技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株施氏假单胞菌及其培养、固定化和应用。
背景技术
氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化乃至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。
传统脱氮理论认为废水生物脱氮必须是铵态氮经历典型的硝化与反硝化过程，即废水中的铵态氮首先被氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌在好氧条件下依次氧化为亚硝酸盐氮、硝酸盐氮, 然后由反硝化细菌在厌氧或兼氧条件下将硝酸盐氮依次还原为亚硝酸盐氮、氮气或氮氧化物。传统认识上的反硝化菌在有氧条件下优先利用氧气作为电子受体，只有在缺氧条件下硝酸盐才会代替氧气作为最终电子受体进行反硝化作用。
20世纪80年代，Robertson和Kuene在除硫和反硝化处理系统中首次分离到好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha (现更名为Paracoccus pantotrophus )、
Pseudomonas spp.及Alcaligenes faecalis，至今已有许多好氧反硝化菌被分离获得，现已报道的好氧反硝化细菌大多分布于假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus) 和产碱菌属(Alcaligenes)等土壤、废水常见种属中，而且发现好氧反硝化菌大多表现异氧硝化的特性。但分离自不同环境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它们可为实际应用或进一步的菌株改造提供丰富的种源。如李小龙等从鱼塘水样中分离到1株不动杆菌 ( Acinetobacter sp.) ，以KNO3、( NH4)2 SO4、NaNO2为唯一氮源的培养液中，可在24 h内将培养液中NO3--N 从161. 61 mg ·L-1 降至55. 69 mg ·L-1，去除速率为4.41 mg·L-1 h-1 NO3--N ；15 h内将NH 4+ -N由220. 24 mg·L-1降至14.78 mg ·L-1，去除速率为13.70 mg·L-1h-1 NH4+–N ；12 h内NO2--N 浓度由101. 27 mg ·L-1降至21. 85 mg·L-1，去除速率为6.62mg·L-1h-1 NO2--N；但其脱氮的适宜pH为偏碱性的；20℃时不生长， 40℃时在NH4+-N测定液中生长缓慢，在NO2--N测定液中不生长，最佳生长温度为30℃（微生物学报，2011,51（8）:1062-1070）。
好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝化成为可能。迄今为止，对于异养硝化、好氧反硝化的机理尚有待继续深入研究，对异养硝化菌和好氧反硝化菌的应用还很少，但因其在脱氮方面的独特优势，从长远看必将得到广泛的应用，因此选育优良性能的菌株为实际应用提供种源具有重要的实际意义。
固定化细胞技术用于废水生物处理与传统的悬浮生物处理法相比，能纯化和保持高效菌种，微生物浓度高，污泥产量少，固液分离效果好。因此，该项技术在废水生物处理，尤其是在特种水处理领域中，获得了广泛的研究。固定
化细胞技术已用于BOD 物质的去除、硝化－反硝化、脱磷、去酚、氰的降解、LAS 降解、重金属离子的去除与回收以及印染废水的脱色处理等。近年来，固定化硝化菌脱氮技术已经从实验室和小规模试验阶段进入大规模的生产性试验
阶段。目前，固定化好氧反硝化菌脱氮技术还处于实验室和小规模试验阶段。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株好氧反硝化菌，其特点为该菌株为采用常规分离方法从采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥中分离获得，经过16SrDNA序列测定并将测序结果通过GeenBank Blast进行比对分析，与Pseudomanos stutzeri的同源性为99.9%，编为P. stutzeri WZUF25。
本发明提供的一株施氏假单胞菌，该菌株为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）WZUF25，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.7685。
本发明提供上述施氏假单胞菌的培养方法，包括如下步骤：
1）保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，培养12 h以上，离心，得菌体，用无菌水洗涤后制成OD680为0.900～1.000的菌悬液；
