本申请是申请日为2007年6月25日的中国专利申请 200780053491.4“涉及三萜合成的酶”的分案申请。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及编码植 物和种子中β-香树素衍生的三萜生物合成中涉及的酶的多核苷酸。本发 明也包括转基因植物，其中本发明多核苷酸的表达水平改变导致β-香树 素衍生的三萜(包括皂苷)的水平或结构改变。
背景技术
萜类化合物也称为类异戊二烯，它们组成了最大的天然产物家族， 该类产物已有超过22,000种单独化合物被描述。三萜或萜类化合物(半 萜、单萜、倍半萜烯、二萜、三萜、四萜、聚异戊烯醇等)在植物中起 到各种不同的功能，如激素、光合作用色素、电子载体、多糖组分调节 剂、和膜结构组分。植物萜类化合物主要存在于树脂、胶乳、蜡和油中。
三萜系化合物与多种植物特性相关，包括动物嗜食性、以及对病原 体和掠食者的抗性。三萜主要储存在植物根部，储存形式为它们的配醣， 皂苷(参见PriceK.R等人，1987，CRCCrit.Rev.FoodSci.Nutr. 26：27-133)。因此，例如，二倍体燕麦的突变体，黑燕麦，它缺乏主要 的燕麦根皂苷，燕麦根皂苷A-1(所谓的皂苷缺乏或“Sad”突变体)， 已经证明缺乏疾病抗性(PapadopoulouK.等人，1999，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.96：12923-12928)。这些突变体更易于受到许多不同的根感染 真菌的侵害，包括小麦全蚀病菌，它对燕麦来说通常是非致病的。遗传 分析表明疾病易感性提高和燕麦根皂苷水平降低有因果关系。此外，当 接种小麦全蚀病菌时，燕麦根皂苷水平降低的sad突变体(约为野生型 水平的15％)与其它完全缺乏燕麦根皂苷的突变体相比仅有有限的疾病 症状，这进一步将燕麦根皂苷水平和疾病抗性联系起来。
有累积的数据表明饮食中的皂苷可能是有益的(参见例如Shi，J.A. 等人(2004)J.Med.Food7：67-78和Vis，E.H.等人(2005)Nutr.Cancer 51：37-44)。同样的，已经证明大豆膳食皂苷对预防大鼠血胆脂醇过多 和动脉粥样硬化有益(Oakenfull等人(1984)，Nutr.Rep.Int. 29：1039-1046)。因为皂苷在从大豆到大豆分离物的过程中仅有轻微损 失，大豆中的皂苷水平提高将导致分离物中的皂苷水平提高(Berhow， M.A.等人(2002)Phytochem.Anal.13：343-348；HuJ.等人(2002)， J.Agric.FoodChem.50：2587-2594)。因此提高大豆中的皂苷水平将是 提高人类饮食中皂苷量的有效方法。此外，皂苷水平的提高可为药物开 发中使用的化合物提供来源。
三萜以及甾醇经由类异戊二烯途径合成。在此途径中，两分子的焦 磷酸法尼酯头-头相连形成角鲨烯，这是一种三萜。角鲨烯然后转化为 2，3-环氧角鲨烯。多种环氧角鲨烯环化酶催化2，3-环氧角鲨烯环化形成 多种多环骨架，包括一种或多种环阿屯醇、羊毛甾醇、羽扇豆醇、异复 合精油醇(isomultiflorenol)(一种三萜化合物)、β-香树素、α-香树素、 和拟南芥醇(thalianol)(一种三萜化合物)。该由环氧角鲨烯环化酶 催化的环化事件在甾醇和三萜皂苷生物合成途径之间形成形成分枝点。 多种环氧角鲨烯环化酶是进化相关的(Kushiro，T.等人(1998)，Eur.J. Biochem.256：238-244)并产生多种三环、四环、和五环结构，该结构能 进行进一步修饰。
三萜系化合物皂苷经由类异戊二烯途径，通过环化2，3-环氧角鲨烯 形成五环三萜系化合物，主要是齐墩果烷(β-香树素)或达玛烷骨架合 成。三萜系化合物主链随后经受多种修饰(氧化、取代、和糖基化)， 所述修饰由细胞色素P450依赖型单氧酶、糖基转移酶(GT)、和其它 酶介导。通常关于皂苷生物合成中涉及的酶和生物化学途径了解的不 多。尽管在此类重要的天然产物中存在可观的商业利益，产生此重要的 植物次级代谢产物家族所需的遗传机制很大程度上仍然是未知的。这可 能是部分由于分子的复杂性以及缺乏用于生物化学研究的途径中间体。 然而，目前已经了解了在皂苷生物合成中的第一个关键步骤，它通过环 氧角鲨烯环化酶β-香树素合酶(Sad1基因的产物)进行，最近已经克 隆了该基因并描述了其特征(HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.98：13431-13436)。另一个关键步骤由细胞色素P450酶 AsCYP51H10介导(由Sad2基因编码)，最近已经受到研究(QiX.等 人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103：18848-18853)。AsCYP51H10 (SAD2)是燕麦根皂苷合成所需要的。AsCYP51H10的精确生物化学 功能是未知的。然而Sad2突变体积累β-香树素，因此AsCYP51H10可 能是在一个或多个位点(C12、C13、C16、C21和/或C30)氧化β-香 树素(或其衍生物)所必需的(图1)。
结构比较(图1)预测除细胞色素P450之外的其它类的酶也将是把 β-香树素转化成燕麦根皂苷A-1所需要的。这些酶包括糖基转移酶 (GT)、酰基转移酶、和甲基转移酶(MT)。糖基转移酶属于一个大 的酶家族，该家族的酶将糖单元从活化供体分子转移到广谱潜在受体分 子上。潜在受体包括蛋白质、脂质、多糖和小分子，它们可涉及各种不 同的细胞过程如细胞壁合成和信号转导(CoutinhoPM等人，2003，J.Mol. Biol.，328：307-317)。在具有代表性的跨越全部区域的七十七个GT家 族中，GT家族1是其中最大的一个(CoutinhoPM和HenrissatB，1999： Carbohydrateactiveenzymeswebsitehttp://afmb.cnrs-mrs.ff/CAZY/)家族 1由经由糖转移的反转催化机制运作的GT组成，通常作用于低分子量 受体分子(VogtT和JonesP，2000，TrendsPlantSci.5∶380-386；LimE-K 和BowlesDJ，2004，EMBOJ23：2915-2922)。通过与其它糖基化小分 子的类比，预测燕麦根皂苷A-1的支链化糖链通过连续将糖单位加到糖 苷配基组分上合成，最可能的通过三个不同的糖基转移酶(GT)活性合 成。糖基化的第一个步骤涉及将L-阿拉伯糖加到糖苷配基的C3羟基 上，由阿糖胞苷转移酶介导。此后加入两个D-葡萄糖分子，一个在阿 拉伯糖的C2位点，另一个在C4位点，由一个(或可能两个)葡糖基转 移酶介导(TownsendB等人，2006，PhytochemistryRevs.5：109-114)。
酰基是植物来源的天然产物的常见部分，并能改变它们的化学和物 理特性。因此可能影响天然产物在生态相互作用中的生物效应，并影响 其它关键过程如亚细胞交换和螯合作用(例如通过作用于液泡摄入或驻 留标记)。最近已经发现了一类新的植物酰基转移酶。这些酶-丝氨酸 羧肽酶样酰基转移酶-与肽酶具有同源性，但缺乏肽酶活性，相反能够 酰化天然产物(MilkowskiC&StrackD，(2003)，Phytochemistry65： 517；FraserCM等人(2005)PlantPhysiology138：1136)。虽然其它植 物酰基转移酶一般使用辅酶硫酯作为酰基供体，这些SCPL使用酰基葡 萄糖供体。SCPL酰基转移酶家族的特征描述最佳的成员是番茄酶 GAC-Lp，该酶催化葡萄糖聚酯的形成，所述葡萄糖聚酯有助于野生番 茄中的昆虫抗性(LiAX&SteffensJC，2000，PNAS97：6902)；拟南 芥酶SNG1，它是合成苯基丙酸类芥子酰苹果酸酯(一种UV保护剂) 所必需的(LandryLG等人，1995，PlantPhysiology109：1159；LehfeldtC 等人，2000，PlantCell12：1295)；第二拟南芥酶SNG2，它涉及合成种 子中的芥子酰胆碱(ShirleyAM等人，2001，PlantJ28：83)；和甘蓝型 油菜酰基转移酶BnSCT，它催化芥子酸酯的形成，该酯与苦味、收敛性 和种子油萃取问题有关(MilkowskiC等人，2004，PlantJ.38：80；Baumert A等人，2005，Phytochemistry66：1334)。虽然在这些修饰中涉及的酶 和基因仍未能了解其特征，许多其它重要的植物来源的天然产物通过生 物化学分析已知如何通过葡萄糖-酯-依赖性的酰基转移酶反应进行制 备。实例包括在甘薯(Ipomoeabatatas)中的抗氧化剂绿原酸、在野生 胡萝卜(Daucuscarota)中的花青苷、在橡树(Quercusrobur)中的没 食子单宁酸和在芸苔(MilkowskiC&StrackD(2003)Phytochemistry65： 517；FraserCM等人(2005)PlantPhysiology138：1136)中的芥子酰- 和苯甲酰-酯化的芥子油苷。有四种不同的结构相关的燕麦根皂苷[14]。 燕麦根皂苷A-1(存在于燕麦根部的主要燕麦根皂苷)和B-1用N-甲基 邻氨基苯甲酸进行酰化，而燕麦根皂苷A-2和B-2用苯甲酸进行酰化 (HostettmannK和MarstonA，1995，Saponins，CambridgeUniversity Press，Cambridge，UK)。
S-腺苷-L-甲硫氨酸-依赖性的甲基转移酶涉及许多植物天然产物的 O-甲基化(FrickS.等人，2001，Phytochemistry56：1-4)。这些酶在木质 素前体和其它植物防御所需的化合物合成中起到重要作用(GangDR等 人，2002，PlantCell14：505-519。
发明内容
本发明涉及编码三萜合成中涉及的酶的分离多核苷酸。具体地讲， 本发明涉及编码新的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、新的甲基转移酶、和 新的葡糖基转移酶家族1的分离多核苷酸。这些分离自黑燕麦的新酶称 为AsSCPL1(丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶)、AsMT1(甲基转移酶)和 AsGT2(葡糖基转移酶)。
编码负责多种谷物中三萜合成的酶的基因鉴定将允许它们的操纵。 三萜合成操纵将引起三萜皂苷水平或结构的改变。皂苷产量的提高将引 起植物抗害虫能力的提高。来源于具有高三萜水平的植物的食物被认为 具有降低胆固醇的效应，然而三萜水平降低据信会使得食物具有更好的 风味。因此，具有改变的三萜水平的转基因植物可对害虫产生抗性，而 用三萜水平或结构发生改变的种子制备的食物将具有提高的营养价值 或更好的风味。
在另一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸 包含编码丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的氨 基酸序列当与SEQIDNO：2比较时，基于ClustalV比对方法具有至少 95％的序列同一性；或编码甲基转移酶多肽的核苷酸序列，所述多肽的 氨基酸序列当与SEQIDNO：4比较时，基于ClustalV比对方法具有至 少95％的序列同一性；或编码葡糖基转移酶的核苷酸序列，所述酶的 氨基酸序列当与SEQIDNO：6比较时，基于ClustalV比对方法具有至 少95％的序列同一性；或包含(a)、(b)或(c)的全长互补序列的 核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明分离多核苷酸的载 体。
在另一个实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，该构建体包 含编码三萜途径的第一种酶的本发明的多核苷酸的至少一部分，所述部 分可操作地连接至少一种调控序列上。
在另一个实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，该构建体包 含编码三萜途径的第一种酶的本发明的多核苷酸的至少一部分，所述部 分可操作地连接至少一种调控序列上，还包含至少第二多核苷酸的至少 一部分，所述第二多核苷酸编码调节三萜途径至少第二种酶的表达的多 肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的重组DNA构建体 的分离宿主细胞。该宿主细胞可以是酵母细胞、细菌细胞、或植物细胞。
本发明也包括包括植物和植物部分的组合物，所述组合物包含本发 明的分离多肽或多核苷酸。本发明也包括转化过的植物，所述植物来源 于高等植物和种子或谷物的转化过的宿主细胞，它们来源于此类转化过 的植物。此类转基因植物包括那些具有水平改变的β-香树素衍生的三 萜、或具有改性三萜的植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明重组体的转基因植 物，其中调节序列是异源启动子，其中转基因植物当与野生型植物的三 萜水平相比时具有改变的三萜水平。
本发明也涉及改变植物细胞中多肽表达水平的方法，所述方法包 括：用来自至少一部分本发明的分离多核苷酸的核酸片段转化植物组 织，其中所述多核苷酸能够改变天然丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基 转移酶、或葡糖基转移酶；将所述植物组织再生到转基因植物中；并评 估当与具有对应的天然丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡 糖基转移酶的野生型表达水平的植物比较时，所述转基因植物的丝氨酸 羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的表达水平改变。
本发明也涉及产生对至少一种真菌具有抗性的植物的方法，所述方 法包括：用至少一个本发明编码三萜途径第一种酶的重组DNA构建体 转化植物细胞；在促进转基因植物再生的条件下使来自步骤(a)的转 化植物细胞生长；并评估步骤(b)的转基因植物当与相同物种的未受 所述重组DNA构建体转化过的植物比较时，对至少一种真菌的抗性提 高情况。重组构建体还可包含至少一个第二多核苷酸，所述多核苷酸编 码调节三萜途径至少一个第二种酶表达的多肽，期望该多核苷酸包括但 不限于本发明的多核苷酸以及编码途径中前两个步骤的酶的核苷酸序 列，所述酶为环氧角鲨烯环化酶β-香树素合酶(Sad1基因的产物； HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：13431-13436) 和/或细胞色素P450酶CYP51H10(由Sad2基因编码；QiX.等人，2006， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：18848-18853)。
本发明也涉及生产具有改变水平的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲 基转移酶、或葡糖基转移酶的植物的方法，所述方法包括：用至少一种 权利要求5所述的编码三萜途径第一种酶的重组DNA构建体转化植物 细胞；在促进转基因植物再生的条件下使来自步骤(a)的转化植物细 胞生长；并评估当与相同物种的未用所述重组DNA构建体转化过的植 物中的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的量 比较时，步骤(b)的转基因植物的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基 转移酶、或葡糖基转移酶的表达水平改变。
本发明也涉及用于生产具有改变的三萜皂苷水平的植物的方法，所 述方法包括：用至少一个本发明编码三萜途径第一种酶的重组DNA构 建体转化植物细胞；在促进转基因植物再生的条件下使来自步骤(a) 的转化植物细胞生长；并评估步骤(b)的转基因植物当与相同物种的 未用所述重组DNA构建体转化过的植物中的三萜皂苷量比较时的三萜 皂苷水平变化。重组构建体还可包含至少一个第二多核苷酸的至少一部 分，所述多核苷酸编码调节三萜途径中至少一个第二种酶表达的多肽， 期望该多核苷酸包括但不限于本发明的多核苷酸(酰基转移酶、甲基转 移酶和葡糖基转移酶)、Sad1和Sad2。
本发明也涉及用于生产具有提高的三萜皂苷水平的植物的方法，所 述方法包括：用至少一种权利要求5的编码三萜途径第一种酶的重组 DNA构建体转化植物细胞；在促进转基因植物再生的条件下使来自步骤 (a)的转化植物细胞生长；并评估步骤(b)的转基因植物当与相同物 种的未用所述重组DNA构建体转化过的植物中的三萜皂苷量比较时的 三萜皂苷水平提高。重组构建体还可包含至少一个第二多核苷酸，所述 多核苷酸编码调节三萜途径中至少一个第二种酶表达的多肽，期望该多 核苷酸包括但不限于本发明的多核苷酸(酰基转移酶、甲基转移酶和葡 糖基转移酶)、Sad1和Sad2。
本发明也涉及用于生产具有降低的三萜皂苷水平的植物的方法，所 述方法包括：用至少一个本发明编码三萜途径第一种酶的重组DNA构 建体转化植物细胞；在促进转基因植物再生的条件下使来自步骤(a) 的转化植物细胞生长；并评估步骤(b)的转基因植物当与相同物种的 未用所述重组DNA构建体转化过的植物中的三萜皂苷量比较时的三萜 皂苷水平降低。重组构建体还可包含至少一个第二多核苷酸的至少一部 分，所述多核苷酸编码调节三萜途径中至少一个第二种酶表达的多肽， 期望该多核苷酸包括但不限于本发明的多核苷酸(酰基转移酶、甲基转 移酶和葡糖基转移酶)、Sad1和Sad2。
本发明也包括来自本发明转基因植物的谷物。
附图说明
根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发 明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。
图1图示了β-香树素和燕麦根皂苷A-1的结构，说明必然发生了多 个修饰以从前者衍生出后者。
图2图示了一个317kb的基因组DNA序列，该序列包含五个来自 黑燕麦的预测的生物合成酶的基因(β-香树素合酶(Sad1)、细胞色素 P450CYP51H10(Sad2)、t、丝氨酸羧肽酶样蛋白AsSCPL1、甲基转移 酶AsMT1和葡糖基转移酶AsGT2。
图3对五个预测的生物合成酶的Northern印迹分析(β-香树素合 酶(SAD1)、细胞色素P450CYP51H10(SAD2)、丝氨酸羧肽酶样蛋 白AsSCPL1、甲基转移酶AsMT1、葡糖基转移酶AsGT2和GAPDH对 照)，所述酶位于燕麦的根芽、叶和花组织中。
序列描述概要说明了后附的序列列表。此序列列表中以单个字母表 示核苷酸，以单独的3字母表示氨基酸，如NucleicAcidsResearch 13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal219(2)：345-373(1984) 所描述的IUPAC-IUB标准中所规定的。
SEQIDNO：1是编码来自黑燕麦(AsSCPL1)的丝氨酸羧肽酶样多 肽的cDNA核苷酸序列。
SEQIDNO：2是衍生自SEQIDNO：1中显示的cDNA片段或SEQID NO：7中显示的基因组片段的AsSCPL1氨基酸序列。
SEQIDNO：3是编码来自黑燕麦(AsMT1)的酰基甲基转移酶的 cDNA核苷酸序列。
SEQIDNO：4是衍生自SEQIDNO：3中显示的cDNA片段或SEQID NO：8中显示的基因组片段的AsMT1氨基酸序列。
SEQIDNO：5是编码来自黑燕麦(AsGT2)的葡糖基转移酶的cDNA 核苷酸序列。
SEQIDNO：6是衍生自SEQIDNO：5中显示的cDNA片段或SEQID NO：9中显示的基因组片段的AsGT2氨基酸序列。
