脱水河豚毒素的提取方法 本发明是一种海洋生物活性物质的分离提取方法，属于天然生物产品提取技术领域。
脱水河豚毒素(Anhydrotetrodotoxin，Anh-TTX)是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，其分子式和结构式如下：
分子式：C11H15O7N3，分子量301．27．
结构式：
河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是存在于河豚鱼体内的一种有毒物质，脱水河豚毒素是河豚毒素的衍生物，一般情况Anh-TTX与TTX存在于同一生物体中，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中，在虾虎鱼、螺类、章鱼、蟹类、和海星等，海生陆产的两栖类、软体动物、节肢动物等都已检测到Anh-TTX，并发现Anh-TTX可能来源于一些细菌如弧菌、假单胞菌等。
Anh-TTX是生物细胞Na+通道的阻断剂，其毒力仅为TTX的1％，其LD50为986ug／kg(ⅳ．小鼠)，其生理作用是快速可逆地阻断Na+通道，所以，可广泛用于神经生物学和生理学及其他科学研究。
Anh-TTX虽然分布于多种生物中，但在生物体内含量极小，约为百万分之一至千万分之一。由于Anh-TTX与TTX分子结构、分子量及理化性质非常接近，提取TTX时总是含混有Anh-TTX，所以，要单一提取Anh-TTX非常困难，目前尚未见有单一提取Anh-TTX的报道。
本发明的目的是利用纯化TTX后，富集有Anh-TTX的废弃母液为原料，从而建立一种分离精制Anh-TTX的有效方法，使制备出Anh-TTX中不含有TTX，从而为科学研究提供一种新的制剂，并做到废物利用，降低成本。
本发明的主要内容：一种脱水河豚毒素的提取方法，使Anh-TTX等富集于母液中，以此废弃的母液为原料，用高压液相色谱分离提取Anh-TTX，再用阳离子交换树脂、生物凝胶脱盐，回收Anh-TTX，使得到Anh-TTX的纯度达到97％以上，且不含TTX。
一种分离精制脱水河豚毒素的方法，按下列步骤提取：
(1)纯化河豚毒素母液制备：先将粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加无水乙醇1-10倍，离心除去不溶物，然后将上清液移到小烧杯、贮藏在密闭的容器中，并另放一杯乙醚，控制温度5-35℃、12-72小时，最后将醇醚溶液经离心分离出河豚毒素母液，母液经浓缩，加氨水调节PH7-10，收集其沉淀物：
(2)高压液相色谱分离提取脱水河豚毒素：将上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流动相组成含有0．1-10％甲醇的0．01-0．2M磷酸盐缓冲液，调PH为5．7，流动相流速1-20ml／min，用示差检测器进行检测，分离过程按记录仪上出峰图，收集脱水河豚毒素馏份；
(3)脱水河豚毒素馏份的脱盐、回收：选用填料为酸性阳离子交换树脂和生物凝胶，洗脱剂用1-20％的醋酸，收集PH4-7馏份，加氨水调节PH7．5-10，可沉淀出脱水河豚毒素，经反复脱盐，可得到纯品脱水河豚毒素结晶。
脱水河豚毒素的具体分离提取方法为：
一、Anh-TTX的富集
取粗品TTX10-2000mg，溶于0．5-40ml1-20％HAC中，在此溶液中边搅拌，边加入1-80ml无水乙醇，离心除去不溶物，把溶液移到烧杯中，贮藏在密闭的容器中，并放上一瓶乙醚溶液。当乙醚向TTX-HAC-ETOH-H2O溶液扩散时，导致TTX结晶出来，离心收集上清液，浓缩后加入NH4OH调节PH7-10，即可得到沉淀物。
二、脱水河豚毒素(Anhydrotetrodotoxin，Anh-TTX)地HPLC分离提取。
①制备柱150-400×10-40mm
②固定相：反相硅胶C18
