一组从山莓叶中分离出的新化合物、制备方法及其用途 【技术领域】
本发明涉及山莓叶中提取分离出的一组三个新化合物、制备方法以及其在制备抗肿瘤药物方面的用途。
背景技术
山莓(Rubus corchorifolius L.f)属蔷薇科悬钩子属中一种落叶灌木。多生长于向阳山坡、溪边、山谷、荒地和灌丛中，海拔300m～1500m。除东北、内蒙古、青海、新疆、西藏外，全国均有分布。福建全省各地均有山莓分布，野生资源蕴藏量相当大。我国利用山莓的历史悠久，在古书《本草拾遗》、《本草纲目》、《名医别录》、《食疗本草》中就有山莓药用价值的详细记载，其药用已有上千年历史。山莓果、根及叶均可入药。地上部分(叶、幼果和茎)所含的香豆素化合物，如东茛菪内酯具有一定的镇痛、抗炎、祛痰和平喘的作用。在湘西、鄂西北山莓作为常用的苗族药，用于医治常见的多发病，如腹泻、目赤、酒精中毒等，疗效确切。
目前有关山莓的研究主要是集中在资源的开发利用方面，陈炳华利用其聚合果，用于食品加工；利用其鞣质作为化工原料，近年来又关山莓的化学成分研究不断增多，陈炳华等首次从山莓茎叶中分离到了一种香豆素，经理化试验和多种波谱分析鉴定为6-甲氧基-7-羟基香豆素，即东莨菪内酯(Scopletin)；同时报道山莓全株含鞣质、黄酮类化合物，地上部分(叶、茎、幼果)含香豆素化合物，根中含酚性成分和皂甙。张敏测得山莓叶中总黄酮含量为1.18mg/g。张琰等报道了莓果实的营养成分为保礼等人从山莓叶中提取出得到茶多酚，含量达5.15％。毕金峰等报道山莓果实中含有大量的鞣化酸。陈雪香等报道山莓叶醇提物中的成分主要含有有机酸、糖类、黄酮及其甙类、鞣质、酚类、强心甙、香豆素、甾体、萜类。张敏等对山莓乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行了研究，从中分离得到了2个贝壳杉烷二萜新化合物。
【发明内容】
本发明的目的是提供从山莓中分离出的三个新化合物，由山莓叶粗提取经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶的方法所得，活性实验证明该组化合物具有抗肿瘤作用。
本发明所提供的一组三个新化合物是从山莓叶的粗提物中经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶的方法所得，化学名称分别为：化合物1：对映-9β，16α，17三羟基-贝壳杉-2酮(ent-9β，16α，17-trihydroxy-kaur-2-one)，化合物2：对映-16α，17，19三羟基-贝壳杉-2酮(ent-16α，17，19-trihydroxyl-kaur-2-one)，化合物3：对映-2β，3α，16α，17-四羟基-贝壳杉醇(t-2β，3α，16α，17-tetrahydroxyl-kauranol)，经波谱解析和化学方法确定了化合物1、化合物2，化合物3的结构，分别为：
化合物1
化合物2
化合物3
上述三个化合物由包括以下步骤的制备方法所得：
(1)称取粉碎的山莓叶，加入10倍体积80％的乙醇，搅匀，先超声提取30min，然后于室温下浸提48h，过滤，滤渣再重复提取一次，合并滤液，浓缩冷冻干备用；
(2)将浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩，冷冻干燥，分别得石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用正己烷与乙酸乙酯、乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC检测，显色，合并相同组份，浓缩冻干；
(4)将柱层析I中的一个组份进行第二次硅胶柱层析分离纯化，用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC检测合并相同组份，浓缩冻干；
(5)将柱层析II中的一个组份再进行硅胶柱层析分离，用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，洗脱液经TLC检测，合并相同组份，浓缩至小体积，分别进行重结晶，分别得化合物1、化合物2，化合物3。
步骤(3)中，进行梯度洗涤时，正己烷与乙酸乙酯的体积比依次为：100∶0，50∶50，乙酸乙酯与甲醇的体积比依次为100∶0，80∶1，40∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1。