SEQIDNO：7是编码AsSCPL1多肽的基因组片段的核苷酸序列。
SEQIDNO：8是编码AsMT1的基因组片段的核苷酸序列。
SEQIDNO：9是编码AsGT2的基因组片段的核苷酸序列。
具体实施方式
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入 本文。
如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所 述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一 株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多 个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
在此公开的上下文中使用了许多术语和缩写。给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细 胞内由酶催化的一系列化学反应，用以实现待细胞使用的或待细胞贮存 的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(因而称作流量产生步骤)。 很多此类途径都很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有 期望的精确化学结构的产物。
本文所用的“核酸”意指多核苷酸，并包括单链或双链的脱氧核糖 核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。核酸也可以包括片段和经修饰的核苷 酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核 酸片段”可互换使用，并且是作为单链或双链的RNA或DNA聚合物， 任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们 的5′-单磷酸形式存在)可以用如下它们的单字母名称指代：“A”表示 腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或 脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T” 表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)， “K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表 示任何核苷酸。
术语“分离的”多核苷酸是一种已经被大体上分开或从其中天然产 生多核苷酸的生物中通过常规的核酸纯化方法纯化的其它多核苷酸， 即，其它染色体和染色体外的DNA及RNA。该术语也涵盖重组多核苷 酸和化学合成的多核苷酸。本发明的分离多核苷酸可包括全部或部分分 离多核苷酸，例如包含选自以下核苷酸序列的多核苷酸：SEQIDNO：1、 SEQIDNO：3、SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9 或此类核苷酸序列的全长互补序列。
三萜系化合物皂苷经由类异戊二烯途径，通过环化2，3-环氧角鲨烯 形成五环三萜系化合物，主要是齐墩果烷(β-香树素)或达玛烷骨架合 成。三萜系化合物主链随后经受多种修饰，包括氧化、酰基化、甲基化、 糖基化和其它取代，所述修饰由细胞色素P450依赖型单氧酶、糖基转 移酶、酰基转移酶、甲基转移酶和其它酶介导。
三萜，也称为三萜系化合物，包括但不限于皂苷和甾醇。
“皂苷”指植物中天然积累的环化三萜的配醣缀合物。环化三萜包 括但不限于羊毛甾醇、环阿屯醇、β-香树素、α-香树素、羽扇豆醇、 isomultiflorenol、和thalianol。“三萜皂苷”指环化三萜的配糖缀合物， 除了那些来源于羊毛甾醇或环阿屯醇之外的三萜。“甾族皂苷”指来源 于羊毛甾醇或环阿屯醇配醣缀合物。皂草精醇是经由体外酸水解获取的 三萜皂苷，对它们的测量为从中提取皂苷的组织中存在的三萜皂苷的量 提供了一个相对值。
三萜皂苷的水平可通过测量造成皂草精醇进行测定。皂草精醇的测 量值直接关联于三萜皂苷的水平。皂草精醇是经由体外酸水解获取的三 萜皂苷，对它们的测量为从中提取皂苷的组织中存在的三萜皂苷的量提 供了一个相对值，该值直接关联于三萜皂苷的量。
三萜皂苷水平可使用本领域已知的技术进行测量。例如，可使用具 有光散射检测器的HPLC-MS或HPLC进行测量(参见例如Rupasinghe， HP.等人，(2003)，J.Agri.FoodChem.51：5888-5894)。作为另外一 种选择，可使用具有UV检测器的HPLC进行测量(HubertJ等人， (2005)，J.Agric.FoodChem.53：3923-3930)。其它方法包括使用 GC-FAB。(参见例如Gee等人，(1993)，JSciFoodAgric.63：201-209)。 其它方法涉及使用薄层色谱法(TLC)结合密度计量学分离皂苷(参见 例如OleszekWA.(2002)J.Chromatogr.A967：147-162.；GurfinkelDM， 和RaoAV(2002)J.Agric.FoodChem.50：426-430。
使用其它方法测量三萜皂苷也是可能的。例如，使用多种免疫测定 方法(例如放射性免疫测定或ELISA)也是合适的(WangCC，Prasain JK，和BarnesS.(2002)J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life Sci.777：3-28，AhamedA等人，(2003)，Biochem.Biophys.Res.Commun. 302：587-592)。
“提高的三萜皂苷水平，”对于本发明而言指三萜皂苷水平高于那 些存在于相同物种的非转化植物中的三萜皂苷水平，水平提高是由于转 化了本发明的核酸片段。例如，“提高的三萜皂苷水平，”可以指三萜 皂苷水平高于那些存在于相同物种植物中的三萜皂苷水平，该植物不具 有本发明的包含编码环氧角鲨烯环化酶的多核苷酸的重组DNA分子。 “提高的三萜皂苷水平”可以是提高至少100ppm，250ppm，500ppm， 750ppm，1000ppm，1250ppm，1500ppm，3000ppm，6000，或任何它们 的整数。
“改变的水平”或“改变的表达”指转基因生物中产生的基因产物 的量或比例不同于正常生物或非转化生物。
“改变的三萜皂苷水平，”对于本发明而言指三萜皂苷水平的量或 比例不同于那些存在于相同物种的没有转化本发明的核酸片段的非转 化植物中的三萜皂苷水平。
“降低的三萜皂苷水平，”对于本发明而言指三萜皂苷水平低于那 些存在于相同物种的没有转化本发明的核酸片段的非转化植物中的三 萜皂苷水平。
术语“具有相当功能的亚片段”和“功能上相当的亚片段”在本文 中可互换使用。这些术语是指分离的核酸片段的一个部分或亚序列，其 中无论所述片段或亚片段是否编码有活性的酶，其都保留着改变基因表 达或导致某种表型的能力。例如，所述片段或亚片段可以被用于设计嵌 合基因，以在转化后的植物中产生所期望的表型。可以通过将核酸片段 或亚片段以相对于植物启动子序列有义或反义的方向与所属启动子序 列连接，从而设计出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亚片段 无论是否编码有活性的酶均可。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列 中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨 基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对蛋白质的结 构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质 同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标记 或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白 质家族。
术语“同源性”、“同源的”、“大体上类似的”和“大体上对应 的”在本文中可互换使用。它们指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不 会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些 术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷 酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片 段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应该理解的，本发明不仅仅 涵盖这些具体的示例性序列。
此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的大体上类似的核苷酸序列 也由它们在中等严格条件(如0.5XSSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文 所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部 分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力 所限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段例如来自远缘生物 的同源序列，到筛选高度相似的片段例如从近缘生物复制功能性酶的基 因。杂交后的洗涤确定严格性条件。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核 酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少2 倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼 此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括 100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将选择性杂交至 其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通 过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列 (同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些 错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度 少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
通常，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于 约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且 对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的 探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通 过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在 37℃于含有30至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠) 的缓冲液中杂交，以及在50至55℃用1X至2XSSC(20XSSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃于40 至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5X 至1XSSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃用0.1XSSC洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度 是关键因素。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以用Meinkoth等人，Anal. Biochem.138：267-284(1984)：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(％ GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度， ％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中 甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm是(在确定 的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的 温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm杂交和/或 洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％ 同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH 下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的熔解温度(Tm)低约5 ℃。然而，极严格条件可采用在比熔解温度(Tm)低1、2、3或4℃的 温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比熔解温度(Tm)低6、 7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比熔解温 度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃温度下杂交和/或洗涤。利用所 述等式、杂交和洗涤组合物以及理想的Tm，本领域技术人员将会理解， 杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。如果所需的 错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选 增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导可在以 下文献中找到：Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryand MolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第2 章“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacid probeassays”，Elsevier，NewYork(1993)；以及CurrentProtocolsin MolecularBiology，第2章，Ausubel等人编辑，GreenePublishingand Wiley-Interscience，NewYork(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少 10、30、60、90、120或240分钟。
在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指两 序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时 是相同的。
因此，“序列一致性百分比”是指通过在一个比对窗口上比较两段 最大化匹配的序列所决定的值，其中在所述比对窗口中的多核苷酸或多 肽序列的部分与(不包含附加或缺失)的参考序列相比可以包含附加或 缺失(即间隙)，以获得两段序列之间的最大匹配。所述百分比的计算 方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位 点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点 数，再将结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。序列一致性百分 比的可用的例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％和95％，或者从50％至100％的任意整数百分 比。上述一致性可以利用本文所述的任意程序来确定。
序列对比和百分比同一性或类似性可以用设计用于检测同源序列 的多种比较方法来确定，这些方法包括(但不限于)LASERGENE生物 信息计算包(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAligTM程序。在本 专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非 另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的 “默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
“ClustalV比对方法”对应于称为ClustalV(在Higgins和Sharp， CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人(1992)Comput.Appl. Biosci.8：189-191)，并存在于LASERGENE生物信息学计算软件包 (DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序中。对于多重比对， 默认值对应于缺口罚分(GAPPENALTY)=10和缺口长度罚分(GAP LENGTHPENALTY)=10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列 的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、空位罚分=3、窗口 (WINDOW)=5和DIAGONALSSAVED=5。而对于核酸，这些参数为 KTUPLE=2，空位罚分=5，窗口=4和DIAGONALSSAVED=4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百 分比同一性”。
