酚酸酯酶及其应用 本发明涉及一种具有酚酸酯酶活性的酶，DNA分子编码所述酶及制备和使用所述酶的方法。
技术背景
植物细胞壁分为两部分，即第一和第二细胞壁。第一细胞壁是由三种主要类型的多糖组成：纤维素、半纤维素和果胶。第二细胞壁也含有多糖及木质素。半纤维素是一种常规类型的存在于植物细胞壁的高支链多糖，它与其自身及纤维素和木质素相连接，并且这些连接的键对植物结构的稳定性和支撑植物结构起着作用。
基于木糖骨架的半纤维素称为木聚糖。已显示广泛存在于各种不同植物，包括水果、蔬菜、豆类、谷类、草、软木和硬木，中的木聚糖是线性β-(1-4)-D-吡喃型木糖聚合物，该聚合物可以被包括α-L-阿拉伯糖、α-D-葡糖醛酸和/或α-D-葡糖醛酸的4-O-甲基醚衍生物的糖基取代。许多木聚糖也与包括香豆酸和阿魏酸的酚酸残基发生酯化作用。这些酚酸残基以酯的形式与α-L-呋喃型阿拉伯糖基木聚糖相连接并用于防止木聚糖水解酶，即木聚糖酶，对木聚糖的降解，以及通过与其中的木质素形成的共价键而赋予植物细胞壁结构的稳定性。此外，阿魏酸在不同的木聚糖链之间存在二阿魏酸桥键，这更进一步地赋予了对植物细胞的结构支撑(Linden J.C.等，美国化学会志专题论文集，566卷(1994)，452～467)。
已知许多微生物能够通过植物细胞壁多糖的酶解而水解酚酸酯和消化植物细胞壁。其中某些微生物拥有具有酚酸酯酶活性的酶，即香豆酸酯酶活性或阿魏酸酯酶活性或这两种活性的结合。
例如，Borneman，W.S.等(应用和环境微生物学，58卷(1992)，3762～3766)描述的两种阿魏酸酯酶(FAE)，分别指定为FAE-I和FAE-II，是从厌氧真菌Neocallimastix strain MC-2中分离出来地。据报道FAE-II对底物(O-{5-O-[(E)-阿魏酰基]-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(FAXX)具有特异性，而FAE-I既具有FAXX的降解活性又有(O-{5-O-[(E)-p-香豆酰基]-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(PAXX)的降解活性，FAXX∶PAXX的最高代谢比为3∶1。当使用FAXX作为底物时，这两种酶的最适PH值分别为6.2和7.0。
英国专利2 301 103披露了得自黑曲霉的FAE及基因编码的所述酶。当阿魏酸甲酯用作底物时，所述酶具有约5的最适PH值和约50～60℃的最适温度。
其它具有阿魏酸酯酶活性的纯化酶是已知的(例如，McCrae，S.I.等，Enzyme Microb.Technol(酶微生物技术)，16卷(1994)，826～834；Faulds，C.B.和Williamson，G.，Microbiology(微生物学)，140卷(1994)，779～784；Castanares，A.等，酶微生物技术，14卷(1992)，875；和Kroon，P.A.等，Biotechnol.Appl.Biochem(生物技术应用生物化学)，23卷(1996)，255～262)，该纯化酶具有约5.0～6.0范围的最适PH值和30～60℃的最适温度。
具有酚酸酯酶活性的酶可用于工业、农业和医疗的应用，这些应用可以在PH值约或高于6.5和/或温度高于45℃下进行。
本发明的概述
本发明的一个目的是提供具有良好酚酸酯酶活性的酶。
本发明的另一个目的是提供能够相对大量获得的具有酚酸酯酶活性的酶的来源。
本发明进一步的一个目的是提供制备具有酚酸酯酶活性的酶的方法。
本发明的更进一步的一个目的是提供具有酚酸酯酶活性的酶在例如食物和饲料的生产、纸张和纸浆以及木质纤维素废物的生物转化过程中的应用。
本发明的其它目的将通过下面的详细描述而变得显而易见。
本发明的主题是具有酚酸酯酶活性的酶，其特征在于当其在含有33μM FAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，所述酶具有高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选约高于50℃，更优选约55℃的最适温度。在优选的情况下，所述酶具有阿魏酸酯酶活性和/或香豆酸酯酶活性。
本发明的主题也是一种具有酚酸酯酶活性的酶，该酶能从Piromyces SP.，例如Piromyces equi得到，优选从布达佩斯条约国际微生物研究所(IMI)，Bakeham Lane，Egham，Surrey，UK登记号为375061保藏的Piromyces equi strain得到。
在优选的情况下，本发明的酶含有在SEQ ID NO：1中所给出的氨基酸序列或其功能性衍生物。本发明的酶的功能性衍生物定义为在SEQ ID NO：1中所给出的氨基酸序列中具有一个或多个N-末端、C-末端或内部取代、插入和/或缺失的酶，当该功能性衍生物在含有33μMFAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，其保持高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选高于50℃，更优选约55℃的最适温度。在更优选的情况下，本发明的酶含有在SEQID NO：3中所给出的氨基酸序列或其功能性衍生物。
此外，本发明的酶优选用SEQ ID NO：1中所给出的DNA序列或其功能性衍生物进行编码。本发明的酶更优选用SEQ ID NO：3中所给出的DNA序列或其功能性衍生物进行编码。
本发明涉及具有一个和多个上述性质的酚酸酯酶。
