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1、(10)申请公布号 CN 103614333 A (43)申请公布日 2014.03.05 CN 103614333 A (21)申请号 201310568972.6 (22)申请日 2013.11.15 C12N 5/07(2010.01) C12N 5/071(2010.01) C12N 5/02(2006.01) (71)申请人 乔自林 地址 730000 甘肃省兰州市城关区西北新村 1 号 申请人 马忠仁 令世鑫 冯玉萍 冯若飞 李明生 王家敏 (72)发明人 冯玉萍 乔自林 令世鑫 李明生 冯若飞 王家敏 马忠仁 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 。
2、代理人 张秋云 (54) 发明名称 一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物 细胞的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用胶原微载体在反应器中 扩大培养动物细胞的方法， 是将微载体处理后， 以胰蛋白酶将微载体和细胞进行消化， 再将细胞 逐步进行扩大培养。本发明的有益效果为 ： 本 发明提供的一种用胶原微载体在反应器中扩大 培养动物细胞的方法， 其采用反应器和国产的胶 原微载体扩大培养细胞的工艺， 培养规模从方瓶 （0.25-2L 悬浮培养瓶） （5-7.5L 反应器） （50-120L 反应器） 250L 反应器线性放大 , 从 根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技 术工艺， 该工艺操作。
3、简单， 将对现有疫苗工艺进行 技术升级的同时， 降低了疫苗的生产成本， 提高产 品产量和质量， 在实际生产中具有应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 103614333 A CN 103614333 A 1/2 页 2 1. 一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤 ： 1） 微载体处理 ： 将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡， 再以PBS平衡盐溶液清洗后， 转入至反应器或 悬浮培养瓶中， 高压灭菌， 冷却。
4、静置， 以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积 的含新生小牛血清的细胞培养液备用 ； 2） 胰蛋白酶消化微载体和细胞 ： 消化 1g 长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为 0.25% 的胰蛋白酶 25-50ml 的比 例使用胰蛋白酶 ； 3） 细胞扩大培养 ： 从方瓶 0.25-2L 悬浮培养瓶 5-7.5L 反应器 50-120L 反应器 250L 反应器 线性放大。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法， 其 特征在于， 所述步骤 1） 中的微载体处理， 是按照以下步骤进行的 ： a） 所述胶原微载体为 GF-240 型微载体， 将 GF。
5、-240 型微载体用含体积百分含量为万分 之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h， 期间搅拌一次使之充分浸泡， 纯化水的用量为每1g微 载体浸泡需 20-100ml 含吐温的纯化水 ； b）将步骤 a）处理的微载体弃纯化水， 用 PBS 平衡盐溶液洗 2 次， 每次清洗 1g 微载 体需要 20-100mlPBS 平衡盐溶液， 所述 PBS 平衡盐溶液的 pH 值为 7.20.1, 渗透压在 290-320mmol/kg 之间 ； c） 将步骤 b） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐沉溶液， 用 PBS 平衡盐溶液制成 2-20g/L 的 浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中， 连同反应器或悬浮培养。
6、瓶以 121高压蒸汽灭菌 30min， 自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置 30min 以上， 所述 PBS 平衡盐溶液 的 pH 值为 7.20.1, 渗透压在 290-320mmol/kg 之间 ； d） 将步骤 c） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐溶液， 用含体积百分含量 10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液洗 1 遍后再加相同体积的含体积百分含量 2%-10% 的新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液备用 ； 洗 1g 微载体需要 20-50ml 含体积百分含量 10% 新生小牛血清 NBCS 的 细胞培养液。 3. 根据权利要求 2 所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大。
7、培养动物细胞的方法， 其 特征在于， 所述细胞扩大培养的过程包括以下步骤 ： A） 细胞复苏与扩增培养 ： 按常规方法复苏细胞， 在含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血 清 NBCS 的细胞培养液培养至单层， 按常规方法用质量百分比浓度为 0.25%-1% 胰蛋白酶消 化传代细胞至总量达下述 B） 所需的量 ； B） 悬浮细胞瓶微载体培养细胞 ： 将上述步骤 A） 的细胞按常规方法消化， 按每个载体 上 10-50 个细胞的比例接种到微载体添加量为 2-20g/L 的悬浮培养瓶中培养， 加含体积 百分含量 8-10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积的 40-100%, 培。