“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(NationalCenter forBiotechnologyInformation，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核 苷酸序列的算法。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他 物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性 百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％或95％、或50％至100％之间的任何整 数百分比。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用 于描述本发明，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、 58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、 68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％。此分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有 用的。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基 酸序列的情况下发生变化的遗传密码的趋异度。因此，本发明涉及任何 包含编码所有或主要部分的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸片段，所述 氨基酸序列编码如SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、和SEQIDNO：6示出 的AsSCPL1、AsMT1和AsGT2蛋白。技术人员熟知由特定宿主细胞使 用指定给定氨基酸的核苷酸密码子表现出的“密码子偏倚”。因此，当 合成多核苷酸用于改善宿主细胞中的特定基因表达时，希望设计该多核 苷酸使得其密码子使用频率接近宿主细胞使用的优选密码子的频率。
如本文所用的，“合成核酸片段”可由使用本领域技术人员已知的 方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些构件相连接并进行退火 以形成更大的核酸片段，然后可将其酶催化进行装配以构建完整的所需 核酸片段。与核酸片段有关的“化学合成”指在体外对组分核苷酸进行 装配。可以采用完善建立的方法来完成核酸片段的手工化学合成，或者 可使用许多种可商业获得的机器中的一种来完成自动化学合成。因此， 基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制核酸 片段用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码 子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定 可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。
“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸片段，其包括编码序列前 的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。 “天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基 因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的 调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列 和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的 调控序列和编码序列。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中 的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天 然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入 基因组内的基因。
在应用于植物细胞时，术语“基因组”不仅包括在细胞核内发现的 染色体DNA，并且还包括在细胞的亚细胞成分(例如线粒体、质体)内 发现的细胞器DNA。
“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿 主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“等位基因”是染色体上占据给定位点的基因的几种供选择替代形 式中的一种。当染色体上给定位点处存在的所有等位基因相同时，植物 在该位点是纯合子。如果染色体上给定位点处存在的等位基因不同的 话，植物在该位点是杂合子。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列” 指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)， 并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸 序列。调控序列可包括，但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、 多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。 启动子序列由近侧和较远端上游元件组成，后者经常指增强子。因此， “增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，它可以是启动子的天然 元件，或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以 整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组 成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解， 不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶 段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在 大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA 片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞 型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于 植物细胞中的不同类型的新启动子；在以下文献中可以发现多个实例： Okamuro，J.K.andGoldberg，R.B.编辑的BiochemistryofPlants15：1-82 (1989)。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷 酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上 游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻 译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner，R.和Foster，G.D.， Mol.Biotechnol.3：225-236(1995))。
“3′非编码序列”，“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码 序列下游并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别 序列和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征 为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。Ingelbrecht，I.L.等人 例示了不同3′非编码序列的用途PlantCell1：671-680(1989)。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生 的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。 当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它指 成熟的RNA。“信使RNA或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞 翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并用反转录酶从 mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链，或使用DNA聚合酶I的 Klenow片段转化成双链。“有义”RNA指包含mRNA并且能在细胞内 或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。
“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻 止靶基因表达的RNA(美国专利5,107,065)。反义RNA可以与特定基 因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子、或编 码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其它不能翻译 但是对细胞过程有影响作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的” 对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得 其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的调控。例如，当启动子 能够调节编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制) 时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反 义的取向可操作地连接至调控序列。在另一个例子中，本发明的互补 RNA区域，无论直接或间接连接、5′端与目标mRNA或3′端与目标 mRNA连接、或者位于目标mRNA内、或者第一互补区域以5′端而 其互补体以3′端与目标mRNA连接，均可构成可用的连接。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且 在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis， T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarbor Laboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)。转化方法为本领域的技 术人员所熟知，并描述于下文。
“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA片段的 技术，其包括一系列重复的循环(PerkinElmerCetusInstruments， Norwalk，CT)。典型地，双链DNA被热变性，两种与目标片段的3′端 区域互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中间温度下得到延伸。 一组的上述三个连续的步骤被称为一个“循环”。
术语“重组”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分 离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代 谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形 式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、 噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中 多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能 够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序 列一起引入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外 还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是 指包含外来基因，并具有能令所述基因在宿主中增强表达的所述基因以 外的元件的特定载体(即指可将核酸序列或片段移入其中的不连续的核 酸片段)。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建 体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的 核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例 如嵌合构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于 同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类 构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取 决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知 的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁 殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗 传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和 模式的表达(Jones等人，EMBOJ.，4：2411-2418(1985)；DeAlmeida 等人，Mol.Gen.Genetics218：78-86(1989))，因此，必须筛选多次事 件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可以通过DNA 的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免 疫印迹分析或表型分析等完成。
本文所用术语“表达”是指功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质 (既可以是前体也可以是成熟形式))的生产。
术语“导入是指将核酸(例如表达构建体)或蛋白提供至细胞中。 导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可以整合 进细胞的基因组内，以及包括指将核酸或蛋白暂时提供给细胞。导入包 括指稳定的或暂时性的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例 如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指 “转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或 原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、 质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如 转染的mRNA)。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初始 翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质指mRNA的初 级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于) 细胞内定位信号。
“信号肽”是一种与蛋白协同翻译并将蛋白导向分泌器官体系的氨 基酸序列(Chrispeels，M.(1991)Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol. 42：21-53)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同 上)，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号(同上)。 如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替 代(Raikhel，N.(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。“叶绿体转运 肽”是与蛋白协同翻译并将蛋白导向叶绿体或在其中制备蛋白的细胞中 存在的其它质体类型。“叶绿体转运序列”指编码叶绿体转运肽的核苷 酸序列。
“稳定转化”指将核酸片段转入宿主生物的基因组以产生稳定的遗 传特性，该基因组包括核基因组和细胞器基因组。相反“瞬时转化”指 将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或 无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。含有转化核酸片段的宿主生 物被称为“转基因”生物体。
如本文所用的“转基因”是指其基因组内含有异源多核苷酸的植物 或细胞。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多 核苷酸能传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为表达构建 体的部分整合进基因组中。本文所用的转基因包括因异源核酸存在而已 经改变了基因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植 物，包括初始进行此类改变的转基因以及从初始的转基因通过有性杂交 或无性繁殖产生的那些转基因。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通 过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重 组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组 (染色体基因组或染色体外基因组)改变。
术语“抑制”指当与植物中天然酶的可检测的酶活性水平比较时， 转基因植物中可检测的酶活性水平的降低。植物中天然酶的酶活性水平 本文称为“野生型”活性。术语“抑制”包括降低、减少、下调、减弱、 抑制、消除和阻止。该降低可能是由于降低了天然mRNA翻译成天然酶 的水平。也可能是由于天然DNA转录成mRNA的量降低和/或天然 mRNA的降解加快。术语“天然酶”指所需细胞中天然产生的酶。
