鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-64.pdf

本发明公开了鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-6×4。该方法包括分别以待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均含有或均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同；如果其中的一株含有500bp-800bp的DNA片段，另一株不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同。

1.鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的方法，包括如下步骤：分别以待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，根据PCR扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型：如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均含有782bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同，如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均不含有782bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同；如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物含有782bp的DNA片段，另一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物不含有782bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同或候选为交配型不同；所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC 89562。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物退火条件为57℃退火30s。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min。 4.权利要求1-3中任一所述的方法在花脸香蘑育种中的应用，其特征在于：所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC89562。 5.鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的PCR引物对，其特征在于：所述引物对的名称为SR-6×4，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC 89562。 6.含有权利要求5所述的PCR引物对的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的试剂，其特征在于：所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC 89562。 7.含有权利要求5所述的PCR引物对的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的试剂盒，其特征在于：所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC 89562。 8.权利要求5所述的PCR引物对、权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型中的应用，其特征在于：所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC89562。 9.权利要求5所述的PCR引物对、权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒在花脸香蘑育种中的应用，其特征在于：所述花脸香蘑在中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心的保藏编号为CFCC 89562。

技术领域

本发明涉及鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-6×4。 

背景技术

营养不亲和系统是一种识别异己的遗传系统，在多数真菌中，该系统能引起遗传上明显不同的个体在交接区产生特征性的体细胞不亲和性（戚元成等，中国栽培糙皮侧耳品种体细胞不亲和性实验与RAPD分析结果的比较.菌物学报，2010,29（3））反应，体细胞不亲和性反应的强度因个体不同而异。在真菌中，营养不亲和又称为体细胞不亲和或异核体不亲和，它的作用在于防止同一种内交配型不同的个体或营养不亲和位点上基因不同的个体间的融合，以保持个体遗传上的稳定性。交配型是根据交配因子的个体间能否完成交配结合而确定的结合类型（中国标准出版社第一编辑室，中国农业标准汇编（食用菌卷）.中国标准出版社，2010）。在真菌的有性生殖和营养生长过程中都存在一个自己或异己识别的机制或系统。有性生殖阶段靠交配型因子识别；而营养生长阶段的识别是靠异核体不亲和系统来进行的。异核体不亲和性是普遍存在于真菌中的一种生物学现象，在子囊菌、担子菌、接合菌等真菌中是一种普遍存在的现象。在异核体形成过程中，非己识别系统通过一系列蛋白因子的相互作用最终导致遗传背景不同的核不能形成稳定的异核体,也就是所谓的异核不亲和性。异核体不亲和性是一个受基因调控的过程并且往往异核体不亲和性的菌丝体会死亡。 

异核菌丝体在原生质体制备过程中出现单核原生质体的现象。这些单核原生质体经过再生培养和遗传筛选成为原生质体单核体，由于原生质体单核体是直接来源于营养菌丝，没有经历过减数分裂的无性后代，它为食用菌的遗传和育种研究提供了一种十分重要的基础材料。原生质体单核体的杂交育种方式是把两个分别来自双核亲本的原生质体单核体两两接入同一PDA平板，对峙培养进行杂交。在杂交过程中，两个原生质体单核体的细胞质进行重组，形成一个异质异核的杂交后代。这一方法的主要特点是，根据亲本性状不易在原生质体单核体中分散和稀释，在育种程序中可以从一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的不育单核体，有效地克服了传统育种过程中由孢子单核体遗传多样性所造成的亲本性状分散和选材困难的障碍，减少了筛选杂交后代的工作量。同时，由于原生质体单核体是在实验室条件下获得的，无季节性限制，因此缩短了育种时间。 

花脸香蘑（Lepista sordida）属于担子菌亚门(Basidiomycomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香蘑属(Lepista)。该菌营养丰富，具有一定的药用功效。在中国主要分布于贵州、黑龙江、辽宁、河北、 河南、甘肃、青海、四川、新疆、山西、内蒙古和福建等地,是一种名贵的食用菌和药用菌，人工栽培花脸香蘑还处于小规模试验阶段，野生产量低且稀少，其价格极其昂贵，是一种很有开发潜力的野生菌种。但实际生产中存在产量低，抗虫能力差，适应温度范围窄，子实体易碎，不易运输、保存等亟待解决的难题。这就要求花脸香蘑的遗传育种相关的基础研究加大力度，为传统的遗传育种奠定坚实的理论基础和技术支持。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-6×4。 

