到的七种多。
18、色光学编码硅壳纳米棒的荧光成像 图 ； 其中每种硅壳纳米棒所发出的荧光颜色在 RGB 颜色模式下的色值如下 ： 0020 纳米棒 a 的颜色 (R ： 101， G ： 192， B ： 107) ； 0021 纳米棒 b 的颜色 (R ： 250， G ： 230， B ： 87) ； 0022 纳米棒 c 的颜色 (R ： 254， G ： 190， B ： 59) ； 0023 纳米棒 d 的颜色 (R ： 245， G ： 166， B ： 44) ； 0024 纳米棒 e 的颜色 (R ： 247， G ： 139， B ： 27) ； 0025 纳米棒 f 的颜色 (R ： 255。
19、， G ： 119， B ： 22) ； 0026 纳米棒 g 的颜色 (R ： 255， G ： 119， B ： 10)。 具体实施方式 0027 实施例 0028 一种多色光学编码硅壳纳米棒， 通过以下方法制备得到 ： 0029 (1)将分子量为715万的多聚赖氨酸溶解在pH 8.3， 0.1mol/L的碳酸氢钠溶液 中， 配成 40mg/mL 的溶液 A ； 将 5- 羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯 (5-TAMRA， SE) 用无水二 甲亚砜 (DMSO) 溶解， 配制成 9.010-3mol/L 的溶液 B ； 取 30l 溶液 B 加入到 270l 溶液 A 中， 迅速搅拌均匀， 。
20、在室温下持续轻微搅拌 2h， 用 0.15mol/L 的 NaCl 溶液透析除去过量的 说 明 书 CN 101333436 B4/4 页 7 染料， 再加入 pH 9.2， 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液补足 1250l， 得到溶液 C ； 0030 (2) 取荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 溶于无水 DMSO 中， 分别配制成 7.610-4mol/ L、 3.810-4mol/L、 1.910-4mol/L、 9.510-5mol/L、 4.810-5mol/L 的不同浓度的 FITC/ DMSO 溶液 ； 取 45l 溶液 A， 加入 162l、 pH 值 9.2、 0.1mol/L。
21、 的碳酸盐缓冲液和 23l 7.610-4mol/L FITC/DMSO得到溶液a1； 另取207l溶液C， 加入23l DMSO得到溶液g1； 再取五个管， 各加入 207l 溶液 C， 然后在各管中分别加入 7.610-4mol/L、 3.810-4mol/ L、 1.910-4mol/L、 9.510-5mol/L、 4.810-5mol/L 的 FITC/DMSO 溶液， 分别得到溶液 b1、 c1、 d1、 e1、 f1； 将得到的溶液 a1 g1在室温下持续轻微搅拌 3h， 分别用 0.15mol/L 的 NaCl 溶液和超纯水透析除去过量的 FITC 染料， 得到溶液 a2 g2。
22、； 0031 (3) 在七个具塞广口瓶中各加入环己烷 7.5mL、 表面活性剂曲拉通 X-1001.8mL 和 正己醇 1.8mL， 混合均匀， 加入 400L 水作为分散相， 搅拌均匀后形成反相微乳液， 将溶液 a2 g2分别加入上述七个瓶中， 搅拌均匀后加入 200L 正硅酸乙酯和 200L 质量分数为 25 28的氨水， 反应 24h 后加入乙醇破乳， 离心收集纳米棒， 依次用乙醇、 水洗涤收集到 的纳米棒， 由此可制得一套包含七种类型的多色光学编码硅壳纳米棒 (a g)。( 其中 b f 为本发明的多色光学编码硅壳纳米棒 ) 0032 用透射电子显微镜来观察制备得到的多色光学编码硅壳纳。
23、米棒的形貌 ( 纳米棒 c)， 得到如图 1 所示的一个具有代表性的成像图， 由图可见， 该纳米颗粒呈棒状、 有明显的 核壳结构， 长度主要分布在 100 200nm 之间， 宽度约为 70nm， 壳厚度约为 25nm， 颗粒分散 性好。用荧光分光光度计在相同的激发波长 (460nm) 下， 对纳米棒 a g 的发射光谱进行 测定， 如图 2 所示， 由图可见， 仅用一种激发波长就能有效激发出纳米棒 a g 的荧光， 各纳 米棒在 520nm 与 580nm 的发射峰的比值随着 FITC 与 TAMRA 投料比的减小而减小， 该比值可 以用于编码。用活体荧光成像仪以蓝光同时对纳米棒 a g 进行激发来观察它们的荧光， 如图3所示， 由图3可见， 仅用一个波长的光就能有效激发出各个纳米棒的荧光， 荧光强、 各 颗粒所激发出的荧光随着FITC与TAMRA投料比的减小而由绿色逐渐过渡到橙红色， 这些不 同的颜色也可以用来进行光学编码。 说 明 书 CN 101333436 B1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101333436 B2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 。