技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体及其创制方法。
背景技术
定点突变是指在目的DNA 片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。对某个已知的基因的特定碱基进行定点改造、缺失、或者插入，可以改变对应氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。
类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质，如可作为生长物质和植物激素（细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯）、光合色素（如叶绿素、类胡萝卜素）、膜结构的一部分如谷甾醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长如异戊烯基蛋白。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如橡胶、食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素等。类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，甲羟戊酸激酶（MVK,MK;ATP:mevalonate-5-phosphotransferase;EC2.7.1.36）是该代谢途径中三个连续ATP依赖酶中的第一个，它将ATP γ位上的一个磷酸基团转移到甲羟戊酸第5位的羟基上形成甲羟戊酸-5-磷酸，并伴随着ADP的释放，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、橡胶（Hevea brasiliensis）、蓖麻（Ricinus communis）等植物中分离克隆了甲羟戊酸激酶基因，在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于创制小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体、对基因突变体进行原核基因表达、酶蛋白分离纯化及其酶活性体外检测和酶动力学参数研究等资料信息。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体及其创制方法。
本发明的目的是提供小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体及其创制方法，可以高效获得小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体，便于改善小麦等作物的农艺性状，提高产量，并可以进行分子生物学的基础研究。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体创制方法，按照下述方法定点突变而成：将小麦甲羟戊酸激酶TaMVK保守区中与其它植物不同的氨基酸序列对应的DNA序列定点突变。
优选的，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体创制方法，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK保守区中第14A、24A、35Q、135V、139G、142M、144A、153S、165L和332N位置氨基酸，分别突变为14S、24T、35N、35R、135E、139D、142L、142F、142Y、144S、153C、165M和332S。
优选的，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体创制方法，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK突变体的上下游引物分别为：
A14S:F序列为SEQ ID NO.6 ，A14S:R序列为SEQ ID NO.7，密码子由GCC突变为TCC；
A24T:F序列为SEQ ID NO.8，A24T:R序列为SEQ ID NO.9，密码子由GCC突变为ACC；
Q35N:F序列为SEQ ID NO.10，Q35N:R序列为SEQ ID NO.11，密码子由CAG突变为AAC；
FQ35R:F序列为SEQ ID NO.12，FQ35R:R序列为SEQ ID NO.13，密码子由CAG突变为CGG；
V135E:F序列为SEQ ID NO.14，V135E:R序列为SEQ ID NO.15，密码子由GTG突变为GAG；
G139D:F序列为SEQ ID NO.16，G139D:R序列为SEQ ID NO.17，密码子由GGC突变为GAC；
M142L:F序列为SEQ ID NO.18，M142L:R序列为SEQ ID NO.19，密码子由ATG突变为CTG；
M142F:F序列为SEQ ID NO.20，M142F:R序列为SEQ ID NO.21，密码子由ATG突变为TTT；
F142Y:F序列为SEQ ID NO.22，F142Y:R序列为SEQ ID NO.23，密码子由TTT突变为TAT；
A144S:F序列为SEQ ID NO.24，A144S:R序列为SEQ ID NO.25，密码子由GCC突变为TCC；
S153C:F序列为SEQ ID NO.26，S153C:R序列为SEQ ID NO.27，密码子由TCC突变为TGC；
L156M:F序列为SEQ ID NO.28，L156M:R序列为SEQ ID NO.29，密码子由TTG突变为ATG；
N332S:F序列为SEQ ID NO.30，N332S:R序列为SEQ ID NO.31，密码子由AAC突变为TCC。
本发明提供了小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体创制方法创制的小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体 TaMVK/A14S、TaMVK/A24T、TaMVK/Q35N、TaMVK/Q35R、TaMVK/V135E、TaMVK/G139D、TaMVK/M142L、TaMVK/M142F、TaMVK/F142Y、TaMVK/A144S、TaMVK/S153C、TaMVK/L165M和TaMVK/N332S，分别为所述小麦甲羟戊酸激酶TaMVK保守区中第14A、24A、35Q、135V、139G、142M、144A、153S、165L和332N位置氨基酸，分别突变为14S、24T、35N、35R、135E、139D、142L、142F、142Y、144S、153C、165M和332S。