本发明更进一步的主题是具有酚酸酯酶活性的用DNA分子编码的酶，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO：1中给出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。在SEQ ID NO：1中给出的DNA序列的功能性衍生物定义为具有SEQ ID NO：1所给出的DNA序列中具有一种或多种5′-，3′-或内部取代、插入和/或缺失的DNA序列，所述功能性衍生物保持其编码具有酚酸酯酶活性的酶的能力，并当其在含有33μM FAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，具有高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选高于50℃，更优选约55℃的最适温度。本发明的DNA序列的功能性同系物定义为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所给出的DNA序列上优选有75％的同系物，更优选有85％的同系物，最优选有95％的同系物的DNA序列。在更优选的情况下，按照本发明的用DNA分子编码的酶含有SEQ ID NO：3所给出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。
在优选的具体实施方案中，本发明的DNA分子含有能够在原核或真核宿主细胞中复制所述DNA分子和/或表达所述酶的载体序列。
本发明更进一步的主题是含有一个或多个本发明的DNA分子的转化的原核细胞或真核细胞。所述细胞优选选自由大肠杆菌，球形芽孢杆菌如枯草杆菌、球形乳酸杆菌和球形乳球菌，曲霉属，木霉属，青霉菌，白霉属，克鲁维酵母菌属和酵母属如啤酒酵母组成的组中。
本发明的酶可以在基因转移植物如玉米、大豆和canola/油菜籽或植物根储备器官，如土豆、胡萝卜、甜菜根中表达。
在适当的阶段，如在收获期，引入表达和/或分泌的本发明酯酶具有可以在降低生长阶段减少对基因转移植物或植物根储备器官结构破坏的危险的优点。
转化的原核细胞或真核细胞的生产方法是现有技术已知的。基因转移真菌如曲霉菌，转化的酵母菌如酵母菌和基因转移植物也是本技术领域已知的，并能够通过专利GB2 301 103、EP479 359和EP449 375中所教导和披露的方法制备。
本发明的主题也是一种制备具有酚酸酯酶活性的酶或酶制剂的方法，其特征在于所述酶是从自然发生的生物体或转化的细胞或能够表达按照本发明的酶的生物体中分离出来的。包括，例如，部分纯化的可作为细胞或生物体提取物的酶制剂也是本发明的主题。本发明的酶制剂可以含有一种或多种进一步的多糖改性和/或降解的酶。所述多糖改性和/或降解的酶优选选自包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、内葡聚糖酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、果胶酶、乙酰酯酶、甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶和其它糖基水解酶的组中。
此外，本发明的酶制剂也可以含有一种或多种进一步地选自包括淀粉酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、植酸酶和脂酶组成的组中的酶。
按照本发明的酶和/或酶制剂的应用包括在从含有酚酸部分的底物中释放酚酸的方法中的应用。
按照本发明所述的酶和/或酶制剂可同样用于改善植物材料的可消化性的动物饲料的生产中，尤其是用于饲料中植物细胞壁具有高含量的酚酸。而且，本发明的酶和/或酶制剂可用于谷类植物包括但不限于玉米、小麦、草和苜蓿，通过预改性细胞壁的含量以改善用于家蓄饲料的可消化性。
本发明的更进一步的主题是饲料添加剂，该添加剂含有按照本发明的具有酚酸酯酶活性的酶或酶制剂和含有所述饲料添加剂的饲料。
本发明的酶和/或酶制剂在生产纸张和纸浆工业中的应用，例如可以帮助从纤维素纸浆中除去木质素。另外，本发明的酶和/或酶制剂与木聚糖水解酶相结合通过增加纸浆中木质素的可溶解性和可提取性而能够降低用于漂白所需要的氯的量。
此外，当与木聚糖酶和/或纤维素酶结合时，本发明的酶和/或酶制剂可用于将植物材料或木质素纤维废物生物转化成糖，例如，用于化学或燃料生产，和/或酚酸的制备。
附图的简要描述
图1：用FAXX作为底物测量的本发明的酚酸酯酶的PH曲线。
图2：用FAXX作为底物测量的本发明的酚酸酯酶的温度曲线。
本发明的详细描述
下面的实施例是对本发明更加详细地说明而不是对本发明主题的限制。实施例1
将分离自马盲肠的(Orpin C.G.，J.Gen.Microbiol.(基因微生物杂志)，1981年第123卷第287～296页)和由E.A.Munn描述的(AnaerobicFungi，Biology，Ecology and Function，由D.O.Mountfort和C.G.Orpin编辑，MarcelDekker，Inc.，纽约，1994年第47～105页)和在布达佩斯条约国际微生物研究所(IMI)登记号为375061保藏的Piromyces equi在厌氧的条件下温度为39℃在含瘤胃分泌液(kem，P.，Lander，D.J.和Orpin，C.G.，基因微生物杂志1984年130卷第27-37页)的带有0.10％可溶木聚糖和0.5％Sigmacell(Sigma化学公司，Poole，Dorset，英国)为碳源的培养基中进行培养。总RNA从上述条件下生长的真菌中提取，通过小(dT)色谱选择多(A)+RNA，并从选定的RNA合成双链cDNA，并将其用ZAP-cDNA合成试剂盒克隆到λZAPII中并按照试剂盒制造者(Stratagene，La Jolla，美国加尼福尼亚)(Xue，G-P等，J.Gen.Microbiol.