植物中的酶抑制可通过本领域已知的多种方法完成，包括以下方 法。“共抑制”是指产生能抑制相同的或充分相似的天然基因表达的有 义RNA转录本(美国专利5,231,020)。此前，已通过着眼于以有义方 向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列 具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见 Vaucheret等人，1998，PlantJ.，16：651-659；以及Gura，2000，Nature404： 804-808)。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录 物。可将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998 年8月20日公开的PCT专利公开WO98/36083)。已经描述了“发夹” 结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA 形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开 WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义 方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷 酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基 因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley，S.V. 等人，2003，MethodsinMolecularBiology，PlantFunctionalGenomics： MethodsandProtocols236：273-286。其中茎由至少30个来自待抑制基因 的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用 于抑制(于1999年12月2日公开的WO99/61632)。使用聚-T和聚-A 序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的 WO02/00894)。然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎-环 结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体显示由 形成茎环结构的核苷酸片段编码的多核苷酸的水平降低，如于2002年1 月3日公开的PCT专利公开WO02/00904中所述。已经描述了产生 dsRNA构建体的用途。在这些构建体中共启动子引导诱导基因抑制的基 因特异性有义和反义RNA的转录(参见例如Shi，H.等人(2000)RNA 6：1069-1076；Bastin，P.等人(2000)J.CellSci.113：3321-3328；Giordano， E.等人(2002)Genetics160：637-648；LaCount，D.J.和Donelson，J.E. 美国专利申请20020182223，公布于2002年12月5日；Tran，N.等人 (2003)BMCBiotechnol.3：21；和申请人的美国临时申请60/578,404， 提交于2004年6月9日)。
用于酶抑制的其它方法包括但不限于使用可形成催化RNA或可具 有核酶活性的多核苷酸(美国专利公开4,987,071，公布于1991年1月 22日)，以及小RNA(也称为miRNA)干涉(Javier等人(2003)Nature 425：257-263)。
用于抑制的多核苷酸片段序列与需被抑制的基因中存在的多核苷 酸片段序列并非100％相同。例如，使用来源于编码α亚基(美国专利 公开6,362,399)的基因部分的多核苷酸已经成功抑制了所有大豆种子贮 藏蛋白β-大豆伴球蛋白的亚基。β-大豆伴球蛋白是一种异质糖蛋白， 由三个高负电亚基(鉴定为α、α′和β)的多样化组合组成。编码α和 α′亚基的多核苷酸序列彼此约85％相同，然而编码β亚基的多核苷酸 序列与α和α′亚基分别为约75％至约80％相同。因此，与需抑制的靶 多核苷酸区域至少约75％相同的多核苷酸已经显示对抑制所需靶有 效。所述多核苷酸可以与所需靶序列至少约80％相同，至少约90％相 同，至少约95％相同，或约100％相同。
天然基因“能够抑制表达的部分”指分离的核酸片段的一个部分或 亚片段，其中无论所述片段或亚片段是否可以被翻译成有活性的酶，其 都保留着改变基因表达或导致某种表型的能力。例如，所述片段或亚片 段可以被用于设计嵌合基因或重组DNA片段，以在转化后的植物中产 生所期望的表型。可以通过将核酸片段或亚片段以相对于植物启动子序 列有义或反义的方向与所属启动子序列连接，从而设计出用于抑制的嵌 合基因，其中所述核酸片段或亚片段无论是否翻译成有活性的酶均可。 可将重组DNA片段设计成包含能够促进茎-环结构形成的核酸片段。在 茎-环结构中环或茎包含一部分需被抑制的基因。核酸片段应具有至少约 20个邻接核苷酸的延伸部分，该延伸部分与需被抑制的基因相同。邻接 核苷酸的延伸部分可以是任何数目，从至少约20，或约32，至需被抑 制的整个基因的大小。
术语“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细 胞，种子以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的 细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配 子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
“对至少一种真菌有抗性的植物”指包含本发明的重组DNA构建 体的植物，当用真菌感染该植物时，相对于无本发明的重组DNA构建 体的植物，它能抗感染或在更大程度上忍受感染，导致损害减少、健康 程度增加以及产量少损失或不损失。真菌通常是病原体。“病原体”或 “真菌病原体”指在不包括本发明重组DNA构建体的条件下将引起植 物疾病的真菌。包含本发明的重组DNA构建体的转基因植物通常是比 无本发明重组DNA构建体的相同物种植物对至少一种真菌更具有抗性 的植物。
植物表达系统、表达盒和载体、以及转化
启动子是引导植物细胞机制从启动子的邻接编码序列下游(3′)产 生RNA的DNA序列。所述启动子区域影响着基因的RNA转录物合成 的速率、合成时的发育阶段和细胞类型。所述RNA转录物被加工为 mRNA，后者作为用于将RNA序列翻译为所编码多肽的氨基酸序列的 模板。5′端非翻译前导序列是mRNA上位于蛋白质编码区域上游的区 域，其可能对mRNA翻译的起始和进行发挥作用。3′转录终止/多聚腺苷 酸化信号是位于蛋白质编码区域下游的非翻译区域，其在植物细胞中的 作用是导致RNA转录的终止和多聚腺苷酸向RNA3′端的添加。
用于驱动编码序列表达的启动子的来源并不重要，只要它具有足够 的转录活性以通过在适当的时间、在所期望的宿主组织内表达所期望的 核酸片段的可翻译的mRNA，从而达到本发明的目的即可。异种的或非 异种的(即内源的)启动子均可用于实施本发明。例如，适当的启动子 包括但不限于：β大豆伴球蛋白启动子的α引发亚单位、库尼兹(Kunitz) 胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、大豆球蛋白Gy1启动子、 β大豆伴球蛋白启动子的β亚单位、P34/GlyBdm30K启动子、白蛋白 启动子、LegA1启动子和LegA2启动子。
上述膜联蛋白或P34启动子描述于PCT专利公布WO04/071178 (公布于2004年8月26日)。上述膜联蛋白启动子的活性水平与任何 已知的强启动子相当，所述强启动子如：(1)CaMV35S启动子 (Atanassova等人，PlantMol.Biol.37：275-285(1998)；BattrawandHall， PlantMol.Biol.15：527-538(1990)；Holtorf等人，PlantMol.Biol. 29：637-646(1995)；Jefferson等人，EMBOJ.6：3901-3907(1987)； Wilmink等人，PlantMol.Biol.28：949-955(1995))；(2)拟南芥油 质蛋白(oleosin)启动子(Plant等人，PlantMol.Biol.25：193-205(1994)； Li，TexasA&MUniversityPh.D.dissertation，pp.107-128(1997))； (3)拟南芥泛素延伸蛋白启动子(Callis等人，JBiol.Chem.265 (21)：12486-93(1990))；(4)番茄泛素基因启动子(Rollfinke等 人，Gene.211(2)：267-76(1998))；(5)大豆热激蛋白启动子(Schoffl 等人，MolGenGenet.217(2-3)：246-53(1989))；以及(6)玉米 H3组蛋白基因启动子(Atanassova等人，PlantMolBiol.37(2)：275-85 (1989))。
上述膜联蛋白启动子的另一有用特性是其在发育种子中的表达谱。 上述膜联蛋白启动子在早期(授粉后10天以内)的发育中种子中最为 活跃，而在随后的时期基本保持沉默。上述膜联蛋白启动子的表达谱与 许多种子特异性启动子的都不同，后者如通常在发育后期表现出最高活 性的种子贮藏蛋白启动子(Chen等人，Dev.Genet.10：112-122(1989)； Ellerstrom等人，PlantMol.Biol.32：1019-1027(1996)；Keddie等人， PlantMol.Biol.24：327-340(1994)；Plant等人，(同上)；Li，(同 上))。上述膜联蛋白启动子具有更加常规的表达谱，不过仍与其他已 知的种子特异性启动子不同。因此，当希望在早期发育阶段过表达或抑 制一个基因时，上述膜联蛋白启动子是一个很有吸引力的选择。例如， 可能希望过表达一个调控早期胚胎发育的基因或一个在种子成熟之前 参与代谢的基因。
在鉴定出适合表达编码序列的适当启动子之后，利用为本领域的技 术人员所熟知的传统方法，将所述启动子以有义方向进行可操作地连 接。
本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并 且Sambrook，J.等人在MolecularCloning：ALaboratoryManual；第二 版；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，NewYork， 1989(以下简称“Sambrook等人，1989”)或Ausubel，F.M.，Brent， R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.andStruhl， K.，编辑，；在CurrentProtocolsinMolecularBiology；JohnWileyand Sons：NewYork，1990(以下简称“Ausubel等人，1990”)中有更加 详尽的描述。
在构建了重组构建体之后，可以通过为本领域的普通技术人员所熟 知的方法(例如转染、转化和电穿孔)，将其导入植物细胞。
也可将本发明的重组构建体导入一种植物细胞；或者也可将每一重 组构建体导入至不同的植物细胞。
如前所述，在植物细胞中的表达方式可以是暂时性的也可以是稳定 的。
植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分：根、 茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如 单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植株或植物 器官、组织或细胞培养物中。
术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织 或组织群。术语“基因组”是指：(1)存在于生物体的每一个细胞或 者病毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；和/或(2) 作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。
用于转化双子叶植物(主要利用根癌农杆菌)并获得转基因植物的 方法，已与其他方法一起公布于下列文献：棉花(美国专利5,004,863； 美国专利5,159,135)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011)； 用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利5,463,174)；花生(Cheng 等人，PlantCellRep.15：653-657(1996)；McKently等人PlantCellRep. 14：699-703(1995))；番木瓜果(Ling，K.等人Bio/technology9：752-758 (1991))；以及豌豆(Grant等人PlantCellRep.15：254-258(1995))。 对植物转化的其他常用方法的综述参见Newell，C.A.(Mol.Biotechnol. 16：53-65(2000))。这些转化方法之一利用了发根土壤杆菌(Tepfler， M.andCasse-Delbart，F.Microbiol.Sci.4：24-28(1987))。已公布的利 用直接输送DNA进行的大豆转化，有利用PEG融合(PCT专利公布 WO92/17598)、利用电穿孔(Chowrira，G.M.等人，Mol.Biotechnol. 3：17-23(1995)；Christou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.84：3962-3966 (1987))、利用显微注射和利用基因枪轰击(McCabe，D.E等人， Bio/Technology6：923(1988)；Christou等人，PlantPhysiol.87：671-674 (1988))进行的。
存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决 于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体 或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的 (Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：MethodsforPlantMolecular Biology，(Eds.)，Academic：SanDiego，CA(1988))。该再生和 生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞和培养这些单独化的细胞 通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以 类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类 的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生 纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系 的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给 再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的 本发明的转基因植物。
除以上所讨论的程序以外，专业人员亦熟悉描述了用于下列目的的 特定条件和程序的标准源资料：大分子的构建、操作和分离(例如DNA 分子、质粒等等)；重组DNA片段和重组表达体的构建；以及克隆的 筛选和分离。例如参见：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratory Manual，ColdSpringHarbor：NY(1989)；Maliga等人，MethodsinPlant MolecularBiology，ColdSpringHarbor：NY(1995)；Birren等人，Genome Analysis：DetectingGenes，第1卷，ColdSpringHarbor：NY(1998)； Birren等人，GenomeAnalysis：AnalyzingDNA，第2卷，ColdSpring Harbor：NY(1998)；PlantMolecularBiology：ALaboratoryManual， 编辑，Clark，Springer：NY(1997)。
本发明涉及编码丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖 基转移酶的分离多核苷酸。如本文所用，“多核苷酸”指编码新丝氨酸 羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的多核苷酸，所述 酶涉及植物中β-香树素衍生的三萜或具有改变修改形式的三萜的生物 合成。这些分离自黑燕麦的酶称为AsSCPL1(丝氨酸羧肽酶样酰基转移 酶)、AsMT1(甲基转移酶)和AsGT2(葡糖基转移酶)。
Sad7突变体不能产生燕麦根皂苷，也不能积累在正-氨茴酸甲酯(燕 麦根皂苷A-1和B-1)或苯甲酸盐(燕麦根皂苷A-2和B-2)酰基位点 具有羟基的三萜配醣(QiX等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101：8233)。因此，它们不发生三萜酰化。已经鉴定了四个具有Sad7表 型的突变体(表1)。它们中的每一个都具有对本发明的多核苷酸有损 害，将导致多核苷酸不能表达编码功能蛋白的功能mRNA。这些数据与 本文提供的生物化学数据一起表明本发明非突变的多核苷酸编码来自 黑燕麦的(ASCPL1)丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶，该酶负责三萜主链 的酰化，而该酰化过程在Sad7突变体中不发生。公开了编码AsSCPL1 的cDNA基因组片段(SEQIDNO：1和SEQIDNO：7)。
表1：表征Sad7突变体。显示的发生改变的碱基位置(上标第2列) 基于突变体DNA序列与SEQIDNO：1的比较。
Sad9基因产物与苯基丙酸类生物合成中涉及的甲基转移酶具有同 源性，包括在叶片中响应病原体袭击和UV刺激诱导的大麦甲基转移酶 (ChristensenA等人，1998，PlantMol.Biol.36：219)。因为该甲基转 移酶是燕麦根皂苷合成所需的，它的作用可能是甲基化燕麦根皂苷A-1 和B-1的邻氨基苯甲酸盐部分(图1)。已经鉴定了四个具有Sad9表型 的突变体(表2)。它们中的每一个都具有对本发明的多核苷酸有损害， 将导致多核苷酸不能表达编码功能蛋白的功能mRNA。这些数据与本文 提供的生物化学数据一起表明本发明非突变的多核苷酸编码来自黑燕 麦的(AsMT1)甲基转移酶，该酶负责甲基化燕麦根皂苷A-1和B-1的 邻氨基苯甲酸盐部分。公开了编码AsMT1的cDNA基因组片段(SEQID NO：3和SEQIDNO：8)。
表2：Sad9突变体表征。显示的发生改变的碱基位置(上标第2列) 基于突变体DNA序列与SEQIDNO：3的比较。
Sad10葡糖基转移酶与糖化水杨酸和其它苯甲酸衍生物的酶具有同 源性。公开了编码来自黑燕麦(AsGT2)的葡糖基转移的cDNA和基因 组片段(SEQIDNO：5和SEQIDNO：9)。
