技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检 测方法。
背景技术
在大力发展农业基因工程时，转基因植物的安全性问题己日益引起人们的重视。要对选 择标记基因及其产物进行安全性评价，将耗费大量物力、财力及时间，影响转基因植物投入 市场。因此，转基因植物中如何去除选择标记基因成为基因工程急切需要解决的问题。对于 这个问题，目前广泛采用的方式是转化时仍使用选择标记基因，转基因植株再生成功后，在 其释放大田前将选择标记基因剔除。去除选择标记基因的策略，常见的主要有四种：一是基 于农杆菌介导的共转化系统，二是位点特异性重组系统，三是利用转座子成分使外源基因在 基因组间重新定位，四是MAT载体系统。
通过农杆菌介导的共转化系统去除选择标记基因的其中一种策略是双T-DNA转基因。这 种策略是构建双T-DNA植物表达载体，选择标记基因和目标基因分别位于两个独立的T-DNA 结构域内，通过农杆菌介导的转基因方法将标记基因和目标基因共整合入植物细胞中，当两 个基因被整合到足够多的非连锁位点时，在下一代中通过有性繁殖过程目的基因和选择标记 基因可得到分离，从而获得无选择标记的转基因植株。
中国科学院遗传与发育生物学研究所朱桢研究小组构建了双T-DNA植物表达载体 pCDMAR-Hyg(参见中国专利ZL02107429.1)，其为目标基因和选择标记基因分别位于两个 独立T-DNA结构域且带核基质结合区MAR序列的单子叶植物表达载体。目前为止，关于利 用该载体构建的目标基因表达载体的双T-DNA转基因培育无选择标记植物的方法，是通过分 别在目标基因和选择标记基因序列区域设计标记，对转基因T0代进行检测，选择两个基因共 整合的克隆，在T1代利用两个基因标记再次检测，从而获得无选择标记的转基因植株。该检 测方法工作量大、效率低。以一个品种转化获得200个独立的共整合T0代植株为例，每个 T0代植株至少需要筛选50个以上T1代植株才能保证获得无选择标记转化体，常规的做法必 须先利用PCR方法对近10000个植株进行选择标记基因的筛选，然后再对经筛选确认不带选 择标记基因的植株作PCR筛选含目的基因的植株。
发明内容
本发明旨在提供一种水稻双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记检测方法，其特征在于 包括如下步骤：
(1)将以双T-DNA表达载体pCDMAR-Hyg构建的任意目的基因的表达载体，通过农杆 菌介导转化到水稻中，获得T0代独立转化子，对独立转化子转基因苗利用潮霉素基因标记和 目的基因标记进行基因型分析，筛选得到两个基因共整合的转化子；
(2)分别提取上述筛选得到的两个基因共整合转化子的叶片DNA，利用特异分子标记 Link-1对所提取的DNA进行PCR扩增，标记Link-1引物序列如下：
正向引物(5＇-3＇)GCATTTGTAGGTGCCACCTTC；
反向引物(5＇-3＇)CCAAGGGCTGCAGGAATTAAT；
(3)经PCR反应扩增共整合植株DNA，进行电泳观测，如果转基因植株在2516bp位 置无任何条带，则说明双T-DNA为非连锁整合，如果在2516bp位置出现目标条带，则说明 双T-DNA为连锁整合。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的水稻为明恢86或者其它水稻品种。
在本发明的一个优选实施方式中，于所述的PCR扩增工艺为：
20ulPCR反应体系包含：10×Buffer2uL，引物2uL(终0.5pm)，dNTPs2uL(终浓度200uM)， Tap酶0.2uL(1.5U)，DNA1uL，以ddH2O补足体系；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸2.5min， 32个循环，最后72℃延伸5min。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的DNA提取工艺为：
1)取5cm长水稻叶片，剪成小段置入1.5mL管中；
2)打开管盖装入液氮后，用速冻过的玻璃棒将叶片磨成粉末；
3)加入预热的2×CTAB500uL，混合均匀；
4)65℃水浴中反应30min，每五分钟颠倒混匀一次；
5)每管加入一倍体积(550uL)的氯仿：异戊醇(24：1)，充分震荡，室温12000rpm， 离心8min，上清液移至新离心管中；
6)加入两倍体积的无水乙醇，于-20℃静置30min以上；
7)室温12000rpm，离心7min后弃上清，用70％的酒精洗涤两次，最后风干加入50uL 的TE或去离子水，于-20℃保存待用。
通过本发明的方法，转基因T0代即可鉴定出目标基因与选择标记基因是否连锁整合，淘 汰连锁整合的转基因克隆，从而极大地提高无选择标记基因水稻的培育效率。
附图说明
图1：表达载体pCUEP-102的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实例对本发明做进一步的说明。
1、材料与方法