8、养温度为 371， 培养前 3-12h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 20-50rpm 固定转速搅拌， 培养 12h 后加含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积 100%， 从培 养时起每隔 12-24h 取样观察细胞生长情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余 权 利 要 求 书 CN 103614333 A 2 2/2 页 3 量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 8%-10%NBCS 的 DMEM 培养液， 以保证 反应器中培养液的葡萄糖含量 1g/L， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层 ； 所述间 歇搅拌是搅拌 3-。
9、5min, 停止 20-60min, 再搅拌 3-5min 的反复搅停过程， 其中搅拌转速为 20-50rpm ； C） 悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞 ： 将上述步骤 B） 的细胞， 以步骤 1） 中步骤 b） 的 方法以 25-38预热的 PBS 平衡盐溶液洗两次， 按每克载体用 10-50ml 质量百分比浓度为 0.25%-1% 胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态， 加入新生小牛血 清 NBCS 中和 1-3min， 用备好的原微载体 2-8 倍的量的微载体进行再培养， 培养方法按上述 步骤 B） 进行， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层 ； 其中， 中和胰蛋。
10、白酶用新生小牛血 清 NBCS 的量是以酶解消化用胰蛋白酶按质量百分比浓度 0.25% 计算的量的 40%-60% ； D） 5-7.5L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 C）处理得到的细胞悬液， 同备好的原 微载体 2-6 倍的量的微载体接种 5-7.5L 反应器中培养， 加含体积百分含量 8%-10% 新生 小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积的 40-60%， 反应器的参数设置为 ： 温度 37、 pH7.1-7.3、 溶氧 20-80%， 转速 20-100rpm， 培养前 3-12h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 20-100rpm 固定转速搅拌， 培养 12h 后加含。
11、体积百分含量 8-10% 新生小牛血清 NBCS 的细 胞培养液至培养终体积的 100%， 从培养时起每隔 12-24h 取样观察细胞生长情况、 计数细 胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血清 NBCS 的 DMEM 培养液， 以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量 1g/L， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层为止 ； E） 50L 及以上反应器扩大培养细胞 ： 用上述步骤 D） 培养得到的细胞， 将 5-7.5L 反应器 的细胞按步骤 D） 逐级扩大培养至 50-120L 反应器 250 L 反应器线性放大。 权 利 。
12、要 求 书 CN 103614333 A 3 1/8 页 4 一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养领域， 具体涉及用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞 的方法。 背景技术 0002 目前， 我国大多数疫苗仍采用传统的转瓶贴壁培养细胞的工艺生产， 如兽用的猪 繁殖与呼吸综合征疫苗 （蓝耳病疫苗） 、 猪圆环病毒疫苗、 猪细小病毒疫疫苗、 猪瘟病毒疫苗 和羊痘疫苗等， 人用的有乙脑疫苗、 甲肝疫苗和水痘疫苗等。 传统工艺生产的疫苗存在批间 差大、 批量小， 建设厂方面积大， 生产过程人力物力投入大， 总体来说生产成本高、 产品质量 不稳定。近几。
13、年有些品种的疫苗采用了反应器培养的工艺， 如猪瘟疫苗采用了反应器纸片 载体培养细胞的工艺， 狂犬病疫苗采用了反应器微载体培养工艺， 但最大的培养体积只有 35L。 这些工艺由于解决不了细胞线扩大培养工艺难题而使规模不能线性放大， 并且这些工 艺中所用的培养载体 （如纸片载体和微载体） 都是进口的， 生产成本高。 发明内容 0003 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷， 提供了一种操作简单， 成本低廉 的用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法。 0004 为了实现上述目的， 本发明提供的技术方案为 ： 一种用胶原微载体在反应器中扩 大培养动物细胞的方法， 包括以下步骤 ： 1） 微载。