编码负责多种谷物中三萜合成的酶的基因鉴定将允许它们的操纵。 三萜合成操纵将引起三萜皂苷水平或结构的改变。
本发明的核酸片段可用于分离cDNA和编码来自相同或其他微生物 物种的同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟 知的。序列依赖型规程的实例包括但不限于核酸杂交方法、以及DNA 和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的各种应用(例如，聚合酶链反应、 连接酶链反应)。
例如，编码其它酰基转移酶(具体地讲那些丝氨酸羧肽酶样酰基转 移酶)、葡糖基转移酶或甲基转移酶的基因，可以以cDNA或基因组 DNA的形式直接分离，所述分离使用本领域技术人员熟知的方法，通过 使用全部或部分本发明核酸片段作DNA杂交探针以筛选来自任何所需 植物的文库。可以设计并通过本领域已知的方法，基于本发明的还是序 列合成特异性寡核苷酸探针(Sambrook等人，MolecularCloning：A LaboratoryManual，ColdSpringHarbor：NY(1989))。而且，整个序 列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、 切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转 录体系来合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部 分或全长的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记 或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的 cDNA或基因组片段。
此外，可以将本发明核酸片段的两个短片段在聚合酶链反应规程中 用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反 应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发 明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码植物基因的mRNA前体的 3′端的多腺苷酸片的存在。备选地，第二个引物序列可以基于来源于克 隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人， 1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998-9002)，通过用PCR扩增 在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′ 和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商业获得的3′RACE 或5′RACE体系(BRL)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A86：5673-5677；Loh等人，1989， Science243：217-220)。可组合使用通过3′和5′RACE程序生成的产物以 生成全长cDNA(FrohmanandMartin，1989，Techniques1：165)。
本发明的核苷酸序列和其衍生氨基酸序列的可用性有利于免疫筛 选cDNA表达文库。可以合成本发明氨基酸序列的合成肽代表部分。可 以使用这些肽免疫动物以产生多克隆或单克隆抗体，所述抗体具有对包 含所述氨基酸序列的肽或蛋白的特异性。然后可将这些抗体用于筛选 cDNA表达文库以分离受关注的全长cDNA克隆(Lerner，1984，Adv. Immunol.36：1-34；Sambrook)。
可以构建包含本发明的分离多核苷酸的质粒载体。质粒载体的选择 取决于将用于转化宿主细胞的方法。技术人员熟知为了成功地转化、筛 选和繁殖包含嵌合基因的宿主细胞，必须存在于质粒载体上的遗传元 件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式 的表达(Jones等人，1985，EMBOJ.，4：2411-2418；DeAlmeida等人， 1989，Mol.Gen.Genetics218：78-86)，因此，可能必须筛选多次事件以 获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可以通过DNA的 Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的 Western分析或表型分析完成。
就一些应用而言将本发明多肽导入不同的细胞区室或促进它们从 细胞中的分泌可能是有用的。因此设想可将本发明的重组DNA构建体 进一步进行补充，这通过改变编码合适的细胞内靶信号的编码序列来进 行，如转运信号(Keegstra，1989，Cell56：247-253)、具有或不具有内 质网驻留信号的信号序列(Chrispeels，1991，Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42：21-53)、或已经移除或未移除已有靶信号的核定位信号 (Raikhel，N.，1992，PlantPhys.100：1627-1632)。当引用的参考给出 这些信号中每个信号的实例时，所述列表是不完全的，将来可能发现更 多的靶信号。
例如嵌合丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移 酶的表达分别导致与未转化宿主细胞中产生的水平相比，在转化宿主细 胞中产生的所编码的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖 基转移酶蛋白水平变化。包含本发明多核苷酸的转基因植物或植物部分 在异源启动子的控制下也导致植物具有改变的三萜水平，所述多核苷酸 例如SEQIDNO：1、SEQIDNO：3、和SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQ IDNO：8、和SEQIDNO：9。植物可选自单子叶植物和双子叶植物。单子 叶植物包括但不限于玉米、燕麦、稻、小麦、大麦、棕榈等。双子叶植 物包括但不限于拟南芥、大豆、含油种子芸苔、花生、向日葵、红花、 棉花、烟草、番茄、马铃薯、可可豆等。植物部分包括但不限于例如种 子和谷物。因此，可将本发明的分离多核苷酸结合到能够导入并在宿主 细胞中复制的重组构建体中。
因此，本发明还涉及用于转化细胞的方法，所述方法包括用本发明 重组构建体转化细胞以及选择那些用本发明其中一种重组构建体转化 过的细胞。还关注用于生产转化植物的方法，所述方法包括用本发明的 任何多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。
可使用本发明的核酸片段产生转基因植物，转基因植物中本发明的 酰基转移酶、葡糖基转移酶或甲基转移酶的水平高于正常植物，或它们 在正常情况下不产生这些酶的细胞类型或发育阶段中存在。这将有改变 那些细胞中三萜生产的效应。据信任选地与编码负责皂苷生物合成途径 中其它步骤的酶的多核苷酸组合的本发明多核苷酸的超表达提高对至 少一种真菌的抗性。
本发明的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、葡糖基转移酶或甲基转移酶 的超表达可通过以下步骤完成：首先构建重组DNA构建体，其中编码 区被可操作地连接至一个启动子，该启动子能够引导三萜途径的第一种 酶(如本发明的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、葡糖基转移酶或甲基转移 酶)在所需组织和所需发育阶段中的表达。重组DNA构建体可包含来 源于相同基因的启动子序列和翻译前导序列。也可提供编码转录终止信 号的3′非编码序列。上述重组DNA构建体也可包含一种或多种促进基 因表达的内含子。
为了提高三萜途径的流量，可将上述能够引导丝氨酸羧肽酶样酰基 转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶表达的重组DNA构建体结合到 转基因植物中。
此外，可构建包含本发明基因的重组构建体，其中除了可操作地连 接至能够引导三萜途径第一种酶表达的启动子的编码区之外，重组构建 体还包含至少一个另外的编码区，该编码区可操作地连接至能够引导本 发明至少一个第二种酶表达的启动子。期望分离自黑燕麦的本发明基因 组合的实例包括但不限于：AsSCPL1+AsMT1；AsSCPL1+AsGT2； AsGT2+AsMT1和AsSCPL1+AsMT1+AsGT2。
也可通过组合在转基因植物中的上述重组构建体和编码途径中前 两个步骤的酶的构建体获得提高的途径通量，所述途径中前两个步骤的 酶是环氧角鲨烯环化酶β-香树素合酶(Sad1基因的产物；Haralampidis K.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：13431-13436)和/或细胞 色素P450酶CYP51H10(由Sad2基因编码；QiX.等人，2006，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.103：18848-18853)。以前已经描述了用于超表达这两 个基因的构建体(Osbourn等人，2007年3月6日，US，7,186,884B2； Osbourn等人，US2006-0112448A1)。
此外，可构建包含本发明基因的重组构建体，其中除了可操作地连 接至能够引导三萜途径第一种酶表达的启动子的编码区之外，重组构建 体还包含至少一个另外的编码区，该编码区可操作地连接至能够引导三 萜途径至少一个第二种酶表达的启动子。期望分离自黑燕麦的本发明基 因和来自三萜途径的其它基因的组合实例包括但不限于：
AsSCPL1+Sad1；AsMT1+Sad1；AsGT2+Sad1；AsSCPL1+Sad2； AsMT1+Sad2；AsGT2+Sad2；AsSCPL1+AsMT1；AsSCPL1+AsGT2； AsGT2+AsMT1；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2；AsSCPL1+ AsMT1+AsGT2+Sad1；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2+Sad2；AsSCPL1+ Sad1+Sad2；AsMT1+Sad1+Sad2；AsGT2+Sad1+Sad2；AsSCPL1+ AsMT1+Sad1+Sad2；AsSCPL1+AsGT2+Sad1+Sad2；AsMT1+ AsGT2+Sad1+Sad2；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2+Sad1+Sad2；
AsSCPL1+AsMT1+Sad1；AsSCPL1+AsGT2+Sad1；AsGT2+ AsMT1+Sad1；AsSCPL1+AsMT1+Sad2；AsSCPL1+AsGT2+Sad2； 和AsGT2+AsMT1+Sad2；
也可期望减少或消除植物中本发明的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、 甲基转移酶、或葡糖基转移酶的表达用于一些应用。抑制本发明多核苷 酸可导致植物产生更少的皂苷，这继而可改善风味。为了达到此目的， 可构建设计用于共抑制此类酶的重组DNA构建体，该构建通过将编码 本发明的丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的 多核苷酸连接到植物启动子序列上。作为另外一种选择，可构建设计用 于表达全部或部分本发明核酸片段的反义RNA的嵌合基因，该构建通 过将基因或基因片段反向连接到植物启动子序列上。可经由转化将共抑 制或反义嵌合基因导入植物中，其中减少或消除了相应内源基因的表 达。也可制备导致形成茎-环结构的嵌合核酸片段的构建体，其中本发明 的多核苷酸部分是茎或环或结构。使用编码本发明的丝氨酸羧肽酶样酰 基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的核苷酸序列的至少一部分制 备将以RNAi形式抑制其表达的构建体也是可能的。可将上文提到的任 何重组DNA构建体导入细胞中以消除植物中本发明的丝氨酸羧肽酶样 酰基转移酶、甲基转移酶、或葡糖基转移酶的表达。此外，此类构建体 能与包含环氧角鲨烯环化酶，β-香树素合酶片段的重组构建体组合 (Sad1基因的产物；(HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.98：13431-13436)和/或细胞色素P450酶CYP51H10(由Sad2基 因编码；QiX.等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：18848-18853) 以抑制途径中的所有步骤。期望分离自黑燕麦的本发明基因和来自三萜 途径的其它基因(可进行组合以改变或降低三萜皂苷的水平)的组合实 例包括但不限于：
AsSCPL1+Sad1；AsMT1+Sad1；AsGT2+Sad1；AsSCPL1+Sad2； AsMT1+Sad2；AsGT2+Sad2；AsSCPL1+AsMT1；AsSCPL1+AsGT2； AsGT2+AsMT1；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2；AsSCPL1+ AsMT1+AsGT2+Sad1；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2+Sad2；AsSCPL1+ Sad1+Sad2；AsMT1+Sad1+Sad2；AsGT2+Sad1+Sad2；AsSCPL1+ AsMT1+Sad1+Sad2；AsSCPL1+AsGT2+Sad1+Sad2；AsMT1+ AsGT2+Sad1+Sad2；AsSCPL1+AsMT1+AsGT2+Sad1+Sad2；
AsSCPL1+AsMT1+Sad1；AsSCPL1+AsGT2+Sad1；AsGT2+ AsMT1+Sad1；AsSCPL1+AsMT1+Sad2；AsSCPL1+AsGT2+Sad2； 和AsGT2+AsMT1+Sad2；
在某些实施方案中，本实施方案的核酸序列可以与受关注的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需表型的植物，所述序列可以是转基因的或非转基因的。例如，所述实施方案的多核苷酸可以与该实施方案的任何其它多核苷酸或其它基因进行堆叠。生成的组合也可包括受关注的多核苷酸的多个拷贝中的任何一个。所述实施方案的多核苷酸也可与任何其它基因或基因组合发生堆叠以产生具有多种所需特性的植物，包括但不限于动物饲料所需的特性如高油基因(例如美国专利公开6,232,529)；平衡氨基酸(例如硫素(美国专利公开5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987)，Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人，(1986)，J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)，Gene71：359；和Musumura等人，(1989)，PlantMol.Biol.12：123))；提高的消化性(例如修饰的贮藏蛋白质(美国专利申请序列号10/053,410，提交于2001年11月7日)；和硫氧还蛋白(美国专利申请序列号10/005,429，提交于2001年12月3日))，上述公开以引用方式并入本文。所述实施方案的多核苷酸也能与抗昆虫、疾病或除草剂所期望的特性堆叠(例如苏云金芽孢杆菌毒素蛋白质(美国专利公开5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene48：109)；凝集素(VanDamme等人(1994)PlantMol.Biol.24：825)；伏马菌素脱毒(fumoBisindetoxification)基因(美国专利公开5,792,931)；无毒性和抗病基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体如S4和/或Hra突变体(Lee等人，(1988)EMBOJ.7(5)：1241-1248)，抗谷氨酰胺合酶抑制剂性如草胺膦或basta(例如bar基因；DeBlock等人(1987)EMBOJ.6：2513-2518)；赋予HPPD抑制除草剂抗性的HPPD基因，所述除草剂如甲基磺草酮或异唑草酮(Matringe等人，(2005)，PestManagementScience61：269-276；Dufourmantel等人，(2007)PlantBiotech.J.5：118-133；也参见WO1997049816)，赋予PPO抑制除草剂抗性的基因(Li和Nicholl，(2005)PestManagmentScience61：277-285)；合成生长素抗性基因(美国专利申请2005/014737和Herman等人，(2005)，J.Biol.Chem.280：24759-24767)，和草甘膦抗性(epsps基因、gat基因如那些公开于美国专利公开申请公布US2004/0082770、WO02/36782和WO03/092360中的基因))；和过程或过程产物所期望的特性如高油(例如美国专利公开6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利公开5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支链化酶(SBE)和淀粉去支链化酶(SDBE))；以及聚合物生物塑料(例如美国专利公开5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶、和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)，有利于表达聚羟基链烷酸酯(PHAs))，其公开以引用方式并入本文。也可以组合所述实施方案的多核苷酸与提供农学特征的多核苷酸，所述农学特征如雄性不育(例如参见美国专利公开5.583,210)、秸秆强度、开花时间、产量提高、或转化技术特性如细胞周期调节或基因靶(例如WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821)，其公开以引用方式并入本文。
可通过任何方法产生这些堆叠的组合，包括但不限于通过任何常规方法或方法、或基因转化杂交育种植物。如果所述特性通过遗传转化植物堆叠，则受关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种所需特性的转基因植物用作靶，通过后续的转化导入更多特性。可以用共转化规程将特性与受关注的多核苷酸同时导入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，加入将导入两个序列，可将两个序列包含在分离的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子促进序列表达。在某些实例中，可能期望导入将抑制受关注的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超表达盒的任何组合组合使用以在植物中生成所需特性组合。进一步认识到可使用位点特异性重组体系在所需基因组位点堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，它们均以引用方式并入本文。