步骤(4)中，进行梯度洗脱时，氯仿和甲醇的体积比依次为100∶0，80∶1，40∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1。
步骤(5)中，进行梯度洗脱时，氯仿和甲醇的体积比依次为40∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1。
活性实验证明该三个新化合物均具有很好的抗肿瘤作用。
该组化合物的一种或两种以上的混合物在制备抗肿瘤药物方面的用途。
该组化合物的一种或两种以上的混合物在制备保健品方面的用途。
该组化合物的一种或两种以上的混合物在制备抗肿瘤药物组分之一的用途。
本发明三个化合物的结构测定：
(一)、对映-9β，16α，17三羟基-贝壳杉-2酮的结构测定
1、理化与光谱数据
(1)该化合物为白色晶体，M.p.170～172℃，旋光度：170.18°：全波段扫描λmax＝224nm(甲醇)，石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5，Rf＝0.28，1％香草醛硫酸溶液显为单一蓝色斑点。
(2)化合物13C-NMR信号为(CD3OD，400MHZ)：216.7(s)，82.9(s)，78.5(s)，66.7(t)，57.2(t)，51.4(t)，51.0(s)，50.3(s)，48.3(d)，47.9(t)，45.1(d)，39.6(s)，39.0(t)，37.6(t)，34.0(q)，30.3(t)，28.6(t)，23.6(q)，21.7(t)，21.5(q)。
(3)化合物1H-NMR信号为(CD3OD，100MHZ)：0.886(s，3h)；1.076(s，3h)；1.102，1.138(d，1h)；1.115(s，3h)；1.206-1.297(m，1h)；1.36-1.42(m，1h)；1.445-1.485(m，1h)；1.5-1.6(m，1h)；1.64-1.82(m，3h)；1.831，1.848，1.868，1.886(dd，1h)；1.941，1.951，1.974，1.984(dd，1h)；2.0-2.12(m，4h)；2.178，2.181，2.207，2.213(dd，1h)；2.234，2.239，2.272，2.277(dd，1h)；2.329，2.362(d，1h)；2.847，2.878(d，1h)；3.568，3.588(d，1h)；3.688，3.697(d，1h)。
(4)IR(KBr)：Vmax cm-1：35403330(OH)，29432926(V C-H)，1692(C＝O)。
2、结构推导
(1)分子式的确定：APCI-MS给出准分子量354(M+H2O)，336(M)，318(M-H2O)，说明该化合物分子量为336，因此推出分子式为C20H32O4，Ω等于5。
(2)结构式的确定
①化合物平面结构的确定：由HHCOSY，HMQC，HMBC图谱，发现有以下结构片段：
片段I 片段II
片段III 片段IV
至此，还剩30.3(t)，28.6(t)两个碳，很容易，根据不饱和度，之其平面构如下：
②化合物立体结构的确定
通过查阅文献，与大量类似物比较，其NMR数据与ent-kaurane型一致
证明了其空间立体结构为ent-kaurane型四环二萜。NOE试验也可见相关信号，结构如下：
(二)对映-16α，17，19三羟基-贝壳杉-2酮结构测定
1、理化与光谱数据
(1)白色晶体，M.p.223～225℃，旋光度：200.0°：，全波段扫描λmax＝207nm(甲醇)，石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5，Rf＝0.23，1％香草醛硫酸溶液显为单一红色斑点。
(2)化合物13C-NMR信号为(CD3OD，400MHZ)：214.9(s)，82.7(s)，66.8(t)，66.1(t)，57.1(d)，57.0(t)，56.6(d)，53.5(t)，50.9(t)，46.2(d)，45.8(s)，45.3(s)，44.9(s)，42.9(t)，37.7(t)，27.7(q)，26.9(t)，22.0(t)，20.0(q)，19.6(t)。