本发明所提供的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的PCR引物对，名称为SR-6×4，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成。 

其中，SEQ ID No.1由20个脱氧核苷酸组成，SEQ ID No.2由21个脱氧核苷酸组成。 

含有PCR引物对SR-6×4的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。 

所述试剂或试剂盒除PCR引物对SR-6×4外，还含有进行PCR和DNA测序的其它常规试剂。 

本发明的实验证明PCR引物对SR-6×4、含有PCR引物对SR-6×4的试剂或试剂盒可用于鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型。 

本发明所提供的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的方法，包括如下步骤：分别以待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的两条单链DNA组成的PCR引物对SR-6×4进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，根据PCR扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型： 

如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均含有500bp-800bp的DNA片段（或所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均为500bp-800bp的DNA片段），所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同，如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均不含有500bp-800bp的DNA片段（或所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均不为大小是500bp-800bp的DNA片段），所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同；如果所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物含有500bp-800bp的DNA片段（或所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸 香蘑原生质体单核体的PCR产物为500bp-800bp的DNA片段），另一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物不含有500bp-800bp的DNA片段（或另一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物不为500bp-800bp的DNA片段），所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同或候选为交配型不同。 

上述方法中，所述500bp-800bp的DNA片段具体为782bp的DNA片段。 

在本发明的一个实施例中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为57℃退火30s。所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min。 

上述方法中，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同是指将所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体在一起培养，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间不产生锁状联合；所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同是指将所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体在一起培养，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间产生锁状联合。 

上述方法中，所述花脸香蘑具体可为花脸香蘑（Lepista sordida）CFCC89562。 

实验证明，本发明的特异性引物对SR-6×4对花脸香蘑原生质体单核体具有特异性，本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的方法与现有的体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的方法的一致性为100%。本方法缩短了花脸香蘑原生质体单核体交配型的鉴别时间并简化了交配型鉴别的步骤，其准确性和可靠性高。通过原生质体单核化获得的单核体称为原生质单核体，与孢子单核体不同，原生质体单核体是在原生质体制备过程中从花脸香蘑异核菌丝体中直接得到的单核单倍体的无性后代,因此花脸香蘑的原生质单核体只有两种形式的交配型AxBx和AyBy两对。在常规的杂交育种中，只有交配型不同的单核菌株是杂交可育的，因此交配型的鉴定是杂交育种的前提和必要条件。本发明对研究花脸香蘑的遗传育种及生产实践具有重要意义。本发明适用于食用菌生产、菌种选育等相关专业领域对花脸香蘑原生质体原生质单核体的鉴别及遗传育种等方面的研究。 

附图说明

图1为用本发明引物对SR-6×4对部分花脸香蘑原生质体单核体的PCR扩增产物电泳图。 

图中1至12号对应菌株依次为：110号，58号，99号，67号，55号，137号，179号，69号，104号，139号，100号，双核菌株;M：DNA Marker。 

图2为用引物SRAP-me6和SRAP-em4对花脸香蘑原生质体单核体进行PCR的电泳图。 

图中，1至12对应的菌株依次为：110号，58号，99号，67号，55号，137号，179号，69号，104号，139号，100号，双核菌株的基因组DNA；M：DNA Marker。 

图3为交配型不同的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间产生的锁状联合照片。 

图中箭头示锁状联合。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

下述实施例中的花脸香蘑均为花脸香蘑（Lepista sordida）CFCC89562，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,China Forestry Culture Collection Center英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。在下文中，均简称花脸香蘑。 

1、下述实施例中的花脸香蘑原生质体单核体均通过原生质体单核化获得，具体方法如下： 

1.1培养基 

MM缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH5.5)；所述溶质及其在MM缓冲液中的浓度如下：0.5M甘露醇。 