1.1表达载体：利用以双T-DNA载体pCDMAR-Hyg构建的抗除草剂表达载体pCUEP-102 构建过程：将由BstXI／PmeI双酶切获得的含Ubiqutin启动子和抗除草剂基因的全基因 表达结构，插入到双T-DNA植物转化载体pCDMAR-Hyg的SmaI位点，得到植物表达载体 pCUEP102，该表达载体的结构如图1所示。各元件说明见表1
表1抗除草剂表达载体pCUEP-102元件说明
1.2水稻转基因受体品种：明恢86，遗传资源来源披露见表2；
表2明恢86来源披露表
1.3转基因按照Vergne等(2007)的方法进行获得T0代，转基因方法概述如下：
1)转化受体的制备：诱导水稻成熟胚愈伤，选取颜色鲜黄的胚性愈伤组织作为农杆菌侵 染的受体；
2)农杆菌工程菌株的培养：从农杆菌菌株储液(20％甘油)取少量菌液，于YEB固体 培养基(含有卡那霉素50mg／L，利福霉素50mg/L)上划线培养，28℃避光培养至长出直径 1mm大小的单菌落。取单菌落接于同样的培养基上，培养至旺盛生长期。挑取少许菌体接于 20mLYEB液体培养基中(含有相应抗生素)，28℃避光220rpm振荡培养过夜。次日以2％ 的接种量转接于20mL含有100μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中，培养至对数生长中期， 用3倍以上液体基本培养基稀释至肉眼稍见混浊即可(OD600约0.1)，以备转化之用；
3)农杆菌侵染及共培养：取菌液于培养瓶中，加入愈伤组织，略微摇动后静置10分钟。 于无菌滤纸上晾干愈伤组织后置于添加有100μM乙酰丁香酮的共培养基上，25℃暗培养3天；
4)抗性愈伤的筛选：将共培养后的愈伤组织转至含50mg/L潮霉素及500mg／L头孢霉素 的筛选培养基上，筛选1-2次；
5)抗性植株的再生：将抗性愈伤组织转至含25mg／L潮霉素的分化培养基上，光照条件 同前。待分化出的抗性小芽长至6-8cm时，将其转至含50mg／L潮霉素的再生培养基上，当 长至完整的植株后，将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后，将苗转入 温室种植；
1.4水稻叶片DNA提取方法如下：
1)取5cm长水稻叶片，剪成小段置入1.5mL管中；
2)打开管盖装入液氮后，用速冻过的玻璃棒将叶片磨成粉末；
3)加入预热的2×CTAB500uL，混合均匀；
4)65℃水浴中反应30min，每五分钟颠倒混匀一次；
5)每管加入一倍体积(550uL)的氯仿：异戊醇(24：1)，充分震荡，室温12000rpm， 离心8min，上清液移至新离心管中；
6)加入两倍体积的无水乙醇，于-20℃静置30min以上；
7)室温12000rpm，离心7min后弃上清，用70％的酒精洗涤两次，最后风干加入50uL 的TE或去离子水，于-20℃保存待用。
1.5双T-DNA转基因非连锁整合的分子标记，引物序列如下：
正向引物(5＇-3′)GCATTTGTAGGTGCCACCTTC
反向引物(5＇-3′)CCAAGGGCTGCAGGAATTAAT
预期片段大小为2516bp左右。
1.6PCR反应及电泳检测
20ulPCR反应体系包含：10×Buffer2uL，引物2uL(终0.5pm)，dNTPs2uL(终浓度200uM)， Tap酶0.2uL(1.5U)，DNA1uL，以ddH2O补足体系。
PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸2.5min， 32个循环，最后72℃延伸5min。
PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳观测。
2、双T-DNA表达载体转基因水稻连锁整合检测
将抗除草剂双T-DNA表达载体pCDMAR-Hyg通过农杆菌介导转化明恢86，T0代获得了 58个独立转化子，大约600棵转基因苗。对这些转基因苗利用潮霉素基因标记和抗除草剂基 因标记进行基因型分析，检测到两个基因共整合的转化子32个，计318棵苗，进一步利用特 异标记Link-1进行PCR电泳检测，发现17个转化子(198棵苗)的PCR产物在2516bp位 置无条带，初步判断这些转基因苗为双T-DNA非连锁整合，15个转化子(120棵苗)的PCR 产物获得预期大小2516bp的条带，说明这些转基因苗为双T-DNA连锁整合。
对上述共计32个转化子的T1代分离群体分别用潮霉素和抗除草剂基因标记进行检测， 发现以上所述17个转化子的T1代群体全部表现潮霉素和抗除草剂基因非连锁分离，进一步 表明这17个转化子为双T-DNA非连锁整合；另外15个转化子的T1代群体全部检测到潮霉 素和抗除草剂两个基因连锁分离，与T0代Link-1标记的检测结果吻合，说明分子标记Link-1 在转基因T0代即可准确检测双T-DNA非连锁整合的转化子，淘汰连锁整合的转化子。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经 过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护 范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。