③洗脱液为含0．1-10％甲醇的磷酸盐缓冲液，PH5．7
④示差检测器检测
⑤泵压力100-2500PSi
⑥分离过程按记录仪上Anh-TTX峰图收集镏份。
三、Anh-TTX的脱盐、回收
①交换柱200-600×10-400mm
②固定相为酸性阳离子交换树脂和P2生物胶。
③洗脱剂为1-20％HAC
④洗脱馏份按每份0．5-5ml收集
⑤以PH试纸对收集馏份进行PH测定
⑥对PH4-7馏份加NH4OH调节PH至7．5-10，可得到沉淀物。
⑦沉淀物水洗、真空干燥。
上述样品经反复进行HPLC-离子交换、凝胶工艺即可得到Anh-TTX结晶，且不含TTX。
本发明的优点和积极效果。
生物体内Anh-TTX含量极微，提取难度大，选用醇醚扩散法纯化TTX，不仅可以提高TTX纯度，同时可使Anh-TTX等(TTX的衍生物)富集于母液中，以此母液为原料，不但提高Anh-TTX提取率，并做到废物利用，降低成本。
本发明建立HPLC-离子交换、凝胶工艺，使Anh-TTX与TTX得到彻底分离和有效的回收是Anh-TTX提取的一大突破。
下面叙述本发明的实施例：
实施例一：
1、Anh-TTX原料液的富集
a．粗TTX0．1克，加5％HAC5ml溶解。
b．TTX溶解液边搅边加无水乙醇25ml离心(4000转／min)30分钟，去除不溶物。
c．醇溶液移到烧杯，放在密闭的容器中，并另放盛有50ml乙醚的烧杯一只，控制温度在10℃，时间18小时。
d．醇醚溶液经离心，收集其上清液。
e．上清液浓缩后，加氨水调PH8．0，产生沉淀，并吸出清液。
f．沉淀物水洗三次。
g．沉淀物冷冻干燥，得沉淀物15mg。
2、Anh-TTX分离提取
a．制备型高压液相色谱仪1台，制备柱200×10mm，内装C18，流动相为5％甲醇的0．08M磷酸盐缓冲液PH5．7，示差检测，压力600PSi、流速3ml／min。
b．取含Anh-TTX的沉淀物15mg，加30％磷酸0．5mg溶解，进样分离。
c．Anh-TTX出峰图收集馏份30ml。
3、Anh-TTX脱盐回收。
a．离子交换柱400×30mm，内装弱酸性阳离子交换树脂50g。
b．含Anh-TTX馏份30ml，加入交换柱，流速1ml／min。
c．用12％HAC洗脱、收集PH4-7馏份25ml。
d．加氨水调节PH8．5，收集沉淀物。
e．沉淀物经水洗、冷冻真空干燥，得Anh-TTX5mg。实施例二：
1、Anh-TTX原料液的富集
a．取粗品TTX2克，加20％HAC50ml溶解
b．a溶液边搅拌边加入无水乙醇400ml以4000转／分离心分离上述溶液60分钟，得上清液。
c．b溶液，连同另盛有400ml乙醚的烧杯，一同置于密闭容器中，恒温30℃，经72小时，溶液再经4000转／分离心分离不溶物，得溶液C。
d．溶液C经浓缩后，加入氨水调节PH9静置，得沉淀物。
e．d沉淀物水洗三次。
f．e沉淀物冷冻真空干燥得Anh-TTX粗品400mg
2、Anh-TTX分离提取
a．色谱条件如下：制备型高压液相色谱仪一台，制备柱400×40mm，填料C18，流动相10％甲醇的0．2M磷酸盐缓冲液PH5．7，示差检测器，柱压力800Psi，流速20ml／分。
b．取400mg粗品Anh-TTX溶于2ml30％磷酸
c．取b溶液进样分离，根据色谱图收集Anh-TTX馏份500ml
3、Anh-TTX脱盐回收
a．分离柱600×40mm，填料P2生物凝胶。
b．加入含Anh-TTX溶液500ml，流速3ml／分。
c．以20％HAC洗脱，收集4-7溶液300ml。
d．c溶液加氨水调节PH9．5，收集沉淀物。
e．沉淀物水洗三次。
f．沉淀物冷冻真空干燥，得Anh-TTX半成品100mg。
4、Anh-TTX精制
取Anh-TTX半成品100mg，按上述HPLC-凝胶脱盐工艺，可得纯度97％以上的Anh-TTX60mg，且不含有TTX。