技术领域
本发明涉及一种细菌、菌剂及其在促进油菜生长发育方面的应用，具体是涉及一种嗜硫 小红卵菌菌株、菌剂及其在提高油菜发芽率和油菜产量方面的应用。
背景技术
农用化学品，包括化学杀虫剂、化学除草剂和化肥的大量投入，降低了农业生产的劳动 强度，提升了农业生产的效率，极大的促进了现代农业生产的发展。然而，农用化学品的投 入，影响了农田生态系统的结构，破坏了农田生态系统平衡，从而影响农田生产的可持续性， 降低了农产品的质量。如化肥的不合理投入，导致土壤板结，降低土壤生物多样性，影响作 物产量和品质；化学农药的不合理投入，对非靶标毒害及农产品残留超标，越来越受到人们 关注。
微生物制剂是部分解决该问题的有效方法。然而，本领域的技术难题是，筛选环境友好 型、高活性的微生物资源，微生物菌剂的高效发酵工艺，微生物菌剂的田间应用技术等等。 目前还没有嗜硫小红卵菌在促进油菜生长发育方面的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，促进油菜生长 且高效、无毒、环保的嗜硫小红卵菌菌株，另外提供一种利用嗜硫小红卵菌制成的菌剂，及 其在提高油菜种子发芽率和油菜产量方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种嗜硫小红卵菌IV-1（Rhodovulum sulfidophilum IV-1）菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M2012369， 保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月20日，该菌株被命名为嗜硫小红 卵菌IV-1（Rhodovulum sulfidophilum IV-1）。
本发明的嗜硫小红卵菌菌株是通过以下方法筛选得到：将采自海南省的海水样品加入 MSYN液体培养基（MSYN液体培养基组分：0.2g/L K2HPO4，0.8g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4,0.1g/L CaSO4·2H2O，0.0033g/L NaMoO4·2H2O,0.005g/L FeSO4·7H2O，1.5g/L酵母膏和3g/L NaCl， pH7.0-7.2），光照培养后，取菌液稀释涂布到MSYN固体培养基（MSYN固体培养基成分：0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4，0.1g/L CaSO4·2H2O，0.0033g/L NaMoO4·2H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L琼脂，pH值为7.0～7.2），光照培养至菌落 出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSYN液体培养基中，筛选得到嗜硫小红卵菌 IV-1。
所述嗜硫小红卵菌菌株IV-1，具有以下主要特征：
G-，个体形态为卵杆状，V-P反应阳性，甲基红反应阴性，H2S阳性，吲哚反应和过氧化 氢酶反应阳性，质量浓度为3%NaCl中能生长，最适生长温度为30～35℃，最适生长pH值 为6.5～7.5，菌体的特征吸收峰为385nm、525nm、585nm、805nm和865nm，16S rDNA序列 长度为1338bp，在Genbank中的登录号为KF682218。
本发明还提供一种利用嗜硫小红卵菌IV-1制成的菌液。制备方法是将该菌株接种于液体 培养基中培养制得，菌浓度优选为108-1010cfu/mL，最优选为109cfu/mL。
具体的制备方法优选包括以下步骤：
a.将嗜硫小红卵菌菌株IV-1的超低温保存种按平板培养法进行培养，培养至红色菌落 出现；平板培养法优选是采用双层MSYN固体培养基进行培养，pH值优选为7.0～7.2，培养 温度优选为30℃～35℃，光照条件优选为2000～3000Lx。
b.将所述红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用嗜硫小红卵菌菌株IV-1种子培养基培养 至对数生长期；种子培养基优选为MSYN液体培养基，pH值优选为7.0～7.2，培养温度优选 为30～35℃，光照条件优选为2000～3000Lx。
c.将步骤b培养后得到的菌液按不少于嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基总体积1%的 接种量，优选1～5%，接种到生产瓶中，用嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基培养至对数生 长期；生产培养基优选为MSYN液体培养基，pH值优选为7.0～7.2，培养温度优选为30～35℃， 光照条件优选为2000～3000Lx。
d.分装制得细菌菌剂。
上述制备方法的全流程时间一般为16-20天左右，培养结束后，菌体数量可达到5亿个 /ml以上。
本发明还提供一种上述嗜硫小红卵菌菌株IV-1在提高油菜种子发芽率或油菜产量方面 的应用。
提高油菜种子发芽率的应用方法是，将菌剂按一定比例稀释,润湿滤纸,然后将油菜种子 均匀撒在润湿滤纸上，光照培养一段时间。
提高油菜产量的应用方法是，油菜定植缓苗后5-15天后开始喷菌液，每隔7-10d喷一次， 共喷菌液2-3次。三次施菌液当天最好为阴天或晴天，施菌液后24小时内均未降雨。
本发明的有益效果是，本发明提供的嗜硫小红卵菌菌株IV-1，生产成本低、生长速度快， 高效、无毒、环保，可通过简单、快捷的操作方法制备得到细菌菌剂，使用本发明菌株制备 得到的细菌菌剂具有生产成本低、使用方便，对油菜促生效果好等优点，能够有效用于农业 生产中油菜的安全生产。本发明的菌株可用于田间油菜的生产，可部分的替代农用化学品投 入。本发明的菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进油菜生长、提供油菜籽 的品质，兼具防治油菜病害的作用，具有安全、无毒、环保的特点。