14、体处理 ： 将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡， 再以PBS平衡盐溶液清洗后， 转入至反应器或 悬浮培养瓶中， 高压灭菌， 冷却静置， 以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积 的含新生小牛血清的细胞培养液备用 ； 2） 胰蛋白酶消化微载体和细胞 ： 消化 1g 长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为 0.25% 的胰蛋白酶 25-50ml 的比例使用胰蛋白酶 ； 3） 细胞扩大培养 ： 从方瓶 0.25-2L 悬浮培养瓶 5-7.5L 反应器 50-120L 反应器 250L 反应器 线性放大。 0005 进一步的， 上述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法， 所述 步。
15、骤 1） 中的微载体处理， 是按照以下步骤进行的 ： a） 所述胶原微载体为 GF-240 型微载体， 将 GF-240 型微载体用含体积百分含量为万分 之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h， 期间搅拌一次使之充分浸泡， 纯化水的用量为每1g微 载体浸泡需 20-100ml 含吐温的纯化水 ； b） 将步骤 a） 处理的微载体弃纯化水， 用无 Ca2+、 Mg2+的 PBS 平衡盐溶液洗 2 次， 每次清 洗 1g 微载体需要 20-100mlPBS 平衡盐溶液， 所述 PBS 平衡盐溶液的 pH 值为 7.20.1, 渗 说 明 书 CN 103614333 A 4 2/8 页 5 透压在。
16、 290-320mmol/kg 之间 ； c） 将步骤 b） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐沉溶液， 用 PBS 平衡盐溶液制成 2-20g/L 的 浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中， 连同反应器或悬浮培养瓶以 121高压蒸汽灭菌 30min， 自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置 30min 以上， 所述 PBS 平衡盐溶液 的 pH 值为 7.20.1, 渗透压在 290-320mmol/kg 之间 ； d） 将步骤 c） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐溶液， 用含体积百分含量 10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液洗 1 遍后再加相同体积的含体积百分含量 2%-10% 的新生。
17、小牛血清 NBCS 的细胞培养液备用 ； 洗 1g 微载体需要 20-50ml 含体积百分含量 10% 新生小牛血清 NBCS 的 细胞培养液。 0006 所述的细胞培养液是指将市售的 MEM、 DMEM 和 DMEM/F12 等成品干粉培养基， 按说 明书配成液体， 使用时加入相应比例的 NBCS 后用于培养动物细胞。 0007 进一步的， 上述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法， 所述 细胞扩大培养的过程包括以下步骤 ： A） 细胞复苏与扩增培养 ： 按常规方法复苏细胞， 在含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血 清 NBCS 的细胞培养液培养至单层， 按常规方法用质量百。
18、分比浓度为 0.25%-1% 胰蛋白酶消 化传代细胞至总量达下述 B） 所需的量 ； B） 悬浮细胞瓶微载体培养细胞 ： 将上述步骤 A） 的细胞按常规方法消化， 按每个载体 上 10-50 个细胞的比例接种到微载体添加量为 2-20g/L 的悬浮培养瓶中培养， 加含体积 百分含量 8-10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积的 40-100%, 培养温度为 371， 培养前 3-12h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 20-50rpm 固定转速搅拌， 培养 12h 后加含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积 100%， 从培养 时起每隔。
19、 12-24h 取样观察细胞生长情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 8%-10%NBCS 的 DMEM 培养液， 以保证反应 器中培养液的葡萄糖含量 1g/L （因 DMEM 培养液中的葡萄糖含量为 4.5g/L， 细胞生长需要 消耗培养液中的葡萄糖， 取出部分已培养了细胞的培养液， 换加没有培养细胞的新鲜培养 液可提高培养液中的葡萄糖） ， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层 ； 所述间歇搅拌是 搅拌 3-5min, 停止 20-60min, 再搅拌 3-5min 的反复搅停过程， 其中搅拌转速为 20-50rpm ； C）。
20、 悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞 ： 将上述步骤 B） 的细胞， 以步骤 1） 中步骤 b） 的 方法以 25-38预热的 PBS 平衡盐溶液洗两次， 按每克载体用 10-50ml 质量百分比浓度为 0.25%-1% 胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态， 加入新生小牛血 清 NBCS 中和 1-3min， 用备好的原微载体 2-8 倍的量的微载体进行再培养， 培养方法按上述 步骤 B） 进行， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层 ； 其中， 中和胰蛋白酶用新生小牛血 清 NBCS 的量是以酶解消化用胰蛋白酶按质量百分比浓度 0.25% 计算的量的 40%-60% ； 。