优选的，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体，所述的小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体 TaMVK/A14S、TaMVK/A24T、TaMVK/Q35N、TaMVK/Q35R、TaMVK/V135E、TaMVK/G139D、TaMVK/M142L、TaMVK/M142F、TaMVK/F142Y、TaMVK/A144S、TaMVK/S153C、TaMVK/L165M和TaMVK/N332S，上下游引物分别为：
A14S:F序列为SEQ ID NO.6 ，A14S:R序列为SEQ ID NO.7，密码子由GCC突变为TCC；
A24T:F序列为SEQ ID NO.8，A24T:R序列为SEQ ID NO.9，密码子由GCC突变为ACC；
Q35N:F序列为SEQ ID NO.10，Q35N:R序列为SEQ ID NO.11，密码子由CAG突变为AAC；
FQ35R:F序列为SEQ ID NO.12，FQ35R:R序列为SEQ ID NO.13，密码子由CAG突变为CGG；
V135E:F序列为SEQ ID NO.14，V135E:R序列为SEQ ID NO.15，密码子由GTG突变为GAG；
G139D:F序列为SEQ ID NO.16，G139D:R序列为SEQ ID NO.17，密码子由GGC突变为GAC；
M142L:F序列为SEQ ID NO.18，M142L:R序列为SEQ ID NO.19，密码子由ATG突变为CTG；
M142F:F序列为SEQ ID NO.20，M142F:R序列为SEQ ID NO.21，密码子由ATG突变为TTT；
F142Y:F序列为SEQ ID NO.22，F142Y:R序列为SEQ ID NO.23，密码子由TTT突变为TAT；
A144S:F序列为SEQ ID NO.24，A144S:R序列为SEQ ID NO.25，密码子由GCC突变为TCC；
S153C:F序列为SEQ ID NO.26，S153C:R序列为SEQ ID NO.27，密码子由TCC突变为TGC；
L156M:F序列为SEQ ID NO.28，L156M:R序列为SEQ ID NO.29，密码子由TTG突变为ATG；
N332S:F序列为SEQ ID NO.30，N332S:R序列为SEQ ID NO.31，密码子由AAC突变为TCC。
小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体的应用，其特征在于：小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体在改变甲羟戊酸激酶基因在小麦等作物及其它植物中表达，改变次生代谢产物产量、改善籽粒大小、粒重农艺性状的应用；以及对小麦甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构研究，研究启动子功能、开发有关分子标记的应用。
本法的有益之处如下：
本发明通过改变小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK中特定氨基酸密码子来提高或降低其编码酶的催化活性，为进一步进行基因改造和修饰、构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记等提供重要技术储备。
本发明从克隆的小麦品种“济麦22”的野生型甲羟戊酸激酶基因，创制了小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK的13个基因突变体，分别为TaMVK/A14S、TaMVK/A24T、TaMVK/Q35N、TaMVK/Q35R、TaMVK/V135E、TaMVK/G139D、TaMVK/M142L、TaMVK/M142F、TaMVK/F142Y、TaMVK/A144S、TaMVK/S153C、TaMVK/L165M和TaMVK/N332S，并获得了相关酶对底物MVA（甲羟戊酸）和ATP的酶动力学参数，证明通过对小麦甲羟戊酸激酶基因特定氨基酸密码子的改变，能够显著提高或降低酶的催化活性。
附图说明
图1是小麦甲羟戊酸激酶的分离纯化(43kD)电泳图，其中1为蛋白沉淀，2为蛋白上清，3-7为洗脱的蛋白，Marker为蛋白质分子质量标准。
图2是小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK突变体蛋白的分离纯化电泳图，其中1为A14S，2为A24T，3为G139D，4为S153C，5为M142L，6为M142F，6-1为F142Y，7为A144S，8为Q35N，9为Q35R，10为V135E，11为L156M，12为N332S，MVK为野生型蛋白。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的技术范围。
实施例1 小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体及其创制方法
一、实验方法
步骤1 小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK扩增
步骤1.1设计引物序列：
mvkF（SEQ ID NO.1）:
5′GAGGATCGCATCATCACCACCATCACGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGC 3′
mvkR（SEQ ID NO.2）:
5′CTGCAGAAGCTTTTATCCTTGGTGAATCTGAAGACCTTG3′
步骤1.2小麦TaMVK基因全长系列扩增
PCR反应体系为20μl ，组分如下：
mvkF 1μl
mvkR 1μl
5×FastPfu Buffer 4μl
2.5 mM dNTP 2μl
济麦22 cDNA 1μl
FastPfu DNA Polymerase 0.4μl
ddH2O 10.6μl
PCR 程序为94℃预变性5 min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃
延伸1.5min，共 34个循环，72℃延伸10min，16℃保温。