2）步骤1）所得菌悬液接种于反硝化培养基中进行培养；
其中，所述反硝化培养基的构成为：碳源，氮源，K2HPO4，FeSO4，MgSO4，H2O，所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠、甘油或葡萄糖，所述氮源为含硝酸根离子的化合物。
优选地，步骤2）中所述反硝化培养基的配方为：碳源，氮源中硝酸根的质量1.228g，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000 mL，pH为 5~9，所述碳源与氮源的NO3-的质量比为5:1.228~15:1.228。
作为优选技术方案，步骤1）保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，于20～40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L-1的条件下培养；步骤2）中所得菌悬液接种于反硝化培养基中，于25~40℃，溶氧3.5～6.1 mg·L-1下培养。
作为优选技术方案，步骤2）中所述反硝化培养基的pH 5~9。
优选地，所述菌悬液以5%的体积比接种于反硝化培养基中。
本发明提供上述的施氏假单胞菌的应用，其特征在于，将所述施氏假单胞菌WZUF25接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
作为优选技术方案，所述含氮水溶液为含有NH4+、NO3-和NO2-的一种或其组合的水溶液，所述施氏假单胞菌WZUF25脱NO3--N、NH4+-N和NO2--N的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。含氮水溶液中的氮源只为NH4+-N时，碳源与含氮废水中NH4+的质量比优选为5:0.0.34~15:0.34；含氮水溶液中的氮源只为NO3-时，碳源与含氮废水中NO3-的质量比为5:1.228 ~15:1.228；含氮水溶液中的氮源只为NO2--N时，碳源与含氮废水中NO2-的质量比为5:0.67~15:0.67。
作为优选技术方案，所述含氮水溶液pH为4～10，所述施氏假单胞菌WZUF25于温度20℃～45℃，溶氧为1.3～7.3mg·L-1的条件下对含氮水溶液进行脱氮。
本发明提供上述施氏假单胞菌固定化制备微胶囊的方法，步骤如下：
1）菌株WZUF25接种于LB培养基中培养后离心得菌体，菌体以蒸馏水洗涤，菌体与分散有活性炭粉末的海藻酸钠溶液混合；
2）配制CaCl2水溶液中，于37℃水浴10~30min后，将步骤1）所得混合液滴加入温度37℃的CaCl2水溶液中，得微胶囊。
上述微胶囊的应用：所述微胶囊接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
优选地，所述含氮水溶液为含有NO3-和NO2-的一种或其组合的水溶液，所述固定化施氏假单胞菌WZUF25的微胶囊脱NO3--N、NH4+-N和NO2--N的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。含氮水溶液中的氮源只为NO3-时，碳源与含氮废水中NO3-的质量比为5:1.228~15:1.228；含氮水溶液中的氮源只为NO2-时，碳源与含氮废水中NO2-的质量比为5:0.67~15:0.67。
作为优选技术方案，所述含氮水溶液pH为4～10，所述固定化施氏假单胞菌WZUF25的微胶囊于温度20℃～45℃，溶氧为1.3～7.3mg·L-1的条件下对含氮水溶液进行脱氮。
本发明能够达到以下技术效果：
1、施氏假单胞菌（Pseudomanos stutzeri）WZUF25进行好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，不仅对NO3--N和NO2--N的去除率高，而且具有较高的同化NH4+-N能力，可为同步硝化和反硝化提供种源。同时提供采用活性炭-海藻酸钙包埋法制备的固定化施氏假单胞菌去除NO3--N的能力和稳定性。
2、本发明经研究提供了适合菌株WZUF25培养的反硝化培养基和培养方法，可培养获得大量菌体。
3、在菌株WZUF25的最佳脱氮条件下，NO3--N和NO2--N的去除率能够达到99%以上；NH4+-N去除率可达60%左右。
4、利用本发明的菌株能够有效对废水进行处理，降低废水COD，并且脱氮效果良好。
5、本发明的菌株经固定化制得的微胶囊同样具有NO3--N和NO2--N的去除率高的特点。
附图说明
图1是采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF25与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株(P., Pseudomonas)。
图2是菌株WZUF25去除人工配制的NH4+-N污水进程。