21、D） 5-7.5L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 C）处理得到的细胞悬液， 同备好的原 微载体 2-6 倍的量的微载体接种 5-7.5L 反应器中培养， 加含体积百分含量 8%-10% 新生 小牛血清 NBCS 的细胞培养液至终培养体积的 40-60%， 反应器的参数设置为 ： 温度 37、 pH7.1-7.3、 溶氧 20-80%， 转速 20-100rpm（转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速为 最好） ， 培养前 3-12h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 20-100rpm 固定转速搅拌， 培养 12h 后 加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至培养终体积。
22、的100%， 从培养时 说 明 书 CN 103614333 A 5 3/8 页 6 起每隔 12-24h 取样观察细胞生长情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量， 并 根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 8%-10% 新生小牛血清 NBCS 的 DMEM 培养液， 以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量 1g/L， 至 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层为 止 ； E） 50L 及以上反应器扩大培养细胞 ： 用上述步骤 D） 培养得到的细胞， 将 5-7.5L 反应器 的细胞按步骤 D） 逐级扩大培养至 50-120L 反应器 250 L 反应器线性放大。 0008 本发明的有。
23、益效果为 ： 本发明提供的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物 细胞的方法， 其采用反应器和国产的胶原微载体扩大培养细胞的工艺， 培养规模从方瓶 （0.25-2L 悬浮培养瓶） （5-7.5L 反应器） （50-120L 反应器） 250L 反应器线性放 大 , 从根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技术工艺， 该工艺操作简单， 将对现 有疫苗工艺进行技术升级的同时， 降低了疫苗的生产成本， 提高产品产量和质量， 在实际生 产中具有应用前景。 具体实施方式 0009 实施例 1 ： 1、 材料 ： 1） 细胞株， Marc-145 细胞， 从 CCTCC 引进 ； 2） DMEM 培养液。
24、， Invitrigen Corporation， 货号 ： 02-5062EJ， 按说明书配制 ； 3） 胰蛋白酶， Invitrigen Corporation， 货号 ： 27250， 使用时按常规方法配成质量百分 比浓度为 0.25% ； 4） GF-240， 兰州百灵， 批号 ： 20121218， 每克含 3.1106个载体 ； 5） 新生牛血清 （NBCS） ， 兰州民海， 批号 ： 20120716 ； 2、 仪器设备 ： 1） 培养箱， Thermo Fisher Scientific Corporation， 3111 ； 2） 相差倒置显微镜， OLYMPUS， CKX4。
25、1 ； 3） 反应器 （1） New Brunswick， Celligen 310， 培养罐总体积 7.5L, 终有效培养体积 5L ； （2） 江苏绿扬， YB-50QXF， 培养罐总体积 75L, 终有效培养体积 50L ； （3） 江苏绿扬， YB-200QXF， 培养罐总体积 250L, 终有效培养体积 200L ； 4） 悬浮培养瓶， 兰州百灵， 终有效培养体积 1L。 0010 5） 磁力搅拌器， TECHEN， MSC-104S。 0011 3、 其它 ： 凯氏细胞培养方瓶 ： T-75、 T-150。 0012 4、 方法 ： 1） 各培养阶段按有效培养体积计算所加的微载体的。
26、量如下 ： （1） 1L 悬浮细胞瓶， 6g， （2） 7.5L 反应器， 9g， （3） 75L 反应器， 3.6g， （4） 250L 反应器， 4g。 说 明 书 CN 103614333 A 6 4/8 页 7 0013 2） 微载体处理 ： （1） 按上述步骤 4 第 1） 条所示的微载体量， 在每个培养阶段的接种细胞前 48h 完成微 载体的浸泡、 PBS 清洗、 灭菌及培养液清洗过程。 0014 （2） 浸泡 ： 称取所需量的 GF-240 型微载体， 含体积百分含量万分之一吐温 -80 的 纯化水浸泡 5h， 期间搅拌一次使之充分浸泡， 1g 微载体浸泡用 30ml 含吐温 -。
27、80 的纯化水。 0015 （3） 清洗 ： 将步骤 （2） 处理的微载体弃纯化水， 用 pH 值为 7.21、 渗透压为 295mmol/ kg 且无 Ca2+、 Mg2+的 PBS 平衡盐溶液洗 2 次， 每次清洗 1g 微载体需要 30mlPBS 平衡盐溶液。 0016 （4） 灭菌 ： 将步骤 （3） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐沉溶液， 用 PBS 平衡盐溶液制成 2-20g/L 的浓度后转移到反应器 （或悬浮培养瓶） ， 以 121高压蒸汽灭菌 30min， 自然冷却 至温室后静置 1h。 0017 （5） 培养液清洗 ： 将步骤 （4） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐溶液， 用。