步骤1.3扩增产物的回收
（1） 吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中 ）加入450μl平衡液BL，13,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）。
（2） 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离 心管中，称取重量。
（3） 向胶块中加入等倍体积溶液PC（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µl PC溶液），50℃水浴放置10 min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
（4） 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
（5） 向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇）， 13,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
（6） 重复操作步骤5。
（7） 将吸附柱CB2放入收集管中，13,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（8） 将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓 冲液EB，室温放置2 min。13,000 rpm (~13,400×g )离心2 min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。
步骤1.4 PCR产物的连接与转化
根据回收片段的浓度，确定产物和pEASY- Blunt Simple Cloning Vector之间的比例。连接转化步骤如下：
（1） 在200µl的EP管中加入4µl回收DNA产物和1µl 载体轻轻混匀。
（2） 25℃孵育10min，后置于冰上。
（3） 加连接产物于50 μl E.coli DH5α感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连 接产物），轻弹混匀，冰浴20-30 min。
（4） 42℃热激90 秒，立即置于冰上2 min。
（5） 加1ml无抗生素的LB培养基，160rpm，37℃孵育1h。
（6） 6000rpm离心3 min，弃掉部分上清，保留100-150 μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃培养过夜。
步骤1.5 阳性克隆子的鉴定
配制菌体PCR体系20μl，组分如下：
M13F 1μl
M13R 1μl
EASYTaq Mix 10μl
H2O 8μl
选取边缘清晰、饱满圆滑的10个克隆菌落，挑于1ml LB培养基中，做好编号，对应点入PCR 体系中。
PCR 反应条件：94℃预变性10 min（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性30 sec，55℃退火 30 sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃后延伸10 min，16℃保温。
步骤2小麦TaMVK基因全长开放阅读框的原核表达
步骤2.1 设计表达引物
PLM1F1（SEQ ID NO.3）:
5′CGCGCGGTACCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACC3′
PLM1F2（SEQ ID NO.4）:
5′GAGGATCGCATCATCACCACCATCACGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGC3′
PLM1R（SEQ ID NO.5）:
5′CTGCAGAAGCTTTTATCCTTGGTGAATCTGAAGACCTTG3′
步骤2.2 TaMVK开放阅读框序列的扩增
以连接于质粒pEASY- Blunt Simple Cloning Vector上的全长序列为模板进行PCR扩增， 需要两轮PCR。
第一轮PCR
20μl PCR体系，组分如下：
PLM1F2 1μl
PLM1R 1μl
5×FastPfu Buffer 4μl
2.5 mM dNTP 2μl
质粒 1μl
FastPfu DNA Polymerase 0.4μl
ddH2O 10.6μl
PCR程序为94℃预变性5 min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共10个循环，72℃延伸10min，16℃保温。
第二轮PCR
20μl PCR体系，组分如下：
PLM1F1 0.8μl
PLM1R 0.8μl
5×FastPfu Buffer 4μl
2.5 mM dNTP 2μl
第一轮PCR产物 1μl
FastPfu DNA Polymerase 0.4μl
ddH2O 11μl
PCR程序为95℃预变性5 min，95℃变性30sec，60℃退火 30sec，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃延伸10min，16℃保温。
步骤2.3切胶回收目的条带，酶切回收产物和表达质粒
酶切体系如下：
表达质粒pLM1酶切体系15μl
Kpn1 0.75μl
Hind III 0.75μl
10×Green buffer 1.5μl
pLM1 10μl
ddH2O 2μl
TaMVK全长序列PCR扩增产物酶切体系20μl
Kpn1 1μl
Hind III 1μl
10×Green buffer 2μl
PCR 产物 12μl
H2O 4μ
步骤2.4连接构建表达载体pLM 1-TaMVK
根据酶切后回收片段的浓度，确定产物和pLM1载体之间的比例，连接体系如下：
pLM1 4μl
回收PCR酶切产物 4μl
10×Buffer 1μl
T4 DNA Ligase 1μl
于16℃连接过夜。
步骤2.5 pLM1-TaMVK对E. coli DH5α感受态细胞的转化
选取阳性克隆提取质粒并测序鉴定。
步骤2.6 pLM1-TaMVK重组质粒对E. coli BL21表达感受态细胞的转化
选取测序正确的质粒转化E. coli BL21表达感受态细胞。