(3)化合物1H-NMR信号为(CD3OD，100MHZ)：1.042(s，3h)；1.11(s，3h)；1.312，1.332(d，1h)；1.4-1.7(m，11h)；1.776，1.771，1.803.1.806(m，1h)；1.841，1.871(d，1h)；2.039(brs，1h)；2.039，2.071(d，1h)；2.111，2.146(d，1h)；2.447，2.452，2.479，2.484(dd，1h)；2.513，2.518，2.548，2.554(dd，1h)；3.360，3.389(d，1h)；3.475，3.503(d，1h)；3.582，3.610(d，1h)；3.687，3.716(d，1h)。
(4)IR(KBr)：FTIRVmax cm-1：35403440(OH)，29432921(VC-H)，1692(C＝O)。
2、结构推导
(1)分子式的确定：APCI-MS给出准分子量354(M+H2O)，336(M)，318(M-H2O)，说明该化合物分子量为336，因此推出分子式为C20H32O4，Ω等于5。
(2)平面结构的确定
由HHCOSY，HMQC，HMBC图谱，发现有以下结构片段：
片段I 片段II
片段III 片段IV
至此20个碳原子都已找到相关，前述不饱和度为5，所以其平面结构为一贝壳杉烷型四环二萜类成分：
(3)立体结构的确定
通过查阅文献，与大量类似物比较，其NMR数据与ent-kaurane型一致，体现在C-NMR中，如下表：
表1 C-NMR数据
NOE谱中也可见到相关，故确定化合物结构如下：
化合物2的立体结构
因此，化合物命名为：对映-16α，17，19三羟基-贝壳杉-2酮(Ent-16α，17，19α-trihydroxyl-kauran-2-one)。
(三)对映-2β，3α，16α，17-四羟基-贝壳杉醇结构测定
1、理化与光谱数据
(1)白色晶体，M.p.169～170℃，旋光度：-16.13°，全波段扫描λmax＝278nm(甲醇)，1％香草醛硫酸溶液显为单一蓝色斑点。
(2)化合物13C-NMR信号为(CD3OD，400MHZ)：82.7(s)，78.9(d)，70.4(d)，66.9(t)，58.4(d)，53.7(t)，51.6(d)，47.9(t)，46.3(d)，45.7(s)，42.3(t)，40.5(s)，38.7(s)，37.7(t)，27.1(t)，25.3(q)，23.8(q)，23.3(q)，22.6(t)，20.0(t)。
(3)化合物1H-NMR信号为(CD3OD，100MHZ)：0.887(s，3h)；0.992(s，3h)；1.124-1.189(m，2h)；1.236(s，3h)；1.367，1.402(d，1h)；1.42-1.72(m，12h)；1.854，1.883(d，1h)；2.021，2.027(brs，1h)；3.509，3.532(d，1h)；3.581，3.609(d，1h)；3.68-3.74(m，2h)。
(4)IR(KBr)：FTIRVmax cm-1：3180(OH)，29252857(VC-H)。
2、结构推导
(1)分子式的确定：APCI-MS给出准分子量356(M+H2O)，320(M-H2O)，说明该化合物分子量为338，因此推出分子式为C20H34O4，Ω等于4。
(2)平面结构的确定
由HHCOSY，HMQC，HMBC图谱，发现有以下结构片段：
片段I 片段II
片段III 片段IV
至此还有三个CH2信号，未得到说明，根据不饱和度为4，可将化合物的结构定为如下：
(3)立体结构的确定
(1)通过与类似物比较，其NMR数据与ent-kaurane型一致，体现在C-NMR中，如下表：
表2 NMR数据与ent-kaurane型比较
2，3二羟基构型的确定：氢3.509，3.532(d，1h)连接在碳78.9(d)上，双峰是因为受到2位氢的耦合裂分，计算耦合常数J为11.5HZ，所以2和3位两个羟基必须均处于e键上。故为2β，3α。NOE谱中也可见到相关，故确定3号结构如下：
因此该化合物4命名为：对映-2β，3α，16α，17-四羟基-贝壳杉醇(Ent-2β，3α，16α，17-tetradroxyl-kauranol)。
【具体实施方式】
从山莓中分离出的三种新化合物，化学名称分别为：化合物1、对映-9β，16α，17三羟基-贝壳杉-2酮(ent-9β，16α，17-trihydroxy-kaur-2-one)，化合物2、对映-16α，17，19三羟基-贝壳杉-2酮(ent-16α，17，19-trihydroxyl-kaur-2-one)，化合物3、对映-2β，3α，16α，17-四羟基-贝壳杉醇(t-2β，3α，16α，17-tetrahydroxyl-kauranol)，经波谱解析和化学方法确定了化合物1、化合物2、化合物3的结构，分别为：