液体MCM培养基：将酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.5g和磷酸氢二钾1g溶于水并用水定容至1L。 

固体MCM平板：在液体MCM培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。 

固体再生平板（RM）的制备方法：在液体MCM培养基中添加山梨醇和琼脂，使其浓度分别为1M和20g/L。 

1.2原生质体制备 

1)取花脸香蘑菌丝于液体MCM培养基中，160rpm、25℃培养4天（3-5天均可），用3层无菌擦镜纸过滤并收集菌丝，然后用0.6M甘露醇水溶液洗涤2-3次。 

2)将步骤1)的花脸香蘑菌丝（约1g）悬浮于1.5%溶壁酶溶液（将1.5g溶壁酶用0.6M甘露醇水溶液溶解并定容至100mL；溶壁酶购自广东碧德生物科技有限公司，产品目录号：Bd_8110001023），在水浴摇床（32℃、60rpm）中温浴2小时，用3层无菌擦镜纸过滤并收集滤液。 

3)将步骤2)的滤液3000rpm离心10min并收集沉淀。 

4)将步骤3)的沉淀用MM缓冲液洗涤三次后，悬浮于100μl MM缓冲液中，即为原生质体溶液。 

1.3原生质单核体的获得 

将获得的原生质体用MM缓冲液稀释至浓度为103-104个/mL，均匀涂布于RM上，28℃静置培养10-14天；待生长出来单菌落后用无菌接种针转接至固体MCM培养基上，28℃培养5-7天。 

将获得的原生质单核体依次编号，并在放大1000倍的显微镜（Olympus BX51）下观察，如果没有发现锁状联合，则该菌株为花脸香蘑原生质体单核体。共得到30株花脸香蘑原生质体单核体，它们的编号分别为36、42、50、53、55、58、61、65、66、67、69、71、72、75、81、82、86、87、88、99、100、104、110、111、113、117、119、137、139、179。 

2、鉴别花脸香蘑原生质体单核体的交配型是否相同 

待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同是指将待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体在一起培养，该待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间不产生锁状联合；待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同是指将待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体在一起培养，该待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间产生锁状联合。1.3中的30株花脸香蘑原生质体单核体间的交配型按照下述体细胞不亲和性实验方法鉴别： 

PDA培养基：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，取滤液再加20g葡萄糖和20g琼脂，121℃灭菌20分钟。 

将两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体一起接种到PDA培养基上，两者之间间开2cm，25℃培养10天进行观察。如果肉眼观察两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体的菌丝长在一起，通过显微镜观察进一步确认交接处的菌丝没有锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同。如果肉眼观察两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体的菌丝交汇的地方有拮抗线，则挑取拮抗线上的菌丝，接种至PDA培养基上25℃培养5天后，再通过显微镜观察是否有锁状联合，若无锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体的交配型相同；若有锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸香蘑原生质体单核体的交配型不同。图3显示了交配型不同的两株花脸香蘑原生质体单核体的菌丝之间产生的锁状联合。 

按照该方法鉴别1.3得到的30株花脸香蘑原生质体单核体的交配型，结果如表1和2所示。表1和表2中，“√”表示两个菌株之间体细胞不亲和性实验结果表明两个菌株的交配型不同；“×”表示两个菌株之间体细胞不亲和性实验结果表明两个菌株的交配型相同。 

表1.体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的结果 

  36 42 50 53 55 58 61 65 66 67 69 71 72 75 81 36                               42 ×                             50 √ √                           53 √ √ ×                         55 × × √ √                       58 × × √ √ ×                     61 √ √ × × √ √                   65 √ √ × × √ √ ×                 66 √ √ × × √ √ × ×               67 × × √ √ × × √ √ √             69 √ √ × × √ √ × × × √           71 √ √ × × √ √ × × × √ ×         72 √ √ × × √ √ × × × √ × ×       75 √ √ × × √ √ × × × √ × × ×     81 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √   82 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 86 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 87 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 88 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 99 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 100 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 104 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 110 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 111 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 113 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 117 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 119 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 137 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 139 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 179 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √

表2.体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的结果 

  82 86 87 88 99 100 104 110 111 113 117 119 137 139 179 36                               42                               50                               53                               55                               58                               61                               65                               66                               67                               69                               71                               72                               75                               81                               82                               86 ×                             87 × ×                           88 √ √ √                         99 × × × √                       100 √ √ √ × √                     104 √ √ √ × √ ×                   110 × × × √ × √ √                 111 √ √ √ × √ × × √               113 × × × √ × √ √ × √             117 × × × √ × √ √ × √ ×           119 × × × √ × √ √ × √ × ×         137 × × × √ × √ √ × √ × × ×       139 √ √ √ × √ × × √ × √ √ √ √     179 √ √ √ × √ × × √ × √ √ √ √ ×  

实施例1、利用PCR引物对SR-6×4鉴别花脸香蘑原生质体单核体的交配型 

1、鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的PCR试剂 

本实施例的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的试剂由PCR引物对SR-6×4、10×Taq缓冲液，dNTP mix，Taq DNA聚合酶和ddH2O组成。 

其中，PCR引物对SR-6×4由SR-6×4-F和SR-6×4-R这两条单链DNA组成，其序列如下： 

SR-6×4-F:5’-AACCGGTAGGCAGTTACTTT-3’（SEQ ID No.1）， 

SR-6×4-R:5’-AGAGCAAGCCTTTCATACAGT-3’（SEQ ID No.2）。 

10×Taq缓冲液，dNTP mix和Taq DNA聚合酶均购自北京盛旭百川公司（CNS）。 

2、鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型 

将上述1.3得到的30株花脸香蘑原生质体单核体分别接种到PDA培养基上，25℃培养7-10天，刮取PDA培养基上的菌丝约0.1g，用QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。 

用吸光光度计测定所得DNA溶液的浓度，稀释原液，使其OD值为1，浓度为50ng/μL。 

每株花脸香蘑原生质体单核体均采用如下PCR体系和如下PCR条件，分别以花脸香蘑原生质体单核体基因组DNA为模板，利用步骤1的鉴别或辅助鉴别花脸香蘑原生质体单核体交配型的试剂进行PCR扩增。PCR反应体系如表3所示： 

表3、20μL的PCR反应体系 

PCR反应温度程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min，12℃保存。 

将每株花脸香蘑原生质体单核体的PCR扩增产物在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像，结果表明50、53、61、65、66、69、71、72、75、88、100、104、111、 139、179号花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均为一个500bp-800bp的DNA条带（DNA片段）；36、42、55、58、67、81、82、86、87、99、110、113、117、119、137号花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物中没有DNA条带。图1显示了部分花脸香蘑原生质体单核体的PCR扩增产物。 

分别回收每株花脸香蘑原生质体单核体的500bp-800bp的DNA条带（DNA片段），进行测序，结果表明所有的15株花脸香蘑原生质体单核体的500bp-800bp的DNA条带（DNA片段）的大小均为782bp。 

根据PCR扩增产物的大小按照下述方法确定上述1.3得到的30株花脸香蘑原生质体单核体的每两株菌株之间的交配型是否相同：如果待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体为交配型相同的菌株，如果待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体为交配型相同的菌株；如果待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鉴别的花脸香蘑原生质体单核体的PCR产物不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体为交配型不同的菌株。 

本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别每两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型是否相同的结果如表4和5所示。表明本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别每两株花脸香蘑原生质体单核体的交配型是否相同的方法与现有的体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的方法（表1和表2）的一致性为100%。表4和表5中，“√”表示本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体间的交配型不同，“×”表示本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别的两株花脸香蘑原生质体单核体间的交配型相同。 