步骤2.7表达细胞E. coli BL21的扩大培养及诱导TaMVK表达
（1）转化进pLM1-TaMVK重组质粒的E. coli BL21 菌种接种到20 ml的LB培养基(Amp浓度为100mg/ml)中，37℃、160rpm过夜培养。
（2）取5ml过夜培养的菌液加到500 ml LB培养液中(Amp浓度100mg/ml)。37℃、160rpm 摇床培养1.5h至菌体OD600=0.8时，加入IPTG(终浓度为1.5mM)。
（3） 28℃过夜培养。
（4） 6000r/min离心10min，收集菌体用100ml去离子水冲洗菌体，6000r/min离心10min，收集菌体。
步骤2.8酶蛋白的分离纯化
（1）加入40 mL起始缓冲液（Start buffer）重悬菌体。
（2）加入5mg溶菌酶，37℃水浴lh。
（3）于-80℃放置至少lh。
（4）30℃水浴解冻。
（5）超声破碎细胞1h(破碎5s，间隔10s)。
（6）9000r离心10min，上清液用于蛋白纯化。
（7）Ni-Trap 柱与0.45μm的过滤器连接好，注射器吸取5 ml灭菌水注入柱中一滴一滴地排除柱内的乙醇。
（8）再取3-5 ml的0.1M硫酸镍注入柱中，用5 ml去离子水洗掉没有结合的镍离子，然后用5 ml的起始缓冲液（Start buffer）平衡。
（9）取20 ml离心后的上清液注入柱中。
（10）用5 ml起始缓冲液（Start buffer）洗柱。
（11）用8ml冲洗缓冲液（Wash buffer）洗柱。
（12）用5 ml的洗脱缓冲液（Elution buffer）溶解目的蛋白，并用1.5 ml离心管接样，每 0.5ml一管。
步骤2.9 SDS-PAGE电泳检测蛋白质
（1）分离胶配制：
去离子水 2.5ml
30%Arc-Bis母液 3.35 ml
1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2 ml
10% SDS 80μl
10% AP 80μl
TEMED 3.5 μl
（2）浓缩胶配制：
去离子水 1.7 ml
30%Arc-Bis母液 420μl
1M Tris-HCl（pH6.7） 320μl
10% SDS 25 μl
10% AP 25 μl
TEMED 3 μl
（3）蛋白样品与2×SDS上样缓冲液1:1混合，100 ℃煮沸5 min。 超声离心后的沉淀，加入2ml 8M/L尿素溶解，加入等体积上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。
（4）配制分离胶8ml，加入TEMED后用1ml移液器混匀（注意不要吹起气泡），迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶，然后在其上加 1-2ml去离子水，预留出灌注浓缩胶所需的空间，大约1.0 cm；分离胶聚合完全后，倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的丙烯酰胺凝胶。
（5） 配制浓缩胶2.5ml，加入TEMED后混合均匀，在分离胶上灌注浓缩胶，插入干净的梳子；聚合完全后，把凝胶固定于电泳装置，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，排除玻璃板之间的气泡，小心拔除梳子。
（6）按预定的次序加入准备好的样品。80V 恒压，指示剂至分离胶时，电压调至120V，待指示剂移至底部时停止电泳。
（7）取出凝胶，加入新鲜考马斯亮蓝染液，用约5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上，于室温染色2 h。
（8）移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动4-8 h，其间应更换脱色液3-4 次。
步骤2.10 酶蛋白的透析
纯化的酶蛋白置于透析袋中，用封口夹夹住透析袋两头，在大烧杯中加入适量蛋白透析液（保证透析袋能够悬浮起来），放入转子，置于磁力搅拌器上4 ℃透析20 h，控制转子旋转速度不要太快，中间更换透析液3次。收集透析后的蛋白，放于-80 ℃超低温冰箱备用。
步骤3 小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK密码子的定点突变
步骤3.1密码子突变引物的设计
由氨基酸序列比对发现，小麦甲羟戊酸激酶TaMVK保守区中第14A、24A、35Q、135V、139G、142M、144A、153S、165L和332N等位置氨基酸与其它植物不同，为探讨这些氨基酸残基对酶催化活性的影响，将其分别突变为14S、24T、35N、35R、135E、139D、142L、142F、142Y、144S、153C、165M和332S。
突变体的上下游引物分别为：
A14S:F（SEQ ID NO.6）:GCAAGATCATCCTCTCCGGCGAGCACGCCGTCG;
A14S:R（SEQ ID NO.7）:CGACGGCGTGCTCGCCGGAGAGGATGATCTTGC；
密码子由GCC突变为TCC。
A24T:F（SEQ ID NO.8）:CGTCCACGGCTCTACCGCCGTCGCCGCCGCC；
A24T:R（SEQ ID NO.9）:GGCGGCGGCGACGGCGGTAGAGCCGTGGACG；
密码子由GCC突变为ACC。
Q35N:F（SEQ ID NO.10）:CGACCTCTACACGAACTCCTCCCTCCACCTG；
Q35N:R（SEQ ID NO.11）:CAGGTGGAGGGAGGAGTTCGTGTAGAGGTCG；
密码子由CAG突变为AAC。
FQ35R:F（SEQ ID NO.12）:CGACCTCTACACGCGGTCCTCCCTCCACCTG；
FQ35R:R（SEQ ID NO.13）:CAGGTGGAGGGAGGACCGCGTGTAGAGGTCG；
密码子由CAG突变为CGG。
V135E:F（SEQ ID NO.14）: GGCCTGGGAAGGTCGAGGTGAGCTCTGGCCTG；
V135E:R（SEQ ID NO.15）:CAGGCCAGAGCTCACCTCGACCTTCCCAGGCC；
密码子由GTG突变为GAG。
G139D:F（SEQ ID NO.16）：GGTGAGCTCTGACCTGCCGATGGGC；
G139D:R（SEQ ID NO.17）：GCCCATCGGCAGGTCAGAGCTCACC；
密码子由GGC突变为GAC。