本发明的实施方案可以有效的抗多种植物真菌病原体。可使用上述 导致产生更高三萜水平皂苷的重组构建体产生抗至少一种真菌的植物。 主要作物的一些特异性真菌病原体包括但不限于以下菌种：大豆：菜豆 炭腐病菌、立枯丝核菌、油菜菌核病菌、尖孢镰孢菌、豆荚雕腐病和茎 枯病菌(Phomopsissojae)、大豆北方茎溃疡病菌、白绢菌、大豆紫斑 病菌、大豆灰斑病菌、黑线炭疽菌(Colletotichumtruncatum)、巴西橡 胶棒孢霉落叶病菌、大豆褐纹病菌、叶点霉菌、链格孢菌、大豆白粉病 菌、半裸镰刀菌、大豆茎褐腐病菌、黑果病菌甘氨酸、大豆锈菌、镧素 对镰刀菌；低芥酸菜籽：甘蓝黑斑病菌、低酸菜籽油黑胫病菌、立枯丝 核菌、油菜菌核病菌、油菜环斑病菌、粉红镰刀菌、链格孢菌；苜蓿： 苜蓿茎点霉菌、苜蓿尾孢、苜蓿假盘菌、苜蓿纤毛菌L、尖孢镰孢菌、 苜蓿黄萎病菌、葡柄霉菌、苜蓿葡柄霉菌、苜蓿炭疽病菌、苜蓿小光壳 菌、苜蓿锈病菌、苜蓿菌核病菌、苜蓿壳多孢叶斑菌、苜蓿匍柄霉菌、 苜蓿黄斑病菌；小麦：小麦条黑粉菌、小麦黑胚病菌链格孢、小麦黑霉 病菌、小麦镰刀菌、黄色镰刀菌、小麦散黑粉病菌、小麦壳二孢、麦类 条斑病菌、禾生炭疽菌、小麦白粉病菌、杆锈菌、隐匿柄锈菌、条锈菌、 小麦褐斑病菌、颖枯病菌、叶枯病菌、燕麦壳针孢、小麦基腐病菌、立 枯丝核菌、禾谷丝核菌、小麦全蚀病菌、小麦根腐病菌、黑麦麦角菌、 黑麦草腥黑粉菌、小麦腥黑穗病菌、小麦散黑粉病菌、小麦印度腥黑穗 病菌、立枯丝核菌；向日葵：霍尔斯单轴霉、油菜菌核病菌、向日葵壳 针孢、向日葵褐腐病菌、向日葵黑斑病菌、百日草链格孢菌、草莓灰霉 病菌、向日葵茎点霉黑茎病菌、菜豆壳球孢菌、二孢白粉菌、米根霉、 少根根霉、匍枝根霉、向日葵柄锈菌、大丽轮枝菌、顶头孢霉菌；玉米： 粱炭疽病菌(Glomerellagraminicola)、玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodia maydis)、玉米顶腐串珠镰刀菌、内生性轮状镰刀霉、禾谷镰刀菌 (Gibberellazeae)、黄曲霉、玉米小斑病菌、T(玉米小斑病菌)、玉 米圆斑病菌I、II&III(Cochlioboluscarbonum)、玉米大斑病菌I、II& III、梗蠕形菌、米褐斑病菌、玉米黄叶枯病菌、玉米眼斑病菌、高梁尾 孢、玉米黑粉菌、玉米柄锈菌、多堆柄锈菌、菜豆壳球孢菌、草酸青霉、 稻交链孢霉、禾黑芽枝霉、新月弯孢菌、不等弯孢、玉米弯孢叶斑病菌、 绿色木霉、玉米坚韧黑粉菌、玉米干腐病菌、玉米疯顶病菌、高粮林黑 穗菌、玉米锈病菌、麦类条斑病菌、顶头孢霉；高粱：大斑病菌、高粱 紫斑病菌、高粱胶尾孢菌、高粱粗斑壳二孢、高梁锈菌、菜豆壳球孢菌、 高粱黑葱花霉根腐病菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、为蜀黍生离蠕孢菌、 雀麦长蠕孢、新月弯孢菌、高粱茎点霉、高粱座枝孢、高梁生座枝孢、 高粱黑痣菌、高粱丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana)、高粱散黑穗病 菌、粱坚孢堆黑粉菌、高粱麦角菌、立枯丝核菌、枝顶孢霉、黑果病菌 (Colletotrichum)(C.sublineolum)、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌；等等。
可使用本发明的核酸序列进行多种基于核酸扩增的基因和物理绘 图方法。实例包括但不限于等位基因特异性扩增(Kazazian，H.H.jr， 1989，J.Lab.Clin.Med.11：95-96)、PCR扩增片段的多态性分析(CAPS； Sheffield，V.C.，等人，1993，Genomics16：325-332)、等位基因特异 性连接(Landegren，U.，等人，1988，Science241：1077-1080)、核苷 酸延伸反应(Sokolov，B.P.，1990，NucleicAcidRes.18：3671)、辐射 杂种作图(Walter，M.A.等人，1994，Nat.Genet.7：22-28)、荧光原位 杂交(FISH；Svitashev，S.K.和Somers，D.A.，2002，PlantCellTissueOrgan Cult.69：205-214)、以及Happy绘图(Dear，P.H.和Cook，P.R.，1989， NucleicAcidRes.17：6795-6807)。就这些方法而言，将核酸片段序列用 于设计并制备引物对用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是 本领域的技术人员熟知的。在使用基于PCR的基因绘图的方法中，必须 鉴定在对应于本发明核酸序列的区域中的绘图杂交亲本间的DNA序列 差异。然而这一般对所有绘图方法来说是不必要的。
尽管不希望受任何理论或操作理论的约束，本领域的技术人员相信 改变的三萜水平具有不同的效应。在通常会遭受真菌病原体感染的植物 部分中提高的三萜(如燕麦根皂苷)水平可赋予植物对至少一些此类病 原体的抗性，保护植物并因此提高其在真菌胁迫环境中的产量。来源于 具有高三萜水平的植物的食物被认为具有降低胆固醇的效应，然而三萜 水平降低据信会使得食物具有更好的风味。因此，生长过程中具有改变 水平的AsSCPL1、AsMT1和/或AsGT2的植物可有助于生产更有营养的 和/或风味更好的食物。因此，本发明也包括来自本发明转基因植物的谷 物。
实施例
本发明将在下面的实施例中进一步限定，其中所有份数和百分比是 以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施 例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上 面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征， 并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变 和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描 述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术 人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书 的范围内。
一般方法
实施例中使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟 知的并且在如下文献中有所描述：(1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F. 和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpring HarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)(Maniatis)；(2) T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，ExperimentswithGene Fusions；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1984)； 和(3)Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology， 由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。 适用于下面实施例的技术可在ManualofMethodsforGeneral Bacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow， EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips 编辑)，AmericanSocietyforMicrobiology：Washington，D.C.(1994))； 或ThomasD.BrockinBiotechnology：ATextbookofIndustrial Microbiology，第2版，SinauerAssociates：Sunderland，MA(1989)的 描述中找到。用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶 和材料均获自AldrichChemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories (Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或SigmaChemical Company(St.Louis，MO)，除非另外说明。
一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。 DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利 5,366,860；EP272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生 的。序列编辑是在Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor， MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较 是使用DNASTAR软件(DNAStar，Inc.)完成。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小 时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升， “μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔 浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克， “μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基 对而“kB”表示千碱基对。
实施例1
分离丝氨酸羧肽酶样蛋白(AsSCPL1)、甲基转移酶(AsMT1)和 葡糖基转移酶(AsGT2)的基因组和cDNA片段
编码受丝氨酸羧肽酶样蛋白(AsSCPL1)、甲基转移酶(AsMT1) 和葡糖基转移酶(AsGT2)影响的基因的基因组多核苷酸片段分离自 BAC文库，该文库来源于黑燕麦登录号S75基因组DNA和从燕麦中如 下制备的cDNA文库。
BAC文库从黑燕麦登录号S75基因组DNA中构建((QiX.等人， 2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103：18848-18853)。DNA探针来源于 Sad1(Osbourn等人，2007年3月6日，US，7,186,884B2)和Sad2(Osbourn 等人，US2006-0112448A1)，该探针用于筛选完整BAC文库。构建跨 越一个用于燕麦根皂苷生物合成的基因簇(QiX.等人，2004，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.101：8233-8238)的BAC重叠群。BAC指纹和BAC末 端序列分析使得我们能够装配一个重叠群，该重叠群由BAC克隆 462F14、460D15和409O10组成。克隆460D15包含Sad1和Sad2(QiX. 等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103：18848-18853)；克隆462F14 在最靠近Sad2的一侧具有约70kb与460D15的重叠区域，然而克隆 409O10与克隆460D15在最靠近Sad1的一侧重叠约35kb。使用409O10 的末端序列作为探针，鉴定另一个BAC克隆341P21。BAC指纹和PCR 分析确认克隆409O10的另一端与克隆341P21重叠约40kb。预测完整 重叠群的长度为365kb。
燕麦根mRNA的分离和相应的cDNA文库的构建描述于HaralampidisK.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：13431-13436。在EcoRI/XhoI位点将cDNA插入序列克隆到pGADT7载体中(ClonTechLab，Inc.)。将总计36,864个克隆储存在96384孔微板中。将完整的燕麦根cDNA文库分格置于两个过滤器上用于杂交。通过NotI消化分离来自BAC克隆409O10和341P21的插入序列DNA，并将其用作探针以筛选cDNA文库。鉴定了总计60个阳性克隆并将这些克隆的插入序列进行测序。测序使用ABIBig-DyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(AppliedBiosystems)进行。从52个克隆中获取cDNA序列。除了5个特殊序列之外，把剩余的47个cDNA插入序列分成四类基因。对它们进行进一步分析以鉴定最长的cDNA克隆并随后鉴定四类中每一类的全长cDNA。
第一类代表Sad1的cDNA，因此确认BAC重叠群实际上不跨越包 含此基因的基因簇。
预测来自第二类的全长cDNA编码丝氨酸羧肽酶样蛋白AsSCPL1。 该基因的核苷酸序列显示于SEQIDNO：1中。SEQIDNO：1的核苷酸56 至1534衍生的氨基酸序列显示于SEQIDNO：2中。核苷酸1535至1537 代表一个终止密码子。
第三类cDNA序列对应于预测的甲基转移酶，AsMT1。该基因的核 苷酸序列显示于SEQIDNO：3中。SEQIDNO：3的核苷酸13至1074衍 生的氨基酸序列显示于SEQIDNO：4中。核苷酸1075至1077代表一个 终止密码子。
第四类cDNA序列对应于一个预测的葡糖基转移酶家族1，AsGT2。 通过对燕麦根推定葡糖基转移酶EST(refSad1patent)的序列分析获取 全长cDNA。该基因的核苷酸序列显示于SEQIDNO：5。SEQIDNO：5 的核苷酸66至1475的衍生氨基酸序列显示于SEQIDNO：6。核苷酸1458 至1460代表一个终止密码子。
为了获取上述基因的基因组序列，通过标准BAC鸟枪测序法对来 自重叠群的BAC克隆462F14、460D15、409O10和341P21进行测序。 获取了约317kb的BAC重叠群，该重叠群包含五个预测的生物合成酶 的基因(β-香树素合酶(Sad1)、细胞色素P450CYP51H10(Sad2)、 丝氨酸羧肽酶样蛋白AsSCPL1、甲基转移酶AsMT1和葡糖基转移酶 AsGT2)(图2)。广泛的序列注释未揭示更多的开放阅读框。Northern 印迹法和RT-PCR分析表明BAC重叠群中的所有五个基因在根中优先 表达(图3)。因为燕麦根皂苷在燕麦根部合成并积聚，并且Sad1和 Sad2在根部优先表达，其它的三个基因AsSCPL1、AsMT1和AsGT2也 可能涉及燕麦根皂苷的生物合成。
基因组DNA序列和cDNA序列的比较提供了丝氨酸羧肽酶样蛋白 (AsSCPL1)、甲基转移酶(AsMT1)和葡糖基转移酶(AsGT2)的三 个基因的预测启动子和基因组序列。编码AsSCPL1、AsMT1和AsGT2 的基因组多核苷酸片段和预测的3-kb启动子序列分别显示于SEQID NO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNo：9。
实施例2
分离并表征Sad7燕麦突变体
用叠氮钠进行诱变二倍体燕麦(黑燕麦)的种子，使来自单个M1 植物的M2种子发芽并评估根部荧光以进行初筛选，鉴定皂苷缺乏或Sad 燕麦突变体。候选燕麦根皂苷缺乏突变体基于减少的根部荧光进行鉴 定，并通过TLC和HPLC分析来自纯合M3幼苗的甲醇根提取物进行确 认。
生成突变体
基本上按照所述方法用叠氮钠诱变二倍体燕麦(黑燕麦)的种子(登 录号S75，来自InstituteofGrasslandsandEnvironmentalResearch， Aberystwyth，Wales，UK)(Rines，H.W.，1985，Env.Exp.Bot.，25：7-17)。 简而言之，如下进行诱变。将种子预先浸泡在用橡胶塞子密封的锥形瓶 中，每颗种子使用0.5mL水，在轨道平台振荡器中以120个循环每分钟 振荡。在预浸泡4小时后倒出水。制备在0.1M磷酸钠中的10mM叠氮 钠溶液，pH3.2，并将其立即加到种子中。在如上进行振荡1小时后， 倒出诱变溶液并用水冲洗种子5至6次，其中最后三次水冲洗时间延长 至超过30分钟。将冲洗后的种子排干水分，铺展于通风橱里的纸上至 其干燥。使来自单个M1植物的M2种子发芽并如下文所示评估根部荧 光。
主要的燕麦根皂苷燕麦根皂苷A-1包含N-甲基邻氨基苯甲酸，因此 主要引起燕麦幼苗根部的亮蓝荧光(OsbournA.E.等人，1994，Physiol. Mol.PlantPathol.45：457-467)。燕麦根皂苷A-1可通过UV光进行检测， 这使得可将根部荧光用作初筛选以鉴定皂苷缺乏(Sad)燕麦突变体。 使单个M2家族的种子发芽并评估其根部荧光。在初步筛选中，在筛选 代表1,289个M2家族的幼苗后，鉴定了十个具有减少荧光的独立突变 体，这已被PapadopoulouK.等人报道过(1999，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.96：12923-1928)。后续的突变体筛选鉴定了另外82个基于减少 的根部荧光进行分离的独立燕麦根皂苷缺乏突变体。
生物化学表征
按照所述方法分析最初的十个突变体的根提取物(PapadopoulouK. 等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：12923-1928)。简而言之， 使M3种子在湿滤纸上发芽2天，收获每个品系的20株幼苗的根部末端 0.5cm部分，并在甲醇中提取。制备三份来自M3幼苗的粗制甲醇根提 取物用于HPLC分析，在HichromNucleosil5C18反相柱(4.5×250mm) 上，在等度条件下，在75％甲醇中(流量为1mL/min)，直接分析100 μL等分试样，检测波长为225nm。通过与那些已知浓度的标准品比较 峰区域，定量了四种燕麦根皂苷。将TLC分析的提取物干燥、重悬于 1mL水中，并施用于SepPakC18反相柱(Waters，Milford，MA)，该 柱已经预设条件为10mL甲醇后接10mL蒸馏水。在用75％甲醇洗脱后， 将样本干燥、重悬于15μL100％甲醇中，施用于TLC板，并使用氯仿∶ 甲醇∶水(13∶6∶1；v∶v∶v)分离。燕麦根皂苷A-1和B-1以及其它荧光 组分在302nm处UV激发下显像。然后用对甲氧基苯甲醛/硫酸/乙酸 (1∶1∶48，V∶V∶V)喷洒TLC板并在130℃下烘烤5分钟以检测所有四种 皂苷。来源于M3或F3幼苗的根提取物在至少7种情况下进行比较，结 果基本上相同。
Sad突变体的基因分析
杂交测试在Sad突变体和野生型A之间进行。测定黑燕麦的皂苷缺 乏表型是否由于单一突变。对来自突变体间杂交的F2代的分析鉴定了 在最初10个突变品系中的至少4个互补基团。将这些位点命名为Sad1 至Sad4(PapadopoulouK.等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 96：12923-1928)。对最初10个突变体品系的进一步分析测定了另外4 个位点，将其命名为Sad5至Sad8(QiX.等人，2004，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.101：8233-8238)。