(基因微生物杂志)，1992年第138卷第1413～1420页和Ali，B.R.S.等，FEMS Microbiol.Lett.(FEMS微生物通讯)，1995年第125卷第15～22页)的指导进行体外包装。重组噬菌体通过在软琼脂涂覆层中大肠杆菌XL1-Blue的菌群上的平铺而生长并用抗纯化的真菌纤维素/半纤维素复合体而产生的抗体对重组噬菌体进行筛选，纯化真菌纤维素/半纤维素复合体的方法按照Ali，B.R.S等发表于FEMS微生物通讯1995年第125卷第15～22页的方法进行。用兔抗复合抗体作为初级抗体进行噬菌斑的抗体筛选，方法是基本上按照picoBlueTM免疫筛选试剂盒(Stratagene)所提供的操作指南进行，并做了下列修改：将异丙基-β-D-吡喃型硫代半乳糖苷(IPTG；0.33mM)直接加入到含有重组λZAPII和宿主细菌(大肠杆菌XL1-Blue)的软琼脂涂覆层中；将噬菌斑提到Hybond-C过滤器上(Amersham)；代替BSA的封闭溶液含有干奶粉(4％重量/体积)；将与辣根过氧化酶(Sigma化学品公司)偶合的抗兔IgG(总分子量)用作第二抗体；着色展开液在50mM三盐酸缓冲液中含有3，3`二氨基联苯胺(0.5毫克/毫升)，PH值为7.4，和过氧化氢(0.5微升/毫升)。酯酶的生产根据Dalrymple，B.P.等发表于FEMS微生物通讯，1996年，第143卷第115～120页上的方法，通过抗体筛选选择的克隆合成能水解[4-甲基散形花酰基(肉桂酸-p-三甲基氯化铵)](4-methylumbelliferoyl(p-trimethylammonium cinnamate chloride)的酶。
根据Sambrook等的Molecular Cloning(分子克隆)：试验室手册(1989年第二版，Cold Spring Harbor，New York)，完成一般分子生物学技术，包括DNA分离、限制酶的消化、络合、转化以及酯酶基因的DNA测序。
完成了本发明的具有酚酸酯酶活性的基因编码酶的核苷酸测序，其结果列于SEQ ID NO：3中。可译框架包括1608个核苷酸，具有预测分子量为55,540道尔顿的536个氨基酸的编码蛋白质。实施例2最适PH值的测定
在含有50mM三盐酸，PH＝9.0，50mM NaCl，10mM MgCl2，200μMdNTPs，50微微摩尔的底物的缓冲溶液中进行PCR反应(30秒94℃，45秒50℃，1分钟72℃的20次循环)产生由SEQ ID NO.1编码的截断的酶。所述底物为：
5`-端：5`-CGCGGATCCAACAGCGGTCCAACTGTTG-3`，
3`-端：5`-GCGAATTCTTATCTTATGGGAGAGAG-3`，
250纳克模板DNA和用载体PET32a(Novagen，Inc.)在大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，Inc.，Wisconsin，USA)中表达。
按照美国Novagen，Inc的指导，将来自新制备的游离细胞的提取物通过键和到Talon树脂上(Clontech Laoratories Inc.，美国加尼福尼亚)并用限定级的Thrombin从金属亲合树脂上洗脱而得到纯化酶，该酶用作PET载体酶。所述酶可进一步按如下方法纯化：用10mM三盐酸平衡一个1毫升MonoQ柱(Pharmacia)，PH值为8.0，将新鲜的酶置于柱上，用氯化钠以1.0毫升/分钟的速度进行梯度淋洗(0～0.5M NaCl在10mM三盐酸中，PH＝8.0)。收集1毫升的流出组分。将酶在PH值的范围为3～7的McIlvaine缓冲溶液(柠檬酸/正磷酸氢二钠，数据见Biochemical Research(生化研究)，第3版，Dawson，Elliot，Elliot，Jones，牛津科学出版社，牛津大学印刷，1987年)或PH值的范围为8～9的含有氯化钾/硼酸的缓冲溶液中进行测定。该测定是在37℃和最终FAXX浓度为33μM的条件下进行的。根据Faulds，C.B.和Williamson，G.，在Microbiology(微生物学)，1994年，140卷，第779～787页上发表的方法对由FAXX释放出的阿魏酸在335nm处连续监测3分钟。
测定的结果示于图1中。从图1可以推导出，本发明的酶在PH约为5.5和约为8.5时表现出50％的活性。为了决定在用FAXX作为底物时本发明的酶的最适温度，将FAXX以33μM的浓度进行使用并且在PH＝6.0的100mM的MOPS缓冲溶液中进行测定。用恒温控制分光光度计将孵化温度从20℃～70℃变化。对由FAXX释放出的阿魏酸在335nm处按照上述方法进行测量。结果如图2所示。动力学
本发明酶的Km和Vmax用FAXX和Ara2F(O-[2-O-(反阿魏酰基)-α-呋喃型阿拉伯糖基]-(1-5)-L-呋喃型阿拉伯糖作为底物进行测定。使用FAXX的浓度范围为3.72～49.18μM，使用Ara2F的浓度范围为4.46～122.92μM。在温度为37℃，PH＝6.0的100mM的MOPS((3-[N-吗啉]-丙烷磺酸))带有90纳克酶的缓冲溶液中进行测定。对于在两种底物中的阿魏酸的释放在335nm处按照上述方法进行测量。
基于上述的实验结果所决定本发明酶的动力学常数如下：底物 Km VmaxFAX 3.0±0.3μM 35.6±0.9微摩尔/分钟/毫克Ara2F 234±27μM 19.6±1.7微摩尔/分钟/毫克
因此，当在上述条件下使用FAXX作为底物测量时本发明的酶具有约3.0的Km和约35的Vmax。