M142L:F（SEQ ID NO.18）:GCTCTGGCCTGCCGCTGGGCGCCGGGCTTGGC；
M142L:R（SEQ ID NO.19）:GCCAAGCCCGGCGCCCAGCGGCAGGCCAGAGC；
密码子由ATG突变为CTG。
M142F:F（SEQ ID NO.20）:GCTCTGGCCTGCCGTTTGGCGCCGGGCTTGGC；
M142F:R（SEQ ID NO.21）:GCCAAGCCCGGCGCCAAACGGCAGGCCAGAGC；
密码子由ATG突变为TTT。
F142Y:F（SEQ ID NO.22）: GCTCTGGCCTGCCGTATGGCGCCGGGCTTGGC；
F142Y:R（SEQ ID NO.23）:GCCAAGCCCGGCGCCATACGGCAGGCCAGAGC；
密码子由TTT突变为TAT。
A144S:F（SEQ ID NO.24）:CCTGCCGATGGGCTCCGGGCTTGGCTCGTCG；
A144S:R（SEQ ID NO.25）:CGACGAGCCAAGCCCGGAGCCCATCGGCAGG；
密码子由GCC突变为TCC。
S153C:F（SEQ ID NO.26）：CGGCTGCGTTCTGCGCGTCGTTG；
S153C:R（SEQ ID NO.27）：CAACGACGCGCAGAACGCAGCCG；
密码子由TCC突变为TGC。
L156M:F（SEQ ID NO.28）: CGTTCTCCGTGTCGATGTCGGGCGCGCTGC；
L156M:R（SEQ ID NO.29）:GCAGCGCGCCCGACATCGACACGGAGAACG；
密码子由TTG突变为ATG。
N332S:F（SEQ ID NO.30）:CGACATTGAAGTATTCCTTGGTCTCGAAGCTC；
N332S:R（SEQ ID NO.31）:GAGCTTCGAGACCAAGGAATACTTCAATGTCG；
密码子由AAC突变为TCC。
步骤3.2基因突变体的PCR扩增
以构建的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK载体质粒pLM1-TaMVK为DNA模板，利用各个基因突变体引物，分两步分别进行PCR扩增，获得上、下游PCR产物。
PCR反应体系： PCR反应体系：
PLM1-TaMVK 1μL PLM1-TaMVK 1μL
PLM1-F1 1μL PLM1-R 1μL
突变体引物下游 1μL 变体引物上游 1μL
5×FastPfu Buffer 4μL 5×FastPfu Buffer 4μL
2.5 mM dNTP 2μL 2.5 mM dNTP 2μL
FastPfu DNA Polymerase 0.4μL FastPfu DNA Polymerase 0.4μL
ddH2O 10.6μL ddH2O 10.6μL
PCR反应条件：
94℃ 5min
94 ℃ 30S
60℃ 30S
72℃ 1min
72℃ 10min
反应30个循环，16℃保温。
获得上下游产物，切胶回收。然后，再进行PCR扩增，反应体系及反应过程如下。
PCR反应体系：
上游PCR产物 1μL
下游PCR产物 1μL
5×FastPfu Buffer 4μL
2.5 mM dNTP 2μL
FastPfu DNA Polymerase 0.6μL
ddH2O 8.6μL
PCR反应条件：
94℃ 5min
94 ℃ 30S
47℃ 30S
72℃ 1.5min
反应5个循环。
然后加上下游突变引物各1μL，加FastPfu 0.2μL，进行PCR扩增。
PCR反应条件：
94℃ 5min
94 ℃ 30S
58℃ 30S
72℃ 1.5min
72℃ 10min
反应34个循环，于16℃，保温。
步骤3.3获得突变体产物，进行酶切连接。
同步骤2.4。
步骤3.4转化和阳性克隆鉴定
同步骤2.6。
步骤3.5突变体蛋白表达、纯化、电泳检测和透析
同步骤2.7、2.8、2.9、2.10。
步骤4小麦甲羟戊酸激酶TaMVK及其突变体的酶动力学参数测定
小麦甲羟戊酸激酶动力学参数的测定，采用丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶偶联反应的方法进行，具体如下。
在一次性德国Brand塑料比色皿中依次加入下列试剂，使反应终体积1mL。
0.1M 磷酸钾缓冲液（pH 7.6），
0.16mM NADH，
5mM MgCl2，
4mM ATP，
3mM甲羟戊酸，
0.5mM磷酸烯醇式丙酮酸，
10U丙酮酸激酶，
10U乳酸脱氢酶，
加入一定量的甲羟戊酸激酶启动反应，
用H2O补充至体积1mL，
测定340nm波长下NADH被氧化时光吸收变化，获得反应斜率。首先测定背景氧化2min，加入酶后立即测定50sec。如果酶活性较强，则340nm波长下光吸收值下降速度较快，反之，则酶活性较弱。以甲羟戊酸浓度为梯度改变，测定酶活性，获得酶对底物甲羟戊酸的动力学参数；以ATP浓度为梯度改变，测定酶活性，获得酶对底物ATP的动力学参数。
二、实验结果
（一）小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因编码区序列
以小麦品种济麦22的cDNA为模板扩增，获得了长度为1167bp的小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因的编码区序列，可编码388个氨基酸残基。
野生型小麦TaMVK基因编码区DNA序列（SEQ ID NO.32）：
ATGGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGCAAGATCATCCTCGCCGGCGAGCACGCCGTCGTCCACGGCTCTGCCGCCGTCGCCGCCGCCATCGACCTCTACACGCAGTCCTCCCTCCACCTGCCCCCCTCAGGTGAGGGCGGCGCCGGCGAAGTGGAGGTTGACCTGACGGACTCGGGCCTCGCCTTCTCCTGGCCATGCTCGCGCCTCCTCGAGGCGCTGGGGGAGACCTCCCGCAAGGCGGAGCTGCAGGCCCCGAGGCCCTGCTCCCCGGAGGAGCTGGCCGCCATTGCCAGGCTCGTGGAGCTGCACGAGATACCCGAGGCCAAGATCTGGCTCTCCGCCGGCCTCTCCGCGTTCCTCTACCTCTACACCTCCATCCTGGGGTGTAGGCCTGGGAAGGTCGTGGTGAGCTCTGGCCTGCCGATGGGCGCCGGGCTTGGCTCGTCGGCTGCGTTCTCCGTGTCGTTGTCGGGCGCGCTGCTGACAGCGGCAGGTGTGGTTTCTGCTGAGGGCGCCGTTGGCGGAACGGAGTGGCAGTTGTTGGGGAAGGATCATCTTGAGCTGGTTAACACGTGGGCGTTCCAGGGGGAAAAGATTATTCATGGCAAGCCTTCTGGCATTGATAACGCTGTCAGCACTTTTGGAAGCATGATCAAATTCAAGAAGGGAGAATTGACGAACCTCAAATCTGGCAATCCAGTCAAAATGCTCATTACTGATACAAGGGTTGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGTTGCTGGTGTGTCTGAAAGAGCATCTAGGCATCCCGATGCTATGGCTTCCGTCTTCcATGCAGTCAACACTATTAGTGAAGAGCTTTCCAGCATTGTTGAGTTAGCTGCTACTGATGAGATAGCCATGACCTCAAAGGAAGAAAAGCTAGCAGAACTCATGGAGATGAACCAAGGTTTGCTCCAGTGCATGGGAGTCAGTCATGCTTCTATAGAAACCGTGCTGCGCTCGACATTGAAGTATAACTTGGTCTCGAAGCTCACCGGAGCTGGTGGTGGAGGCTGTGTTTTGACGTTGATACCAACTCTATTGTCCAAGTTAGTTTTGGAGAAGGTCACCACGGAGCTAGAATCGCATGGTTTCCGCTGCTTCAAAGTCGAGGTCGGTGGACAAGGTCTTCAGATTCACCAAGGATAA
野生型小麦TaMVK的氨基酸序列（SEQ ID NO.33）：
MEIRARAPGKIILAGEHAVVHGSAAVAAAIDLYTQSSLHLPPSGEGGAGEVEVDLTDSGLAFSWPCSRLLEALGETSRKAELQAPRPCSPEELAAIARLVELHEIPEAKIWLSAGLSAFLYLYTSILGCRPGKVVVSSGLPMGAGLGSSAAFSVSLSGALLTAAGVVSAEGAVGGTEWQLLGKDHLELVNTWAFQGEKIIHGKPSGIDNAVSTFGSMIKFKKGELTNLKSGNPVKMLITDTRVGRNTKALVAGVSERASRHPDAMASVFHAVNTISEELSSIVELAATDEIAMTSKEEKLAELMEMNQGLLQCMGVSHASIETVLRSTLKYNLVSKLTGAGGGGCVLTLIPTLLSKLVLEKVTTELESHGFRCFKVEVGGQGLQIHQG
（二）小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体的创制及蛋白质表达纯化
根据设计的小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体引物，获得了TaMVK/A14S、TaMVK/A24T、TaMVK/Q35N、TaMVK/Q35R、TaMVK/V135E、TaMVK/G139D、TaMVK/M142L、TaMVK/M142F、TaMVK/F142Y、TaMVK/A144S、TaMVK/S153C、TaMVK/L165M和TaMVK/N332S等13个基因突变体。蛋白质表达、纯化结果表明，所获得的基因突变体蛋白是可溶的，而且纯度较高（图1、图2）。
（三）小麦甲羟戊酸激酶野生型及突变体的酶动力学参数
实验获得了小麦品种“济麦22”甲羟戊酸激酶野生型及13个基因突变体酶蛋白对底物甲羟戊酸（MVA）和ATP的酶动力学参数（表1）。结果表明，通过改变小麦甲羟戊酸激酶基因编码氨基酸的密码子，能够显著提高或降低小麦甲羟戊酸激酶的催化活性。对底物MVA而言，突变体TaMVK/A14S、TaMVK/V135E和TaMVK/G139D的最大反应速率较高，分别比野生型提高了1.39、1.14和1.07倍，而TaMVK/F142Y的最大反应速率最低，比野生型降低了0.57倍；TaMVK/A14S的KM值最大，比野生型提高了1.91倍，而TaMVK/Q35R的KM值最小，比野生型降低了1.46倍。对底物ATP而言，突变体TaMVK/A14S的最大反应速率也是最高的，比野生型提高了1.50倍，而TaMVK/F142Y的最大反应速率也是最低的，比野生型降低了0.36倍；TaMVK/F142Y和TaMVK/M142F的KM值较大，分别比野生型提高了2.15和2.12倍，而TaMVK/Q35N的KM值最小，比野生型降低了0.61倍。
表1 小麦TaMVK野生型及其突变体酶动力学参数
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院作物研究所
<120> 小麦甲羟戊酸激酶TaMVK基因突变体及其创制方法
<130> 2017
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaggatcgca tcatcaccac catcacgaga tccgcgcccg cgcgcccggc 50
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgcagaagc ttttatcctt ggtgaatctg aagaccttg 39
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcgcggtac caggaggaat ttaaaatgag aggatcgcat catcacc 47
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaggatcgca tcatcaccac catcacgaga tccgcgcccg cgcgcccggc 50
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgcagaagc ttttatcctt ggtgaatctg aagaccttg 39