图3是菌株WZUF25去除人工配制的NO3--N污水进程。
图4 是菌株WZUF25去除人工配制的NO2--N污水进程。
图5 是活性炭-海藻酸钙包埋菌株WZUF25去除人工配制的NO3--N污水进程。
菌株保藏
本发明的施氏假单胞菌（Pseudomanos stutzeri）WZUF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.7685，保藏起始日期为2013年6月8日。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例一：好氧反硝化菌株的分离
样品为取自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥，采用常规分离法，将一
定量活性污泥接种于富集培养基（KNO3 1g，丁二酸钠 5g，KH2PO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10g，H2O 1000mL，pH 7.2-7.6）于30℃ 160～180 rpm下进行富集培养3～4天，待长出细菌后转接新的富集培养基继续富集培养，如此重复4～5次。然后将经适当稀释的菌液涂布于分离培养基（琼脂 18g·L-1，其他成分同富集培养基）于30℃下培养48 h，挑取单菌落转接新的分离培养基进行划线纯化，直至经镜检为纯培养物，然后转接保藏培养基（酵母膏5g, 蛋白胨10g, NaCl 10g, 琼脂18g，H2O 1000 mL，pH 7.0）于30℃下培养后保藏。
分别将保藏菌株接种于反硝化培养基（丁二酸钠10g·L-1，其他成分同富集培养基）于30℃ 160～180 rpm下培养（250mL锥形瓶装培养基100mL），定时取样分别用格利斯试剂Ⅰ和Ⅱ以及二苯胺检测NO2--N和NO3--N，根据NO2--N的生成和降解情况以及NO3--N的降解情况，对保藏菌株的好氧反硝化性能进行初步筛选，对初步筛选获得的好氧反硝化菌株进行反硝化性能测定，测定方法按文献进行（东秀珠，常见细菌系统鉴定手册，北京：科学出版社，2001），以进一步确定好氧反硝化性能。
将初筛获得的具有好氧反硝化性能的菌株进行复筛，方法为将菌株接种于反硝化培养基（丁二酸钠10g·L-1，其他成分同富集培养基）于30℃ 160～180 rpm下培养24 h（250mL锥形瓶装培养基100mL），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况，筛选NO3--N去除能力强、NO2--N积累低甚至没有积累的优良菌株。
经上述方法获得1株优良的好氧反硝化菌株，编为WZUF25。
NO3--N测定采用酚二磺酸法分光光度法，NO2--N测定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法（国家环境保护局.水和废水监测分析方法（第三版）.北京：中国环境科学出版社，1989）。
NO3--N去除率(%)=（培养前上清液NO3--N浓度-培养后上清液NO3--N浓度）/培养前上清液NO3--N浓度×100%
实施例二：好氧反硝化菌株的鉴定
菌株WZUF25在分离培养基培养48h后菌落呈圆形、半透明、表面不光滑、边缘不整齐、菌落呈淡黄色，菌细胞短杆状，大小0.7～0.8×1.5～3.2μm，无芽孢，革兰氏阴性，单极鞭毛。
以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA，扩增采用一对通用引物：上游引物（P1）：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’，下游引物（P6）：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，PCR产物的纯化和测序由上海生物工程有限公司完成，测序结果通过GeenBank Blast进行比对分析。与GeenBank中的假单胞菌属（Pseudmonas sp.）的16SrDNA序列具有很高同源性，与P. stutzeri的同源性为99.9%。采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF25与相关种的16S rDNA序列系统发育树见图1。
施氏假单胞菌（Pseudmonas stutzeri）WZUF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 7685，保藏起始日期为2013年6月8日。
实施例三：菌株WZUF25好氧反硝化去除NO3--N的特性
采用单因子试验法，研究菌株WZUF25进行好氧反硝化去除NO3--N的特性。实验过程为：将保藏菌株(2.0mL冷冻管融化的菌液)接种于装有200mL LB培养基（酵母膏 5g, 蛋白胨10g, NaCl 10g, H2O 1000 mL，pH 7.0）的500mL锥形瓶中，在30℃、160rpm下培养24h，在8000 rpm下离心10min得菌体，并用无菌蒸馏水洗涤菌体2次，用无菌水制成菌悬液（OD680 0.900～1.000）。