本发明的酶对阿魏酸甲酯、香豆酸基酯和P-香豆酸甲酯的特定活性的测定是在37℃，含有100mMMOPS缓冲溶液(带有0.02％的叠氮化合物)，PH＝6.0，44纳克酶和1mM的上述底物的条件下进行的。在孵化15分钟以后，煮沸终止该反应，并用反相HPLC测定所释放的自由酸(Kroon，P.A.和Williamson，G.，Biotechnol.Appl.Biochem.，1996年，23卷263～267页)。上述实验结果如下所示。
此外，本发明的酶对乙酸对硝基苯基酯、乙酸α-萘基酯、丁酸α-萘基酯、己酸α-萘基酯、辛酸α-萘基酯和月桂酸α-萘基酯的特异活性的测定根据Ferreira，L.M.A.等所描述的方法进行(Biochem.J.，1993年294卷，349～355页)。上述测定结果如下所示。 底物 特异活性(U*/毫克) 乙酸对硝基苯基酯 204.3 乙酸α-萘基酯 121 丁酸α-萘基酯 220 己酸α-萘基酯 256 辛酸α-萘基酯 54 月桂酸α-萘基酯 6 阿魏酸甲酯 10.6 香豆酸基酯 10.5 P-香豆酸甲酯 2.7U*定义为给出1毫摩尔/分钟的酯水解的酶的量。序列清单(1)一般信息 (i)申请人：
(A)名字：生物技术和生物科学研究委员会
(B)街区：Polaris House，North Star Avenue
(C)城市：Swindon
(D)州：
(E)国家：英国
(F)邮编：SN2 1UH (ii)发明名称：酚酸酯酶及其应用 (iii)序列数：4 (iv)可机读形式：
(A)培养基类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息： (i)序列特征
(A)长度：825个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：DNA(基因组的) (vi)最初来源：
(A)生物体：Piromyces equi(ix)特征： (A)名字/键：CDS (B)座位：1..822(xi)序列描述：SEQ ID NO：1AAC AGC GGT CCA ACT GTT GAA TAC TCT ACT GAT GTT GAC TGT TCC GGT 48Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly 1 5 10 15AAG ACC CTT AAG AGT AAC ACC AAC CTT AAC ATC AAT GGT CGT AAG GTT 96Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val
20 25 30ATT GTA AAA TTC CCA AGC GGC TTC ACT GGT GAC AAG GCT GCT CCA CTT 144Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu
35 40 45CTT ATT AAC TAC CAT CCA ATT ATG GGT AGT GCT TCT CAA TGG GAA AGT 192Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser
50 55 60GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT GAT GGT GCC ATC GTT GCT 240Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala 65 70 75 80TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA CAA GCT TGG AAC GTT GGT 288Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly
85 90 95CCA TGT TGT ACT GAT GCT GAT GAT GTT CAA TTC ACT CGT AAC TTC ATT 336Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile
100 105 110AAG GAA ATC ACT AGT AAG GCT TGT GTT GAT CCA AAG CGT ATC TAT GCT 384Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala
115 120 125GCT GGT TTC TCT ATG GGT GGT GGT ATG TCT AAC TAT GCT GGT TGT CAA 432Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln
130 135 140CTT GCT GAT GTT ATT GCT GCT GCT GCT CCA TCA GCC TTT GAT CTT GCC 480Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145 150 155 160AAG GAA ATT GTT GAT GGT GGT AAA TGT AAA CCA GCT CGT CCA TTC CCA 528Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro
165 170 175ATC CTT AAC TTC CGT GGT ACT CAA GAT AAC GTT GTT ATG TAC AAC GGT 576Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly
180 185 190GGT CTT TCT CAA GTT GTT CAA GGT AAG CCA ATT ACT TTC ATG GGT GCC 624Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala
195 200 205AAG AAC AAC TTC AAG GAA TGG GCT AAG ATG AAC GGA TGT ACT GGT GAA 672Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu
210 215 220CCA AAA CAA AAC ACT CCA GGT AAC AAC TGT GAA ATG TAC GAA AAC TGT 720Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225 230 235 240AAG GGT GGT GTT AAG GTT GGT CTT TGC ACT ATC AAC GGT GGT GGT CAC 768Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His
245 250 255GCT GAA GGT GAC GGT AAA ATG GGT TGG GAC TTT GTT AAA CAA TTC TCT 816Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser
260 265 270CTC CCA TAA 825Leu Pro(2)SEQ ID NO：2的信息： (i)序列特征：
(A)长度：274个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly 1 5 10 15Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val
20 25 30Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu
35 40 45Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser
50 55 60Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala 65 70 75 80Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly
85 90 95Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile
100 105 110Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala
115 120 125Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln
130 135 140Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145 150 155 160Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro
165 170 175Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly
180 185 190Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala
195 200 205Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu
210 215 220Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225 230 235 240Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His
245 250 255Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser
260 265 270Leu Pro(2)SEQ ID NO：3的信息： (i)序列特征：
(A)长度：1611个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(vi)最初来源： (A)生物体：Piromyces equi(ix)特征： (A)名字/键：CDS (B)座位：1..1608(xi)序列描述：SEQ ID NO：3ATG AAG ACT AGC ATT GTA TTA TCT ATC GTT GCT TTA TTT TTA ACA TCC 48Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser275 280 285 290AAA GCT TCT GCT GAT TGT TGG TCA GAA AGA TTA GGT TGG CCA TGC TGT 96Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys
295 300 305AGT GAC AGC AAT GCC GAA GTA ATC TAC GTC GAT GAC GAT GGT GAT TGG 144Ser Asp Ser Asn Ala Glu Val Ile Tyr Val Asp Asp Asp Gly Asp Trp