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaagatcat cctctccggc gagcacgccg tcg 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgacggcgtg ctcgccggag aggatgatct tgc 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgtccacggc tctaccgccg tcgccgccgc c 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggcggcggcg acggcggtag agccgtggac g 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgacctctac acgaactcct ccctccacct g 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caggtggagg gaggagttcg tgtagaggtc g 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgacctctac acgcggtcct ccctccacct g 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caggtggagg gaggaccgcg tgtagaggtc g 31
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggcctgggaa ggtcgaggtg agctctggcc tg 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caggccagag ctcacctcga ccttcccagg cc 32
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggtgagctct ggcctgccga tgggc 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcccatcggc aggccagagc tcacc 25
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gctctggcct gccgctgggc gccgggcttg gc 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gccaagcccg gcgcccagcg gcaggccaga gc 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gctctggcct gccgtttggc gccgggcttg gc 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gccaagcccg gcgccaaacg gcaggccaga gc 32
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gctctggcct gccgtatggc gccgggcttg gc 32
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gccaagcccg gcgccatacg gcaggccaga gc 32
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cctgccgatg ggctccgggc ttggctcgtc g 31
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgacgagcca agcccggagc ccatcggcag g 31
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cggctgcgtt ctccgcgtcg ttg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
caacgacgcg gagaacgcag ccg 23
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgttctccgt gtcgatgtcg ggcgcgctgc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcagcgcgcc cgacatcgac acggagaacg 30
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgacattgaa gtattccttg gtctcgaagc tc 32
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gagcttcgag accaaggaat acttcaatgt cg 32
<210> 32
<211> 1167
<212> DNA
<213> 小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 32
atggagatcc gcgcccgcgc gcccggcaag atcatcctcg ccggcgagca cgccgtcgtc 60
cacggctctg ccgccgtcgc cgccgccatc gacctctaca cgcagtcctc cctccacctg 120
cccccctcag gtgagggcgg cgccggcgaa gtggaggttg acctgacgga ctcgggcctc 180
gccttctcct ggccatgctc gcgcctcctc gaggcgctgg gggagacctc ccgcaaggcg 240
gagctgcagg ccccgaggcc ctgctccccg gaggagctgg ccgccattgc caggctcgtg 300
gagctgcacg agatacccga ggccaagatc tggctctccg ccggcctctc cgcgttcctc 360
tacctctaca cctccatcct ggggtgtagg cctgggaagg tcgtggtgag ctctggcctg 420
ccgatgggcg ccgggcttgg ctcgtcggct gcgttctccg tgtcgttgtc gggcgcgctg 480