化合物1
化合物2
化合物3
该三个化合物由以下方法分离所得：
(1)山莓叶乙醇粗提物的制备：称取粉碎的山莓叶3500.0g，加入10倍体积80％的乙醇，搅匀，先超声提取30min，然后于室温下浸提48h，过滤，滤渣再重复提取一次，合并滤液，浓缩冷冻干备用。
(2)、山莓活性成分液液萃取分离纯化：将浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，将萃取液分别浓缩，冷冻干燥。分别得石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物。
(3)、将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，依次用不同浓度的正己烷与乙酸乙酯、乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱，正己烷与乙酸乙酯的体积比依次为：100∶0，50∶50，乙酸乙酯与甲醇地体积比依次为100∶0，80∶1，40∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1。收集洗脱液，经TLC检测，显色，合并相同组份，浓缩冻干；
(4)、将柱层析I中的一个组份进行第二次硅胶柱层析分离纯化，用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，氯仿和甲醇的体积比依次为100∶0，80∶1，40∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，收集洗脱液，经TLC检测合并相同组份，浓缩冻干；
(5)、将柱层析II中的一个组份再进行硅胶柱层析分离，用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，氯仿和甲醇的体积比依次为40∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1，洗脱液经TLC检测，合并相同组份，浓缩至小体积，分别进行重结晶，分别得化合物1、化合物2，化合物3。
本发明中三个新化合物抗肿瘤活性的测定：
1、实验材料
1.1药品：上述分离的化合物1、2、3。
1.2细胞：人肝癌细胞株HepG2由广州泰禾生物医药公司提供。
1.3试剂：PRMI1640，胎牛血清，96孔板，胰酶，DMSO，MTT，5-FU，青霉素，链霉素。
2、方法
将肝癌HepG2细胞培养于含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中，37℃，5％CO2培养箱内常规传代培养。细胞以1×104个/孔的浓度接种于96孔培养板，于含10％的胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养24h，细胞贴壁后，实验组给药量为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、，阴性对照组加等量RPMI(DMSO含量为1％)，阳性对照组加入5-Fu的浓度为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL。空白对照组只加等量RPMI。药物作用24h后，于每孔中加入配制的5％MTT 20μL继续培养4h，弃上清，加入150μL DMSO，在混合振荡仪上振药约10min，使结晶物充分溶解后，于酶联检测仪上492nm波长测定各孔吸光值。
计算癌细胞的抑制率(CT％)，CT％＝(1-OD处理/OD对照)×100％。
3、实验结果(见表3、表4、表5)
表3 化合物1对肝癌HepG2细胞的抑制作用
表4 化合物2对肝癌HepG2细胞的抑制作用
表5 化合物3对肝癌HepG2细胞的抑制作用
上述实验结果表明：化合物对映-9β，16α，17三羟基-贝壳杉-2酮，对映-16α，17，19三羟基-贝壳杉-2酮和对映-2β，3α，16α，17-四羟基-贝壳杉醇对肝癌HepG2细胞均具有明显的抑制作用，且具有良好的量效关系。