28、含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液洗 1 遍后再加相同体积的含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液 备用。洗 1g 微载体用 30ml 含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液。 0018 3） 细胞复苏与扩增培养 ： 按常规方法复苏细胞至 T-75 的方瓶中， 在含体积百分 含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液培养至单层， 按常规方法用质量百分比浓度为 0.25% 胰蛋 白酶消化消化传代培养， 培养扩大方式为 1 个 T-75 1 个 T-150 4 个 T-150 16 个 T-150 48 个 T-150， 消化 1 个 T-75 和 T。
29、-150 的细胞各需胰蛋白酶液 5ml 和 10ml， 消化作 用时间 3-5min。 0019 4） 1L 悬浮细胞瓶微载体培养细胞 ： 将上述步骤 3） 获得的细胞按常规方法消化， 按 每个载体上 28 个细胞的比例接种到微载体加量为 6g/L 的 1L 悬浮培养瓶中培养， 加含体积 百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 500ml, 培养温度为 37， 培养前 6h 采用间歇搅拌的方 式， 其后采用 30rpm 固定转速搅拌。培养 12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液 至 1L， 从培养时起每 24h 取样观察细胞生长情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的 剩。
30、余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液， 使反应 器中培养细胞的培养液中葡萄糖含量保持在 1g/L 以上 , 至到 80% 以上的微载体上细胞长 成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 30min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其中 搅拌转速为 30rpm。 0020 5） 1L 悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞 ： 将上述步骤 4） 的细胞， 用 37预热的 PBS 液洗两次， 每次用 200ml 的 PBS 液， 用 180ml 质量百分比浓度为 0.25% 胰蛋白酶酶解消化至 胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态， 加入 9。
31、0ml 的 NBCS 中和 3min 后加入 18g 已处理 备用的载体， 平均分到三个 1L 悬浮细胞瓶中进行培养， 每瓶加含体积百分含量 10%NBCS 的 细胞培养液至500ml继续培养至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层, 培养方法同步 骤 4） 。 0021 6） 7.5L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 5） 所获的细胞， 弃上清后将微载体和 细胞收集到一个 1L 悬浮细胞瓶中， 用 37预热的 PBS 液洗两次， 每次用 500ml 的 PBS 液， 用500ml质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散 的状态， 加入 250ml 的 N。
32、BCS 中和 3min 后移到已处理备好 50g 微载体的 7.5L 反应器， 加含 体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 2.5L 继续培养。反应器的参数设置为 ： 温度 37、 pH7.2、 溶氧 60%， 培养前 3h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 30rpm 固定转速搅拌。培养 12h 说 明 书 CN 103614333 A 7 5/8 页 8 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 5L。从培养时起每 24h 取样观察细胞生长 情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含 体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液。
33、， 以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量 1g/L， 至到 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 30min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其中搅拌转速为 30rpm。 0022 7） 75L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 6） 所获的细胞， 按步骤 5） 所述的方法 和程序扩大培养至备好 200g 微载体的 75L 反应器继续培养细胞至到 80% 以上的微载体 上细胞长成致密单层。其中， 清洗过程每次用 PBS 液 2L， 消化细胞用酶液 1.5L, 中和用 NBCS750ml， 前 12 小时采用间歇搅拌的方式。反应器的参数设置为 ： 温度。