ctgacagcgg caggtgtggt ttctgctgag ggcgccgttg gcggaacgga gtggcagttg 540
ttggggaagg atcatcttga gctggttaac acgtgggcgt tccaggggga aaagattatt 600
catggcaagc cttctggcat tgataacgct gtcagcactt ttggaagcat gatcaaattc 660
aagaagggag aattgacgaa cctcaaatct ggcaatccag tcaaaatgct cattactgat 720
acaagggttg gtaggaacac caaggctctg gttgctggtg tgtctgaaag agcatctagg 780
catcccgatg ctatggcttc cgtcttccat gcagtcaaca ctattagtga agagctttcc 840
agcattgttg agttagctgc tactgatgag atagccatga cctcaaagga agaaaagcta 900
gcagaactca tggagatgaa ccaaggtttg ctccagtgca tgggagtcag tcatgcttct 960
atagaaaccg tgctgcgctc gacattgaag tataacttgg tctcgaagct caccggagct 1020
ggtggtggag gctgtgtttt gacgttgata ccaactctat tgtccaagtt agttttggag 1080
aaggtcacca cggagctaga atcgcatggt ttccgctgct tcaaagtcga ggtcggtgga 1140
caaggtcttc agattcacca aggataa 1167
<210> 33
<211> 388
<212> PRT
<213> 小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 33
Met Glu Ile Arg Ala Arg Ala Pro Gly Lys Ile Ile Leu Ala Gly Glu
1 5 10 15
His Ala Val Val His Gly Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Ile Asp Leu
20 25 30
Tyr Thr Gln Ser Ser Leu His Leu Pro Pro Ser Gly Glu Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Glu Val Glu Val Asp Leu Thr Asp Ser Gly Leu Ala Phe Ser Trp
50 55 60
Pro Cys Ser Arg Leu Leu Glu Ala Leu Gly Glu Thr Ser Arg Lys Ala
65 70 75 80
Glu Leu Gln Ala Pro Arg Pro Cys Ser Pro Glu Glu Leu Ala Ala Ile
85 90 95
Ala Arg Leu Val Glu Leu His Glu Ile Pro Glu Ala Lys Ile Trp Leu
100 105 110
Ser Ala Gly Leu Ser Ala Phe Leu Tyr Leu Tyr Thr Ser Ile Leu Gly
115 120 125
Cys Arg Pro Gly Lys Val Val Val Ser Ser Gly Leu Pro Met Gly Ala
130 135 140
Gly Leu Gly Ser Ser Ala Ala Phe Ser Val Ser Leu Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Leu Thr Ala Ala Gly Val Val Ser Ala Glu Gly Ala Val Gly Gly Thr
165 170 175
Glu Trp Gln Leu Leu Gly Lys Asp His Leu Glu Leu Val Asn Thr Trp
180 185 190
Ala Phe Gln Gly Glu Lys Ile Ile His Gly Lys Pro Ser Gly Ile Asp
195 200 205
Asn Ala Val Ser Thr Phe Gly Ser Met Ile Lys Phe Lys Lys Gly Glu
210 215 220
Leu Thr Asn Leu Lys Ser Gly Asn Pro Val Lys Met Leu Ile Thr Asp
225 230 235 240
Thr Arg Val Gly Arg Asn Thr Lys Ala Leu Val Ala Gly Val Ser Glu
245 250 255
Arg Ala Ser Arg His Pro Asp Ala Met Ala Ser Val Phe His Ala Val
260 265 270
Asn Thr Ile Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Val Glu Leu Ala Ala Thr
275 280 285
Asp Glu Ile Ala Met Thr Ser Lys Glu Glu Lys Leu Ala Glu Leu Met
290 295 300
Glu Met Asn Gln Gly Leu Leu Gln Cys Met Gly Val Ser His Ala Ser
305 310 315 320
Ile Glu Thr Val Leu Arg Ser Thr Leu Lys Tyr Asn Leu Val Ser Lys
325 330 335
Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Val Leu Thr Leu Ile Pro Thr
340 345 350
Leu Leu Ser Lys Leu Val Leu Glu Lys Val Thr Thr Glu Leu Glu Ser
355 360 365
His Gly Phe Arg Cys Phe Lys Val Glu Val Gly Gly Gln Gly Leu Gln
370 375 380
Ile His Gln Gly
385