在Sad5、Sad6、Sad7和Sad8突变体中进行对在燕麦根皂苷生物合 成(AsSCPL1、AsMT1和AsGT2)中包含的3个新基因的DNA序列分 析。在AsSCPL1中从C至T的单个核苷酸变化分别在突变体#587(Sad7) 和突变体#616(最初命名为Sad5)中的第137个氨基酸上引起从丝氨酸 至苯基丙氨酸的变化，在#376(Sad7)中的第79个氨基酸上引起从脯 氨酸至亮氨酸的变化(表1)。在AsSCPL1中已经发生点突变的新突变 体#19.1也通过筛选另外82个Sad突变体的基因组DNA进行分离，所 述突变体通过扩展基于减少的根部荧光的筛选(如上所述)进行鉴定， 并使用SurveyorMutationDetectionKit(Transgenomic)进行进一步分析。 通过PCR扩增靶cDNA。将来自两个突变品系的扩增产物混合。根据制 造商的说明书(TransgenomicCatNo.706025)进行异源双链核酸分子 形成及亚序列程序用于突变体检测。突变体#19.1包含一个点突变，预 测该点突变引起第463个氨基酸从苏氨酸至异亮氨酸的变化。在Sad5、 Sad6、Sad7或Sad8突变体的AsMT1和AsGT2基因中不存在核苷酸变 化。用突变体#19.1、#616和#376进行的等位性测试表明所有三个突变 体对应于一个单一位点，Sad7。这些数据证明突变体#616(它最初称为 Sad5)对应于位点Sad7。这些结果清楚的表明Sad7对应于丝氨酸羧肽 酶样蛋白AsSCPL1。AsSCPL1对于将酰基(在荧光燕麦根皂苷A-1和 B-1情况下为N-甲基邻氨基苯甲酸，在非荧光燕麦根皂苷A-2和B-2情 况下为苯甲酸)加入到燕麦根皂苷的三萜骨架来说是必需的。
实施例3
分离并表征Sad9燕麦突变体
最初的突变体#616、#825、#376和#1243(Papadopoulou等人1999. PNAS9612923-1928)在AsMT1和AsGT2基因中不包含任何核苷酸变 化。将序列分析扩展到82个新Sad突变体，所述突变体如实施例2所 述进行分离。将三个突变体M3品系(#195、#961和#1310)鉴定为在 AsMT1基因中具有点突变(表2)。在集合中的任何突变体在AsGT2 基因中未鉴定出突变。DNA序列分析证实在三个突变体(#195、#961 和#1310)中的编码序列中发生一个单核苷酸变化。预测这些核苷酸变 化中的每一个都将引起一个氨基酸变化(表2)。
这三个突变体的根缺乏与燕麦根皂苷A-1相关的亮蓝荧光，在UV 激发下呈暗紫荧光。将些突变体称为“紫色突变体”。将一个紫色更强 的突变体#841使用基于TLC的方法(表2)从82个新Sad突变体中鉴 定出来。如下文所述进行紫色突变体的代谢物分析。截取来自每个品系 的十个根尖(长度为0.5cm)，并将它们浸泡在500ul75％MeOH中， 浸泡时间介于一小时至过夜之间。在离心后将上清液转移至新管中，干 燥并将提取物重悬于20ul100％MeOH中。将十ul样本加到一个TLC 板上，并且所述TLC在ChCl3：MeOH：dH2O(13∶6∶1vol/vol/vol)中显影。 TLC板在UV激发下进行检查。包括#841的所有紫色突变体在TLC板 上具有清楚的紫色斑点。#841的序列分析证实在此突变体的编码区发生 从C至T的单核苷酸变化。预测此变化引起在氨基酸333处的丙氨酸变 成缬氨酸(参见表1)。
将紫色突变体彼此杂交(#195×#1310，#961×#1310，#195×#961) 用于等位性测试。通过序列分析在F1杂交体中的两个突变体等位基因， 确认了异质接合体。所有F1植物保留了“紫色根”表型。这些结果指 示三个紫色突变体是在相同基因tic位点处的突变等位基因，现在定义 为Sad9。基因数据、RNA表达数据(图3)和代谢物分析指示Sad9对 应于AsMT1，即在燕麦中的燕麦根皂苷生物合成中需要的甲基转移酶。 此甲基转移酶的功能可能是甲基化在荧光燕麦根皂苷A-1和B-1上的邻 氨基苯甲酸基。
实施例4
表征Sad基因簇中的葡糖基转移酶
在燕麦根皂苷基因簇中，在跨越Sad基因簇的BAC重叠群中的5 个五基因中的4个已经显示直接涉及燕麦根皂苷生物合成途径(Osbourn 等人，2007年3月6日，US，7,186,884B2；Osbourn等人，US2006-0112448 A1和实施例2和3)。然而，甚至鉴定了其它四个基因的多个突变等位 基因，AsGT2的突变体仍不在我们扩展的92个减少根部荧光突变体的 集合中。假如AsGT2是添加一个/多个糖到燕麦根皂苷三糖部分上所必 需的，AsGT2的功能损失不引起减少的根部荧光表型，因为加入荧光基 团(N-甲基邻氨基苯甲酸)不可能受到影响。其它可能性是具有功能性 冗佘或AsGT2突变是致死的。作为另外一种选择，AsGT2可催化酰基 葡萄糖中间体的形成，该中间体用于AsSCPL1介导的酰基化。因此证 明了AsGT2的生物化学功能。
为了测试AsGT2的功能，将AsGT2cDNA克隆到NovagenpET-19b 表达载体中并在大肠杆菌中表达如下：将包含所述表达构建体的大肠杆 菌细胞接种到LB琼脂上，该LB琼脂补充了34μg/mL氯霉素，50μg/mL 羧苄西林，2.5mM甜菜碱和0.6M山梨醇。表达细胞在37摄氏度生长过 夜。为了表达蛋白，使用固体培养基上的细胞接种到十个具有50mL补 充了上述成分的液体培养基的250mL烧瓶中。培养物在37摄氏度振荡 培养OD600的大约0.6。然后在加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导剂前 将培养物转移到16摄氏度振荡培养器中培养30分钟。然后在16摄氏 度振荡培养培养物过夜。
通过在4摄氏度、在7,000×g离心10分钟收获诱导细胞。将细胞 沉淀物重悬于5至10mL具有Roche无EDTA蛋白酶抑制剂(每50mL1 片)的溶解-结合缓冲液中(300mMNaCl，50mM磷钠，20mM咪唑， 5％甘油，pH7.8)。使用Frenchpress溶解细胞两次，始终在冰冷条件 下进行。将溶解产物在4摄氏度、在10,000g离心45分钟。在注射用 于流速为0.5mL/分钟的FPLC前用0.2μm注射器-过滤器过滤上清液。
使用预先填充的1mLHiTrap螯合HP柱(Amersham)和FPLC体系 进行FPLC。纯化柱按照制造商的推荐使用0.1MNiCl2充满。在样本注 射前使用溶解-结合缓冲液预平衡柱。在注射后，所述柱在用Elution缓 冲液B(300mMNaCl，50mM磷酸钠缓冲液，700mM咪唑，5％甘油， pH8.0)的梯度程序之前用溶解-结合缓冲液洗涤30分钟至1小时。
表3：从HiTrap螯会HP柱中洗脱番白的条件
时间(分钟) ％B mL/分钟 0 8 1.0 20 10 1.0 40 100 1.0 50 100 1.0
冰上收集1mL的洗脱片段，20mL用于在10％PAGE体系上显影结 果。受关注的片段在4摄氏度合并并透析过夜，使用50mM磷酸钠缓 冲液，pH7.5，具有50％甘油和2mMMgCl2。等分试样在液氮中迅速冷 冻并在-80摄氏度下储存。
利用复合物受体底物的放射性检测分析法被用于检测具有纯底物 或浓缩底物的低水平活性。该检测分析法包含4mL14C-UDP-葡萄糖，25 mL50mM磷酸钾缓冲液，pH7.6，在DMSO中的0.25mL100mM受体 底物，5mL透析过的蛋白制备物，和3mL10mMDTT。反应在28摄氏 度，轻柔振荡条件下进行2.5小时，然后加入50mL氯仿∶甲醇(2∶1) 终止反应。用氯仿甲醇再抽提含水相三次，并合并溶剂相。在60摄氏 度下干燥提取物并将其重悬在40mL氯仿∶甲醇中。也干燥含水相并重 悬于水中。将15mL提取物载入硅胶TLC板中，用氯仿∶甲醇∶水(13∶6∶1) 对标准品进行层析。
受试的受体底物是β-香树素-阿拉伯糖苷、苯甲酸和水杨酸。受试 的糖供体是D-葡萄糖和L-阿拉伯糖。
为了确认通过放射性检测分析法显影的产物的化学结构，开发了一 种非放射性的LC-MS检测分析法。此检测分析法包括10mL20mMUDP- 葡萄糖或UDP-阿拉伯糖，60mL50mM磷酸钾，pH7.6，2mL1MMgCl2， 在DMSO中的4mL100mM受体底物(或8mL合成底物，DMSO仅作 对照物)，20rnL蛋白制品，10mL100mMDTT。反应在28度轻柔振荡 培养3.5小时。通过加入100％甲醇终止反应，然后在50摄氏度从反应 中蒸发甲醇，并通过LC/MS/MS使用反相层析样本(10μ1)进行分析， 使用100×2mm3μLunaC18(2)柱(Phenomenex)，在250μL.min-1， 30℃，以如下甲醇+0.1％甲酸对水+0.1％甲酸梯度运行：
表4：用于反相色谱法的甲醇梯度。
时间(分钟) ％MeOH 0 10 40 95 41 10 48 10
通过UV(214nm，带宽9nm，光谱范围200至600nm)和电喷雾 MS进行检查，在分开的运行周期中以正离子或负离子模式。喷雾室条 件为50单位鞘气，无aux/扫描，5.2kV的正离子喷雾电压，5.0kV的负 离子模式电压，毛细管温度325℃。数据依赖性的MS2的第二扫描事件 通过在5.0amu的分离宽度处的俘获和35％碰撞能量处的破碎来进行。
结果如表4所示。A“+”表示活性。
表5：AsGT2对苯甲酸和水杨酸盐底物的活性。
由于与层析和检测相关的技术问题，AsGT2对β-香树素-阿拉伯糖 苷的活性的检测分析是非决定性的。然而，苯甲酸和水杨酸的结果清楚 的表明AsGT2对底物具有葡糖基转移酶功能，所述底物具有环结构，类 似于β-香树素。结合所述事实，类似于途径中的其它酶，AsGT2仅在 根部表达并且所述基因位于燕麦根皂苷生物合成基因簇中，这些结果表 明此基因编码燕麦根皂苷合成所需的葡糖基转移酶。
实施例5
在其它物种中表达AsSCPL1的重组DNA构建体
下文是重组DNA构建体的实施例，可使用它们在单子叶植物或双 子叶植物物种中表达AsSCPL1，使用玉米或大豆作为实施例。使用组成 型启动子，本领域的技术人员将会知道，取决于靶病原体或其它考虑因 素，靶向启动子如那些在本文中更早描述的实施例中的启动子，由于所 述植物材料的特殊终用途，可以是相同的或甚至更有效的或优选的。取 决于物种和物种中存在的酶活性，可包括来自生物合成途径中的其它基 因以提高表达水平。
在下文实施例中使用以下用于包含不同组分的核酸片段的缩写：
“RB”和“LB”对应于T-DNA的右边界和左边界。
“CAMV35SENH”是花椰菜花叶病毒35S启动子的启动子区域， 它提高与其连接的启动子的表达水平(BenfeyP.N.等人，1990，EMBOJ. 9：1685-1696)。
“UBIPRO”是玉米泛素基因的启动子，已对其进行过描述 (Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18：675-689)。
“UBI5’UTR”是相同玉米泛素基因的5’前导区域。
“UBIINTRON1”是相同泛素基因的内含子。包含此内含子已经证 明可提高表达水平。
“ATTR1”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点 (Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。
“CCDB”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的细菌阴性选择性标 记。
“ATTR2”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点。
“PINII”是来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的转录终止基因。
“CAMV35SPRO”是花椰菜花叶病毒35S基因的启动子，它是植 物中常用的组成型启动子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313：810-812)。
“ADH1INTRON1”是玉米ADH1基因的内含子。包含此内含子已 经证明能提高表达水平(LuehrsenK.R.和WalbotV.，1991，Mol.Gen. Genet.225：81-93)。
“BAR”是常用作玉米转化选择性标记的抗除草剂性基因。
“SCP1”是用于植物的合成组成型启动子，它描述于美国专利公开 6,072,050中。
“OMEGA5’UTR”是烟草花叶病毒基因的5’前导区域，已经证 明它的使用能够提高翻译水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyof RNA，编辑Cech(Liss，NewYork)，第237-256页)。
“SPC1”是提供壮观霉素抗性的多肽的编码区域，它允许细菌选择 Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mol.Gen.Genet.228：316-319。
“ColE1ORI”是大肠杆菌中的功能性DNA复制起点。
在玉米中表达皂苷生物合成基因的构建体
从实施例1中所述的克隆中分别获取包含AsSCPL1的开放阅读框 的片段。用导致开放阅读框侧面接有独特限制性位点的引物进行PCR 扩增，所述限制性位点使得它们能定向克隆到这些经修饰的GatewayTMEntryVector(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)的独特限制性位 点中。在将所述片段连接到GatewayTMEntryVector后，“入门载体”由 ATTL1-AsSCPL1-ATTL2组成，并包含用于细菌选择的卡那霉素抗性。 ATTL1和ATTL2是在InvitrogenGatewayTM克隆体系(Carlsbad， California，USA)中提供的重组位点。
玉米重组DNA构建体1：E35S-UBI-AsSCPL1-PINII
此构建体能用于在玉米中单独表达AsSCPL1基因。将AsSCPL1入 门载体用于GatewayTMLR与GatewayTM经修饰的土壤杆菌载体主链(从 pSB1修饰得到)的反应(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10：165-174)， 这通过在cos位点加入以下组分：RB-CAMV35SENH-UBIPRO-UBI 5’UTR-UBIINTRON1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35S ENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB-SPC-ColE1ORI。 在此GatewayTM反应中，ATTL1和ATTL2与ATTR1和ATTR2重组，因 此将AsSCPL1基因转移到目的载体中替代CCDB，CCDB对大肠杆菌来 说是有毒性的，并使得能够如GatewayTM手册(Invitrogen，Carlsbad， California，USA)中所述筛选成功的克隆。此所得构建体包含一个 T-DNA，它将被转移到植物基因组中并包含RB-CAMV35SENH-UBI PRO-UBI5’UTR-UBIINTRON1-ATTB1-AsSCPL1-ATTB2-PINII+ CAMV35SENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB。在 RB和LB之间的区域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除 了SPC和ColE1组分之外。将此构建体电穿孔进入LBA4404根癌土壤 杆菌细胞中并用于转化实验如那些在下文实施例8中所述的实验。
在大豆中表达皂苷生物合成基因的构建体
如上所述通过PCR扩增获取AsSCPL1开放阅读框用于玉米构建体。
大豆重组DNA构建体1：SCP1-O’-AsSCPL1-PINII
此构建体能用于在双子叶中单独表达AsSCPL1基因。在将一个包 含AsSCPL1开放阅读框的多核苷酸连接到包含SCP1PRO-ω5’UTR- 独特限制性位点，相同于那些侧接的AsSCPL1-PINII位点的载体中之后， 线性化质粒用于轰击并从凝胶中提取所需DNA条带。此过程也移除编 码用于细菌选择的氨苄青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCP1PRO-ω 5’UTR-AsSCPL1-PINII并用于如下文实施例9所述的大豆转化。
实施例6
在其它物种中表达AsMT1的重组DNA构建体
下文是重组DNA构建体的实施例，可使用它们在单子叶植物或双 子叶植物物种中表达AsMT1，使用玉米或大豆作为实施例。使用组成型 启动子，本领域的技术人员将会知道，取决于靶病原体或其它考虑因素， 靶向启动子如那些在本文中更早描述的实施例中的启动子，由于所述植 物材料的特殊终用途，可以是相同的或甚至更有效的或优选的。取决于 物种和物种中存在的酶活性，可包括来自生物合成途径中的其它基因以 提高表达水平。
在下文实施例中使用以下用于包含不同组分的核酸片段的缩写：
“RB”和“LB”对应于T-DNA的右边界和左边界。
“CAMV35SENH”是花椰菜花叶病毒35S启动子的启动子区域， 它提高与其连接的启动子的表达水平(BenfeyP.N.，等人，1990，EMBO J.9：1685-1696)。
“UBIPRO”是玉米泛素基因的启动子，已对其进行过描述 (Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18：675-689)。
“UBI5’UTR”是相同玉米泛素基因的5’前导区域。
“UBIINTRON1”是相同泛素基因的内含子。包含此内含子已经证 明可提高表达水平。
“ATTR1”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点 (Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。
“CCDB”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的细菌阴性选择性标 记。
“ATTR2”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点。
“PINII”是来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的转录终止基因。
“CAMV35SPRO”是花椰菜花叶病毒35S基因的启动子，它是植 物中常用的组成型启动子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313：810-812)。
“ADH1INTRON1”是玉米ADH1基因的内含子。包含此内含子已 经证明能提高表达水平(LuehrsenK.R和WalbotV.，1991，Mol.Gen. Genet.225：81-93)。
“BAR”是常用作玉米转化选择性标记的抗除草剂性基因。
“SCP1”是用于植物的合成组成型启动子，它描述于美国专利公开 6,072,050中。
“OMEGA5’UTR”是烟草花叶病毒基因的5’前导区域，已经证 明它的使用能够提高翻译水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyof RNA，编辑Cech(Liss，NewYork)，第237-256页)。