本发明的嗜硫小红卵菌IV-1（Rhodovulum sulfidophilum IV-1），保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2012369，保藏日期为2012年9月20日。
附图说明
图1为本发明菌株的电子显微镜扫描图。
图2为不同浓度的菌剂对油菜发芽率的柱状图。
图3为不同浓度的菌剂对油菜增产率的柱状图。
具体实施方式
实施例1
本发明的菌株的制备方法包括如下步骤：
将采自海南省的海水样品2.0mL加入120mL MSYN液体培养基，MSYN液体培养基组分： 0.2g/L K2HPO4，0.8g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4,0.1g/L CaSO4·2H2O，0.0033g/L NaMoO4·2H2O, 0.005g/L FeSO4·7H2O，1.5g/L酵母膏和3g/L NaCl，pH7.0-7.2，光照培养7d后，取300μL 菌液稀释涂布到MSYN固体培养基，MSYN固体培养基为MSYN液体培养基添加15g/L琼脂，光 照培养至菌落出现，挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSYN液体培养基中，筛选得到嗜 硫小红卵菌菌株IV-1（Rhodovulum sulfidophilum IV-1），保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO：M2012369，本发明菌株的电子显微镜扫描图如图1所示。
实施例2
用嗜硫小红卵菌菌株IV-1（Rhodovulum sulfidophilum IV-1）制备细菌菌剂，具体包 括以下步骤：
（1）活化：将嗜硫小红卵菌菌株IV-1的超低温保存种按双层平板培养法进行培养，该 双层平板培养法具体是用双层MSYN固体培养基进行培养，其主要成分包括0.2g/L K2HPO4, 0.8g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4，0.1g/L CaSO4·2H2O，0.0033g/L NaMoO4·2H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L琼脂，培养时的pH值为7.0～7.2，温度为 30℃，光照条件为3000Lx，培养至红色菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色菌落中的单菌落接入血清瓶，用MSYN液体培 养基培养，其主要组分包括0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4，0.1g/L CaSO4·2H2O， 0.0033g/L NaMoO4·2H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，培养时的pH 值为7.0～7.2，温度为35℃，光照条件为2000Lx，培养至对数生长期；
（3）生产培养：将步骤（2）培养后得到的菌液按嗜硫小红卵菌菌株IV-1生产培养基总 体积的5％的接种量接种到生产瓶中，用MSYN液体培养，培养基组分和培养条件同步骤（2）， 培养至对数生长期；
（4）岀瓶分装制得细菌菌剂。
本实施例方法的全流程培养时间为20天，培养结束后，菌体数量达到5亿个/ml以上。
实施例3
将实施例2制得的嗜硫小红卵菌菌株IV-1菌剂和油菜种子混匀，嗜硫小红卵菌菌株IV-1 菌剂和油菜种子的重量比为1:100，光照强度25±2℃培养72h。油菜发芽率相比没有混匀嗜 硫小红卵菌菌株IV-1菌剂相比，油菜发芽率提高15-20%。
实施例4
油菜定植缓苗后10天后开始喷实施例2制得的菌剂，喷液量150mL/亩，每隔7d喷一 次，共喷菌液3次。三次施菌液当天为阴天或晴天，施菌液后24小时内均未降雨。相比未喷 洒菌剂的油菜，油菜产率提高3-15%。
不同浓度菌剂对提高油菜种子发芽率的分析
在直径15cm的培养皿中，放入滤纸，分别加入稀释的菌剂或稀释100倍的MSYN液体培 养基，总体积为20mL。挑选大小一致的油菜种子，分别均匀的播入培养皿（10粒每皿）中， 光照培养箱中25±2℃培养。72h后测定油菜发芽情况。
结果如附图2所示，菌剂稀释100倍和200倍，油菜发芽率分别为60.47%和49.40%，均 高于稀释100倍的MSYN液体培养基对照（油菜发芽率为48.30%）。
不同浓度菌剂对提高油菜产量的分析
试验地设在湖南省常德市。试验地地势平坦，面积约1250m2，土壤pH值6.8，土壤有机 质含量1.82%。试验地不再施用其它微生物菌剂，其他田间管理按常规进行。
试验共设4个处理：菌剂稀释100X、200X，稀释100倍的MYSN液体培养基，清水。采 用的喷施方法为：油菜定植缓苗后10d后开始喷菌液，每隔7-10d喷一次，共喷菌液3次。 三次施菌液当天均为阴或晴天，施菌液后24小时内均未降雨；田间试验期间日平均温度 25.2℃。
收获时测量各小区产量，计算折合产量与增产率。
结果如附图3所示，菌剂稀释100倍和200倍，油菜增产率分别为10.68%和7.79%，均 高于稀释100倍的MYSN液体培养基对照（油菜增产率为3.63%），油菜增产率的计算方法为： 菌剂稀释100倍、200倍或培养基稀释100倍喷施油菜得到的油菜产量减去以清水喷施得到 的油菜产量，除清水喷施得到的油菜产量，乘以100%。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于 本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。