然后菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（碳源，KNO3，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000mL，pH 4~10）的250mL锥形瓶中，于一定温度（20~45℃）一定转速（0~250rpm）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
NO2--N和NO3--N的测定同实施例一，溶氧的测定为装有100mL培养基的250mL锥形瓶在一定温度、一定转速下振荡24h后测定培养基的DO值。
NO3--N去除率计算同实施例一。
主要探讨碳源、碳源与KNO3的重量比、温度、pH和溶氧对菌株WZUF25去除NO3--N的影响，结果如表1～表5所示。
1、碳源对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（碳源10g，KNO3 2.0g ，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000mL，pH 7.0）的250mL锥形瓶中，于温度30℃，转速150rpm（溶氧4.9mg·L-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
表1 碳源对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
由表1可知，菌株WZUF25好氧反硝化的最适宜碳源为丁二酸钠和乙酸钠，
它们为碳源时，NO3--N去除率超过90%，且无NO2--N的积累。其次为甘油和葡萄糖，它们为碳源时，NO3--N去除率超过60%，几乎无NO2--N的积累。
2、碳源与KNO3的重量比对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（碳源2~15 g，KNO3 2.0g，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10g，H2O 1000mL，pH 7.0）的250mL锥形瓶中，于温度30℃，转速150rpm（溶氧4.9mg·L-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
表2 碳源与KNO3的重量比对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
由表2可知，随着碳源与KNO3的重量比增加对NO3--N的去除率均增加，但超过10:2后又下降。丁二酸钠和甘油最适宜的碳源与KNO3的重量比为10:2，葡萄糖和乙酸钠为5:2～10:2。
2g·L-1 KNO3的反硝化培养基相当于含1.228 g·L-1的NO3-，因此丁二酸和甘油与NO3-最适宜的质量比为10:1.228，葡萄糖和乙酸钠与NO3-最适宜的质量比为5:1.228～10:1.228。
3、温度对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO3 2.0g ，K2HPO4 1g ，FeSO4·7H2 O 0.20g ，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000mL，pH 7.0）的250mL锥形瓶中，于温度20~45℃，转速150rpm（溶氧4.9mg·L-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
表3 温度对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
由表3可知，在25℃～40℃范围内，菌株WZUF25对NO3--N的去除率相似，均超过90%，20℃或45℃时对NO3--N的去除率下降，且在20℃～45℃范围内，几乎均无NO2--N的积累。
4、pH对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO3 2.0g ，K2HPO4 1g ，FeSO4 ·7H2 O 0.20g ，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000mL，pH 4~10，pH用NaOH或HCl调节）的250mL锥形瓶中，于温度30℃，转速150rpm（溶氧4.9mg·L-1）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
表4 pH对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