“SPC1”是提供壮观霉素抗性的多肽的编码区域，它允许细菌选择 Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mo1.Gen.Genet.228：316-319。
“ColE1ORI”是大肠杆菌中的功能性DNA复制起点。
在玉米中表达皂苷生物合成基因的构建体
从实施例1中所述的克隆中分别获取包含AsMT1的开放阅读框的 片段。用导致开放阅读框侧面接有独特限制性位点的引物进行PCR扩 增，所述限制性位点使得它们能定向克隆到这些经修饰的GatewayTMEntryVector(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)的独特限制性位 点中。在将所述片段连接到GatewayTMEntryVector后，“入门载体”由 ATTL1-AsMT1-ATTL2组成，并包含用于细菌选择的卡那霉素抗性。 ATTL1和ATTL2是在InvitrogenGatewayTM克隆体系(Carlsbad， California，USA)中提供的重组位点。
玉米重组DNA构建体1：E35S-UBI-AsMT1-PINII
此构建体能用于在玉米中单独表达AsMT1基因。将AsMT1入门载 体用于GatewayTMLR与GatewayTM经修饰的土壤杆菌载体主链(从pSB1 修饰得到)的反应(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10：165-174)，这 通过在cos位点加入以下组分：RB-CAMV35SENH-UBIPRO-UBI 5’UTR-UBIINTRON1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35S ENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB-SPC-ColE1ORI。 在此GatewayTM反应中，ATTL1和ATTL2与ATTR1和ATTR2重组，因 此将AsMT1基因转移到目的载体中替代CCDB，CCDB对大肠杆菌来 说是有毒性的，并使得能够如GatewayTM手册(Invitrogen，Carlsbad， California，USA)中所述筛选成功的克隆。此所得构建体包含一个 T-DNA，它将被转移到植物基因组中并包含RB-CAMV35SENH-UBI PRO-UBI5’UTR-UBIINTRON1-ATTB1-AsMT1-ATTB2-PINII+ CAMV35SENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB。在RB 和LB之间的区域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除了 SPC和ColE1组分之外。将此构建体电穿孔进入LBA4404根癌土壤杆 菌细胞中并用于转化实验如那些在下文实施例8中所述的实验。
在大豆中表达皂苷生物合成基因的构建体
如上所述通过PCR扩增获取AsMT1开放阅读框用于玉米构建体。
大豆重组DNA构建体1：SCP1-O’-AsMT1-PINII
此构建体能用于在双子叶植物中单独表达AsMT1基因。在将一个 包含AsMT1开放阅读框的多核苷酸连接到包含SCP1PRO-ω5’UTR- 独特限制性位点，相同于那些侧接的AsMT1-PINII位点的载体中之后， 线性化质粒用于轰击并从凝胶中提取所需DNA条带。此过程也移除编 码用于细菌选择的氨苄青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCP1PRO-ω 5’UTR-AsMT1-PINII并用于如下文实施例9所述的大豆转化。
实施例7
在其它物种中表达AsGS2的重组DNA构建体
下文是重组DNA构建体的实施例，可使用它们在单子叶植物或双 子叶植物物种中表达AsGS2，使用玉米或大豆作为实施例。使用组成型 启动子，本领域的技术人员将会知道，取决于靶病原体或其它考虑因素， 靶向启动子如那些在本文中更早描述的实施例中的启动子，由于所述植 物材料的特殊终用途，可以是相同的或甚至更有效的或优选的。取决于 物种和物种中存在的酶活性，可包括来自生物合成途径中的其它基因以 提高表达水平。
在下文实施例中使用以下用于包含不同组分的核酸片段的缩写：
“RB”和“LB”对应于T-DNA的右边界和左边界。
“CAMV35SENH”是花椰菜花叶病毒35S启动子的启动子区域， 它提高与其连接的启动子的表达水平(BenfeyP.N.，等人，1990，EMBO J.9：1685-1696)。
“UBIPRO”是玉米泛素基因的启动子，已对其进行过描述 (Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18：675-689)。
“UBI5’UTR”是相同玉米泛素基因的5’前导区域。
“UBIINTRON1”是相同泛素基因的内含子。包含此内含子已经证 明可提高表达水平。
“ATTR1”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点 (Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。
“CCDB”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的细菌阴性选择性标 记。
“ATTR2”是在GatewayTM克隆体系手册中描述的重组位点。
“PINII”是来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的转录终止基因。
“CAMV35SPRO”是花椰菜花叶病毒35S基因的启动子，它是植 物中常用的组成型启动子(OdellJ.T.等人，1985，Nature313：810-812)。
“ADH1INTRON1”是玉米ADH1基因的内含子。包含此内含子已 经证明能提高表达水平(LuehrsenK.R和WalbotV.，1991，Mol.Gen. Genet.225：81-93)。
“BAR”是常用作玉米转化选择性标记的抗除草剂性基因。
“SCP1”是用于植物的合成组成型启动子，它描述于美国专利公开 6,072,050中。
“OMEGA5’UTR”是烟草花叶病毒基因的5’前导区域，已经证 明它的使用能够提高翻译水平(Gallie等人，1989，MolecularBiologyof RNA，编辑Cech(Liss，NewYork)，第237-256页)。
“SPC1”是提供壮观霉素抗性的多肽的编码区域，它允许细菌选择 Svab，Z.和Maliga，P.，1991，Mol.Gen.Genet.228：316-319。
“ColE1ORI”是大肠杆菌中的功能性DNA复制起点。
在玉米中表达皂苷生物合成基因的构建体
从实施例1中所述的克隆中分别获取包含AsGS2的开放阅读框的片 段。用导致开放阅读框侧面接有独特限制性位点的引物进行PCR扩增， 所述限制性位点使得它们能定向克隆到这些经修饰的GatewayTMEntry Vector(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)的独特限制性位点中。 在将所述片段连接到GatewayTMEntryvector后，“入门载体”由ATTL1- AsGS2-ATTL2组成，并包含用于细菌选择的卡那霉素抗性。ATTL1和 ATTL2是在InvitrogenGatewayTM克隆体系(Carlsbad，California，USA) 中提供的重组位点。
玉米重组DNA构建体1：E35S-UBI-AsGS2-PINII
此构建体能用于在玉米中单独表达AsGS2基因。将AsGS2入门载 体用于GatewayTMLR与GatewayTM经修饰的土壤杆菌载体主链(从pSB1 修饰得到)的反应(Komari，T.等人，1996，PlantJ.10：165-174)，这 通过在cos位点加入以下组分：RB-CAMV35SENH-UBIPRO-UBI 5’UTR-UBIINTRON1-ATTR1-CCDB-ATTR2-PINII+CAMV35S ENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB-SPC-ColE1ORI。 在此GatewayTM反应中，ATTL1和ATTL2与ATTR1和ATTR2重组，因 此将AsGS2基因转移到目的载体中替代CCDB，CCDB对大肠杆菌来说 是有毒性的，并使得能够如GatewayTM手册(Invitrogen，Carlsbad， California，USA)中所述筛选成功的克隆。此所得构建体包含一个 T-DNA，它将被转移到植物基因组中并包含RB-CAMV35SENH-UBI PRO-UBI5’UTR-UBIINTRON1-ATTB1-AsGS2-ATTB2-PINII+ CAMV35SENH-CAMV35SPRO-ADH1INTRON1-BAR-PINII-LB。在RB 和LB之间的区域外核苷酸序列描述于Kormai，T.等人，opcit.，除了 SPC和ColE1组分之外。将此构建体电穿孔进入LBA4404根癌土壤杆 菌细胞中并用于转化实验如那些在下文实施例8中所述的实验。
在大豆中表达皂苷生物合成基因的构建体
如上所述通过PCR扩增获取AsGS2开放阅读框用于玉米构建体。
大豆重组DNA构建体1：SCP1-O’-AsGS2-PINII
此构建体能用于在双子叶植物中单独表达AsGS2基因。在将一个包 含AsGS2开放阅读框的多核苷酸连接到包含SCP1PRO-ω5’UTR-独 特限制性位点，相同于那些侧接的AsGS2-PINII位点的载体中之后，线 性化质粒用于轰击并从凝胶中提取所需DNA条带。此过程也移除编码 用于细菌选择的氨苄青霉素抗性的核苷酸。此片段包含SCP1PRO-ω 5’UTR-AsGS2-PINII并用于如下文实施例9所述的大豆转化。
实施例8
土壤杆菌介导的玉米的转化
和转基因植物的再生
在实施例5至7中制备的重组DNA构建体可用于制备如下的转基 因玉米植物。
可使用Zhao(美国专利公开5,981,840，以及PCT专利公布 WO98/32326)的方法，用如实施例5-7中所述的任何多核苷酸构建体转 化玉米。简而言之，从玉米中分离未成熟胚芽并使胚芽接触土壤杆菌悬 浮液，其中所述细菌能够将多核苷酸构建体转移到至少一个未成熟胚芽 的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在此步骤中将未成熟胚芽浸 入土壤杆菌悬浮液中用于启动接种。胚芽与土壤杆菌共培养一段时间 (步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，未成熟胚芽在固体培养基上 培养。紧接着此共培养时期，进行任选的“休眠”步骤。在此休眠步骤 中，胚芽培养在存在至少一种已知抗生素以抑制土壤杆菌生长，同时不 加入植物转化体选择剂的环境中进行(步骤3：休眠步骤)。将未成熟 胚芽培养在具有抗生素但无选择剂的固体培养基上，用于消除土壤杆菌 以及受感染细胞的休眠阶段。接下来，将接种胚芽在包含选择剂的培养 基中培养，并回收生长的经转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。愈伤 组织然后在植物中再生(步骤5：再生步骤)，并且在选择培养基中生 长的愈伤组织在固体培养基中进行培养以再生所述植物。
实施例9：
用大豆表达载体转化大豆体细胞胚培养物
并再生大豆植物
在实施例5至7中制备的重组DNA构建体可用于制备如下的转基 因大豆植物。
培养条件：
将大豆胚芽发生悬浮培养物(cv.Jack)培养于35mL液体SB196 培养基(参见下文)，培养条件为150rpm摇床培养、26℃和按16∶8小 时昼/夜光周期以60-85μE/m2/s光强用白色冷光荧光灯照射。每7天至 两周通过接种大约35mg组织到35mL新鲜液体SB196中对培养物进行 传代培养(优选的传代培养间隔为每隔7天)。
大豆胚芽发生悬浮培养物用大豆表达质粒转化，所有转化均使用 DuPontBiolisticPDS1000/HE仪(氦气改型)，通过粒子枪轰击(Klein 等人，Nature327：70(1987))方法进行。
大豆胚胎生成悬浮培养物的诱导：
大豆培养物每月启动两次，在每次启动之间间隔5至7天。在种植 后45至55天内采集可用大豆植物的带未成熟种籽的豆荚。从豆荚中移 除种籽并置于无菌magenta盒中。大豆种籽通过在5％次氯酸钠溶液与 1滴象牙皂(即，95mL高压釜蒸馏水力5mL次氯酸钠和1滴皂，充分 混合)中摇动15分钟进行无菌处理。种籽使用2个1升瓶的无菌蒸馏 水漂洗，将那些小于4mm的种籽置于单个显微镜载片上。切下种籽的 小末端，并将子叶挤出种籽壳。将子叶转移到包含SB1培养基(每板 25至30个子叶)的板中。用纤维带将平板打包并在温度26℃，冷白荧 光灯光周期16∶8小时昼/夜，光照强度60至80μE/m2/s下培养八周，4 周后更换培养基。在SB1培养基上接种后，切下第二个胚芽并将其放入 SB196液体培养基7天。
用于轰击的DNA的准备：
完整质粒或包含受关注基因和选择性标记基因的DNA质粒片段被 用于轰击。通过凝胶分离消化过的质粒获取来自大豆表达质粒的片段， 本文描述了所述质粒的构建。在各种情况下，100μg质粒DNA被用于 下文所述的0.5mL特定酶混合物。质粒用AscI(100单位)在NEBuffer 4(20mMTris乙酸，10mM乙酸镁，50mM乙酸钾，1mM二硫苏糖醇， pH7.9)，100μg/mLBSA，和5mMβ-巯基乙醇中，在37℃下消化1.5 小时。所得DNA片段通过凝胶电泳在1％的SeaPlaqueGTG琼脂糖上 (BioWhitakerMolecularApplications)分离，并从琼脂糖凝胶上切下包 含基因盒的DNA片段。使用GELase消化酶，按照制造商的规程从琼脂 糖中纯化DNA。
将包含3mg金粉(3mg金)的无菌蒸馏水的50μL等分试样加入 30μL10ng/μLDNA溶液(如本文所述制备的DNA片段)，25μL5M CaCl2，和20μL0.1M亚精胺中。将混合物在涡旋振荡器3档摇动3分 钟并在台式离心机中旋转10秒。移除上清液，然后用400μL100％乙 醇洗涤并进行另一次简单离心。移除400μL乙醇，并将离心沉淀重悬 于40μL的100％乙醇中。将五μLDNA悬浮液分配到Biolistic PDS1000/HE仪盘的每个浮动盘中。每5μL等分试样每次轰击(例如每 盘)包含大约0.375mg金。
组织制备和用DNA轰击：
将大约150至200mg的七天龄胚芽发生悬浮培养物置于一个空的无 菌60×15mm培养皿中，并用塑料网覆盖该培养皿。将室排空至真空度 为27至28英寸汞柱，每个平板的组织轰击一或两发，将膜破裂压力设 为1100PSI。将组织放置在距离保留/停止筛网大约3.5英寸处。
转化胚的选择：
使用氯磺隆选择转化过的胚芽(当使用乙酰乳酸合酶(ALS)基因 作为选择性标记时)。
在轰击后，将组织置于新制SB196培养基中并如上所述进行培养。 轰击后六至八天，将SB196更换为包含100ng/mL氯磺隆的新鲜SB196 培养基。选择培养基每周更新。选择后四至六周，观察到从未转化的坏 死胚芽发生簇中生长出绿色转化组织。将绿色组织分离，接种至多孔板， 以产生新的、克隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。
胚胎的成熟：
将来自生产转化的转化过的胚芽发生簇在多孔板中如上所述培养 四至六周，培养在26℃下，在SB196中，在冷白荧光(Phillips冷白 EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)灯泡(40瓦特) 下以16∶8小时的光周期以及90至120μE/m2s的光照强度进行。一段时 间后，将胚芽簇移到固体琼脂培养基、SB166中培养一至两周，然后传 代培养到SB103培养基中3至4周，得到成熟胚芽。在板上、SB103中 成熟后，将单个胚芽从簇中移除、干燥并筛选所需表型。此类表型可以 是但不限于改变的皂苷水平或改变的对至少一种真菌的抗性水平。当需 要的时，从下文所述的一些事件中获取植物。
胚芽干燥和发芽：
成熟的单个胚芽通过置于空的小培养皿(60×15mm)中大约四至 七天进行脱水。平皿用纤维带(创造出一个低湿度室)密封。将脱水胚 芽植入SB71-4培养基，使其在与上述培养条件相同的条件下发芽生长。 从发芽培养基中取出发芽的苗并用水彻底冲洗，然后将其植入24孔托 盘中的Redi-Earth中，用透明塑料罩覆盖。一至二周后移除塑料罩，再 硬化植株一周。如果幼苗看上去坚硬，则将它们移植到Redi-Earth的10 英寸盆中，每盆最多3株幼苗。在十至十六周后，收获成熟种子，磨碎 并用于所需表型分析。
培养基配方：
SB196-FNLite液体增殖培养基(每升)
FNLite储备液
SB1固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
1mLB5维生素1000X储备液
31.5g葡萄糖
2mL2，4-D(20mg/L终浓度)
pH5.7
8gTC琼脂
SB199固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
1mLB5维生素1000X储备液
30g蔗糖
4ml2，4-D(终浓度40mg/L)
pH7.0
2g固化剂
SB166固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
1mLB5维生素1000X储备液
60g麦芽糖
750mgMgCl2六水合物
5g活性炭
pH5.7
2g固化剂(gelrite)
SB103固体培养基(每升)
1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)
1mLB5维生素1000X储备液
60g麦芽糖
750mgMgCl2六水合物
pH5.7
2g固化剂(gelrite)
SB71-4固体培养基(每升)
1瓶Gamborg′sB5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat.No.21153-036)
pH5.7
5gTC琼脂
2，4-D储备液
PhytotechCat.No.D295预配液-浓度1mg/mL
B5维生素储备液(每100mL)
分装保存于-20℃
10g肌醇
100mg烟酸
100mg盐酸吡哆醇
1g硫胺素
若溶解不够迅速，可将溶液用热搅拌器加以微热。
SB228-大豆组织分化知成熟培养基(SHaM)(每升)
调整体积至900mL
pH5.8
高压灭菌
加入到冷却培养基中(≤30℃)：
*谷氨酰胺(终浓度30mM)4％110mL
*注意：加入谷氨酰胺后，终体积将变为1010mL。
由于谷氨酰胺降解相当迅速，它优选在使用培养基前现加。培养基 在谷氨酰胺加入后2周过期；不含谷氨酰胺的基本培养基可存放更长时 间。
用于SHAM的FN-liteMacro10X-储备液#1(每升)
加水至终体积
高压灭菌
MSMicro1000X-储备液#2(每1升)
加水至终体积
高压灭菌
FeEDTA100X-储备液#3(每升)
Na2EDTA*(EDTA钠)3.73g
FeSO4*7H2O(硫酸铁七水合物)2.78g
*在加入铁离子前EDTA必须完全溶解。
加水至终体积
此溶液对光敏感。盛装的瓶子应以铝箔包裹以避光。高压灭菌
Ca100X-储备液#4(每升)
CaCl2*2H2O(氯化钙二水合物)44g
加水至终体积
高压灭菌
B5维生素1000X-储备液#5(每升)
4％谷氨酰胺-储备液#6(每升)
将DDI水加热到30℃900mL
L-谷氨酰胺40g
边搅拌边逐渐加入并施以微热。
不超过35℃。
加水至终体积
过滤除菌
冷冻保存*
*注意：储备液在31℃热解冻，水浴以完全溶解晶体。
氯磺隆储备液
1mg/mL在0.01N氢氧化铵中