34、 37、 pH7.2、 溶氧 60%， 培养前 3h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 60rpm 固定转速搅拌。培养前 12h 内用 23L 含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液培养， 培养 12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细 胞培养液至 50L。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 30min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其 中搅拌转速为 60rpm。 0023 8） 250L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 7） 所获的细胞， 按步骤 7） 所述的方 法和程序扩大培养至备好 1000g 微载体的 250L 反应器继续培养细胞至到 80% 以上的微载 体上。
35、细胞长成致密单层。其中， 清洗过程每次用 PBS 液 10L， 消化细胞用酶液 5L, 中和用 NBCS2.5L。培养前 12h 内用 120L 含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液培养， 培养培养 12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 200L。反应器的参数设置和培养过程同 步骤 7） 。 0024 表 1 为 Marc-145 细胞放大培养各阶段的细胞密度。 0025 表 1 ： 。 0026 其中， A是3个悬浮培养瓶细胞密度的平均值,B是按终培养体积计算的细胞密度。 0027 实施例 2 ： 1、 材料 ： 1） 细胞株， MDCK 细胞， 从 ATCC 。
36、引进 ； 2） DMEM 培养液， Invitrigen Corporation， 货号 ： 02-5062EJ， 按说明书配制 ； 3） 胰蛋白酶， Invitrigen Corporation， 货号 ： 27250， 使用时按常规方法配成质量百分 比浓度为 0.5% ； 4） GF-240， 兰州百灵， 批号 ： 20121218， 每克含 3.1106个载体 ； 5） 新生牛血清 （NBCS） ， 兰州民海， 批号 ： 20120716 ； 说 明 书 CN 103614333 A 8 6/8 页 9 2、 仪器设备 ： 1） 培养箱， Thermo Fisher Scientific。
37、 Corporation， 3111 ； 2） 相差倒置显微镜， OLYMPUS， CKX41 ； 3） 反应器 （1） New Brunswick， Celligen 310， 培养罐总体积 5L， 终有效培养体积 3.5L ； （3） 江苏绿扬， YB-50QXF， 培养罐总体积 75L, 终有效培养体积 50L ； （4） 江苏绿扬， YB-200QXF， 培养罐总体积 250L, 终有效培养体积 200L ； 4） 悬浮培养瓶， 兰州百灵， 终有效培养体积 1L。 0028 5） 磁力搅拌器， TECHEN， MSC-104S。 0029 3、 其它 ： 凯氏细胞培养方瓶 ： T-75。
38、、 T-150。 0030 4、 方法 ： 1） 各培养阶段按有效培养体积计算所加的微载体的量如下 ： （1） 1L 悬浮细胞瓶， 3g 和 5g, （2） 7.5L 反应器， 8g ； （3） 75L 反应器， 4g ； （4） 250L 反应器， 4g。 0031 2） 微载体处理 ： （1） 按上述步骤 4 第 1） 条所示的微载体量， 在每个培养阶段的接种细胞前 48h 完成微 载体的浸泡、 PBS 清洗、 灭菌及培养液清洗过程。 0032 （2） 浸泡 ： 称取所需量的 GF-240 型微载体， 含体积百分含量万分之一吐温 -80 的 纯化水浸泡 5h， 期间搅拌一次使之充分浸泡， 。
39、1g 微载体浸泡用 30ml 含吐温 -80 的纯化水。 0033 （3） 清洗 ： 将步骤 （2） 处理的微载体弃纯化水， 用 pH 值为 7.23、 渗透压为 289mmol/ kg 且无 Ca2+、 Mg2+的 PBS 平衡盐溶液洗 2 次， 每次清洗 1g 微载体需要 30mlPBS 平衡盐溶液。 0034 （4） 灭菌 ： 将步骤 （3） 处理的微载体弃 PBS 平衡盐沉溶液， 用 PBS 平衡盐溶液制成 2-20g/L 的浓度后转移到反应器 （或悬浮培养瓶） ， 以 121高压蒸汽灭菌 30min， 自然冷却 至温室后静置 1h。 0035 （5） 培养液清洗 ： 将步骤 （4） 。
40、处理的微载体弃 PBS 平衡盐溶液， 用含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液洗 1 遍后再加相同体积的含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液 备用。洗 1g 微载体用 30ml 含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液。 0036 3） 细胞复苏与扩增培养 ： 按常规方法复苏细胞至 T-75 的方瓶中， 在含体积百分含 量 10%NBCS 的 DMEM 培养液培养至单层， 按常规方法用质量百分比浓度为 0.5% 胰蛋白酶消 化消化传代培养， 培养扩大方式为 1 个 T-75 1 个 T-150 3 个 T-150 9 个 T-150， 消化 1 个 T。