由表4可知，在pH5～9的范围内，菌株WZUF25对NO3--N的去除率接近，且均无NO2--N的积累；pH 4或10时对NO3--N的去除率下降。
5、溶氧对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有100mL反硝化培养基（丁二酸钠10g ，KNO3 2.0g ，K2HPO4 1g ，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10g，H2O 1000mL，pH 7.0）的250mL锥形瓶中，于温度30℃、转速0~250rpm（通过转速控制溶氧）下培养24 h， 8000rpm下离心10min后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况。
表5溶氧对菌株WZUF25去除NO3--N的影响
由表5可知，溶氧为1.3mg·L-1时，菌株WZUF25对NO3--N的去除率很低；随着溶氧增加，对NO3--N的去除率随之增加；溶氧为3.5～6.1 mg·L-1时，对NO3--N的去除率接近，且无NO2--N的积累；溶氧为7.3 mg·L-1时， NO3--N的去除率开始下降。
实施例四：菌株WZUF25去除人工配制的NO3--N、NO2--N和NH4+-N污水进程
将保藏菌株(2.0 mL冷冻管融化菌液)接种于装有200mL LB培养基（配方同实施例三）的500mL锥形瓶中，在30℃、160rpm下培养24h，在8000 rpm下离心10min得菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌体2次后，用无菌水制成菌悬液（OD680 0.900～1.000）。按5%体积比的接种量接种于人工配制的NH4+-N污水（NH4 Cl 1g，丁二酸钠10g，K2 HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000 mL，pH 7.0）、NO3--N污水（丁二酸钠10g，KNO3 2.0g，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000 mL，pH 7.0）和NO2--N污水（丁二酸钠10g，NaNO2 1.0g（亚硝酸根含量0.67g），K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000 mL，pH 7.0），于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L-1）下培养， 定时取样测定生物量（OD680），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH4+-N浓度、NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除率，结果如图2～图4。
NO2--N和NO3--N的测定以及NO3--N去除率计算同实施例一。
NH4+-N测定采用纳氏试剂比色法（国家环境保护局.水和废水监测分析方法（第三版）.北京：中国环境科学出版社，1989）。
NH4+-N去除率（%）=（培养前上清液NH4+-N浓度-培养后上清液NH4+-N浓度）/培养前上清液NH4+-N浓度×100%
NO2--N去除率（%）=（培养前上清液NO2--N浓度-培养后上清液NO2--N浓度）/培养前上清液NO2--N浓度×100%
由图2看出，菌株WZUF25可在19 h内将1g·L-1 NH4Cl所含的NH4+-N（经测定平均含0.260 mg·mL-1 NH4+-N）去除59.79%，去除速率为8.18 mg·L-1h-1 NH4+-N，其生物量也在此时接近稳定，生长与去除NH4+-N是同步的。但在去除的过程中未形成NO2--N或NO3--N，因此菌株WZUF25没有异养硝化性能，仅仅同化NH4+-N，吸收利用氨氮。
从图3看出，菌株WZUF25可在12 h内将2g·L-1 KNO3所含的NO3--N（经测定平均含0.205 mg·mL-1NO3--N）完全去除，去除速率为17.08 mg·L-1h-1 NO3--N，此时生物量也达到稳定，生长与NO3--N去除是同步的。NO2--N的积累在9h达到高峰，至12h时已接近零。
由图4看出，菌株WZUF25可在12 h内将1g·L-1 NaNO2所含的NO2--N（经测定含0.200 mg·mL-1NO2--N）去除98.58%，去除速率为16.43 mg·L-1h-1 NO2--N，此时生物量也达到稳定，生长与NO2--N去除是同步的。
实施例五：活性炭-海藻酸钙包埋法固定化菌株WZUF25及固定化细胞去除人工配制的NO3--N污水的进程