310 315 320GGT GTT GAA AAT AAT GAC TGG TGT GGT ATC CAA AAG GAA GAA GAA AAC 192Gly Val Glu Asn Asn Asp Trp Cys Gly Ile Gln Lys Glu Glu Glu Asn
325 330 335AAT AAC TCA TGG GAT ATG GGT GAT TGG AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGT 240Asn Asn Ser Trp Asp Met Gly Asp Trp Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly
340 345 350GGC GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT GGC GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG 288Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met355 360 365 370CAA TGG GGT GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGC 336Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly
375 380 385GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTT GGC 384Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
390 395 400GGT AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGC GGT GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT 432Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe
405 410 415GGA GGA AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT 480Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp
420 425 430TTC GGA GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA 528Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly435 440 445 450AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT TTC GGA 576Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
455 460 465GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA AAC CAA 624Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln
470 475 480GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTC GGA GGT AAC 672Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn
485 490 495CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAT TTC GGA GGT AAT CAA GGT GGT 720Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly
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580 585 590GCT TCT CAA TGG GAA AGT GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT 1008Ala Ser Gln Trp Glu Ser Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn595 600 605 610GAT GGT GCC ATC GTT GCT TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA 1056Asp Gly Ala Ile Val Ala Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly
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805 810(2)SEQ ID NO：4的信息： (i)序列特征：
(A)长度：536个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser 1 5 10 15Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys
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