41、-75 和 T-150 的细胞各需胰蛋白酶液 5ml 和 10ml， 消化作用时间 3-5min。 0037 4） 1L 悬浮细胞瓶微载体培养细胞 ： 将上述步骤 3） 获得的细胞按常规方法消化， 按 每个载体上 29 个细胞的比例接种到微载体加量为 3g/L 的 1L 悬浮培养瓶中培养， 加含体积 百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 500ml, 培养温度为 37， 培养前 6h 采用间歇搅拌的方 式， 其后采用 35rpm 固定转速搅拌。培养 12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液 至 1L， 从培养时起每 24h 取样观察细胞生长情况、 计数细胞密度和检测培养液中。
42、葡萄糖的 说 明 书 CN 103614333 A 9 7/8 页 10 剩余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量 10%NBCS 的 DMEM 培养液， 使反应 器中培养细胞的培养液中葡萄糖含量保持在 1g/L 以上 , 至到 80% 以上的微载体上细胞长 成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 30min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其中 搅拌转速为 35rpm。 0038 5） 1L 悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞 ： 将上述步骤 4） 的细胞， 用 37预热的 PBS 液洗两次， 每次用 150ml 的 PBS 液， 用 50ml 质量百分比浓度为 0.5。
43、% 胰蛋白酶酶解消化至胶 原载体全部消失和细胞完全分散的状态， 加入 50ml 的 NBCS 中和 3min 后加入 10g 已处理备 用的载体进行培养， 平均分到 2 个 1L 悬浮细胞瓶中， 每瓶加含体积百分含量 10%NBCS 的细 胞培养液至500ml继续培养至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层, 培养方法同步骤 4） 。 0039 6） 7.5L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 5） 所获的细胞， 弃上清后将微载体和 细胞收集到一个 1L 悬浮细胞瓶中， 用 37预热的 PBS 液洗两次， 每次用 500ml 的 PBS 液， 用 150ml 质量百分比浓度为 0.5% 胰蛋。
44、白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散 的状态， 加入 150ml 的 NBCS 中和 3min 后移到已处理备好 40g 微载体的 7.5L 反应器， 加含 体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 2.5L 继续培养。反应器的参数设置为 ： 温度 37、 pH7.25、 溶氧50%， 培养前3h采用间歇搅拌的方式， 其后采用40rpm固定转速搅拌。 培养12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 5L。从培养时起每 24h 取样观察细胞生长 情况、 计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量， 并根据培养液葡萄糖的含量换加含 体积百分含量 10%NBCS 的 DME。
45、M 培养液， 以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量 1g/L， 至到 80% 以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 27min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其中搅拌转速为 40rpm。 0040 7） 75L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 6） 所获的细胞， 按步骤 5） 所述的方法 和程序扩大培养至备好 200g 微载体的 75L 反应器继续培养细胞至到 80% 以上的微载体 上细胞长成致密单层。其中， 清洗过程每次用 PBS 液 2L， 消化细胞用酶液 600ml, 中和用 NBCS600ml， 前12小时采用间歇搅拌的方式。 反应器的参数设置为。
46、 ： 温度37、 pH7.25、 溶氧 50%， 培养前 3h 采用间歇搅拌的方式， 其后采用 70rpm 固定转速搅拌。培养前 12h 内用 30L 含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液培养， 培养 12h 后加含体积百分含量 10%NBCS 的细 胞培养液至 50L。所述间歇搅拌是搅拌 3min, 停止 30min, 再搅拌 3min 的反复搅停过程， 其 中搅拌转速为 70rpm。 0041 8） 250L 反应器扩大培养细胞 ： 将上述步骤 7） 所获的细胞， 按步骤 7） 所述的方法 和程序扩大培养至备好 800g 微载体的 250L 反应器继续培养细胞至到 80% 以上的微。
47、载体上 细胞长成致密单层。 其中， 清洗过程每次用PBS液10L， 消化细胞用酶液3L,中和用NBCS3L。 培养前 12h 内用 100L 含体积百分含量 10%NBCS 的细胞培养液培养， 培养 12h 后加含体积百 分含量 10%NBCS 的细胞培养液至 200L。反应器的参数设置和培养过程同步骤 7） 。 0042 表 2 为 MDCK 细胞放大培养各阶段的细胞密度。 0043 表 2 ： 说 明 书 CN 103614333 A 10 8/8 页 11 。 0044 其中， A是2个悬浮培养瓶细胞密度的平均值,B是按终培养体积计算的细胞密度。 0045 最后应说明的是 ： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的 保护范围之内。 说 明 书 CN 103614333 A 11 。