将保藏菌株WZUF25（2mL冷冻管融化菌液）接种于装有200mL LB培养基（配方同实施例三）的500mL锥形瓶中，在30℃、160rpm下培养24h，在8000 rpm下离心10min得菌体，并用无菌蒸馏水洗涤菌体2次。
将2.5g湿菌体悬于5mL无菌蒸馏水中，加入5mL 质量百分比浓度4%海藻酸钠水溶液（水溶液中分散有质量百分比1%粉末活性炭）充分混匀。在三角瓶中加入200mL 质量百分比浓度4% CaCl2溶液，将头皮静脉针通过三角瓶瓶口的棉塞伸入三角瓶内，并与注射器相连，将其浸入37℃水浴中10min。将海藻酸钠菌体混悬液移入注射器内，适度加力，将海藻酸钠菌体悬液滴入4% CaCl2溶液中。滴完后将三角瓶移入20～22℃水浴中放置1h后倾去溶液，加入200mL无菌蒸馏水洗涤1次后重新加入200mL 4% CaCl2溶液，4℃平衡过夜，制得活性炭-海藻酸钙微胶囊。
将约50颗微胶囊接入装有50mL人工配制的NO3--N污水（丁二酸钠10g，KNO3 2.0g，K2HPO4 1g，FeSO4 ·7H2 O 0.20g，MgSO4 ·7H2O 0.10 g，H2O 1000 mL，pH 7.0）的锥形瓶中，在30℃ 100～120rpm（DO值4.5mg·L-1）下培养，定时取样测定NO3--N的去除率和NO2--N的积累情况，并观察微胶囊的稳定性，结果见图5。
由图5看出，固定化菌在12h时NO3--N的去除率达到92.70％，去除速率为15.84 mg·L-1h-1NO3--N，与无固定化的菌株去除NO3--N的速率接近。NO2--N的浓度在9h时达到高峰，至12h时已降至11.585 μg·mL-1，至16h时降至小于1 μg·mL-1。在此时间内微胶囊是稳定的。
实施例六：菌株WZUF25对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果
将保藏菌株(2.0 mL冷冻管融化菌液)接种于装有200mL LB培养基（配方同实施例三）的500mL锥形瓶中，在30℃、160rpm下培养24h，在8000 rpm下离心10min得菌体，用无菌蒸馏水洗涤菌体2次后，用无菌水制成菌悬液（OD680 0.900～1.000）。按5%体积比的接种量接种于经厌氧处理的畜禽废水中（500mL锥形瓶装200mL），于30℃ 150 rpm（DO值4.3 mg·L-1）下培养， 每隔24 h取样测定生物量（OD680），然后于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH4+-N浓度、NO2--N浓度、NO3--N浓度和COD值，结果见表6-1。
表6-1 菌株WZUF25对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果
由表6-1可知，菌株WZUF25在48 h内可使经厌氧处理的畜禽废水的COD下降106.33 mg·L-1，NH4+-N下降116.32 mg·L-1，NO3--N下降42.21 mg·L-1，NO2--N下降19.90 mg·L-1。
在经厌氧处理后的畜禽废水中加入碳源丁二酸钠，使其在废水中的浓度达10g·L-1，与不加入乙酸钠的畜禽废水相同的方法，研究菌株WZUF25对畜禽废水的净化效果，结果见表6-2。
由表6-2可知，在经厌氧处理后的畜禽废水中添加10 g·L-1丁二酸钠后，废水的COD值增加821.80 mg·L-1，培养24 h后下降379.61 mg·L-1，培养48 h后下降447.17 mg·L-1；培养24 h 后NH4+-N下降163.84 mg·L-1；培养48 h 后NH4+-N下降183.39 mg·L-1；培养24 h 后，NO3--N下降43.87 mg·L-1，NO2--N下降22.21 mg·L-1。因此，菌株WZUF22具有良好的实际应用潜力。
表6-2 菌株WZUF22对添加了氮源的厌氧处理后的畜禽废水的净化效果
实施例七：活性炭-海藻酸钙固定化细胞对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果
将100颗按实施例五法制备的活性炭-海藻酸钙微胶囊接入装有100mL经厌氧处理的畜禽废水的500mL锥形瓶中，在30℃ 100～120rpm（DO值3.5mg·L-1）下培养，每隔24 h取样于8000rpm下离心10min后测定上清液的NH4+-N浓度、NO2--N浓度、NO3--N浓度和COD值，结果见表7。
表7 活性炭-海藻酸钙固定化细胞对厌氧处理后的畜禽废水的净化效果
由表7-1可知，在48 h内活性炭-海藻酸钙微胶囊可使经厌氧处理的畜禽废水的COD下降32.09 mg·L-1，NH4+-N下降22.68 mg·L-1，NO3--N下降41.21mg·L-1，NO2--N下降20.31 mg·L-1。因此，固定化细胞主要可用于去除废水中的NO3--N和NO2--N。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。