表4、本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的结果。 

  36 42 50 53 55 58 61 65 66 67 69 71 72 75 81 36                               42 ×                             50 √ √                           53 √ √ ×                         55 × × √ √                       58 × × √ √ ×                     61 √ √ × × √ √                   65 √ √ × × √ √ ×                 66 √ √ × × √ √ × ×               67 × × √ √ × × √ √ √             69 √ √ × × √ √ × × × √           71 √ √ × × √ √ × × × √ ×         72 √ √ × × √ √ × × × √ × ×       75 √ √ × × √ √ × × × √ × × ×     81 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √   82 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 86 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 87 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 88 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 99 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 100 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 104 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 110 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 111 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 113 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 117 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 119 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 137 × × √ √ × × √ √ √ × √ √ √ √ × 139 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √ 179 √ √ × × √ √ × × × √ × × × × √

表5、本发明利用PCR引物对SR-6×4鉴别花脸香蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的结果。 

  82 86 87 88 99 100 104 110 111 113 117 119 137 139 179 36                               42                               50                               53                               55                               58                               61                               65                               66                               67                               69                               71                               72                               75                               81                               82                               86 ×                             87 × ×                           88 √ √ √                         99 × × × √                       100 √ √ √ × √                     104 √ √ √ × √ ×                   110 × × × √ × √ √                 111 √ √ √ × √ × × √               113 × × × √ × √ √ × √             117 × × × √ × √ √ × √ ×           119 × × × √ × √ √ × √ × ×         137 × × × √ × √ √ × √ × × ×       139 √ √ √ × √ × × √ × √ √ √ √     179 √ √ √ × √ × × √ × √ √ √ √ ×  

其中，PCR引物对SR-6×4按照下述方法筛选得到的： 

1.分子标记实验 

将上述1.3得到的30株花脸香蘑原生质体单核体，及花脸香蘑的双核菌株，共31株菌株，接种到PDA培养基上，25℃培养。一段时间后，刮取PDA培养基上的菌丝约0.1g，用QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。 

用吸光光度计测定所得DNA溶液的浓度，稀释原液，使其OD值为1，浓度约为50ng/μL。PCR反应体系如表4所示： 

表4：20μL的PCR反应体系 

其中，上游引物为SRAP-me6：5’-tgagtccaaaccggtag-3’， 

下游引物为SRAP-em4：5’-gactgcgtacgaatttga-3’。 

PCR反应温度程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，12℃保存。 

将上述扩增产物，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像，分析交配型特异性条带。经分析发现：用引物SRAP-me6和SRAP-em4扩增获得的片段中，一部分原生质单核体有一个长度在800bp左右的片段，另一部分原生质单核体无该条带（图2）。 

2.特异性条带的回收及克隆测序 

2.1获得目的条带：切胶回收179号原生质单核体的特异性条带——800bp左右。切胶回收所用试剂盒为中科瑞泰所提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。按试剂盒中的说明书操作，回收特异性片段的DNA，用于连接反应，构建重组载体。 

2.2连接：连接体系为4μL DNA回收液，4μL的ddH2O，0.5μL pMD19-T Vector（TaKaRa），1μL T4DNA连接酶缓冲液(New England BioLabs)，0.5μL T4DNA连接酶(BioLabs)。在冰上配置该体系后，将其置于16℃的水浴中，过夜。 

2.3转化：将-70℃保存的大肠杆菌TOP10感受态细胞（Tiangen）置于4℃解冻。 取5μL连接液与50μL的感受态细胞混合均匀，冰上放置30min，然后42℃水浴90s后冰浴2min，加入1mL的液体LB培养基（氯化钠，10g/L；蛋白胨，10g/L；酵母粉，5g/L），37℃，90rpm条件下复壮1小时。 

2.4蓝白斑筛选：将复壮好的培养液均匀涂布在添加终浓度为0.1mg/mL的氨苄青霉素钠、0.024mg/mL的IPTG和0.04mg/mL的固体LB培养基（液体LB培养基上添加20g/L的琼脂粉）上，涂布均匀后，37℃的恒温培养12-16小时。待平板中长出蓝白斑之后，用10μL的移液器吸取白斑，接种至含有终浓度为0.1mg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，在37℃，180rpm培养12-16小时。 

2.5PCR验证转化效果并送样测序：用引物对RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)与M13-47(5’-CGCCAG GGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)，以培养好的菌液做PCR，PCR体系按表2配制。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性50s，57.8℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min，PCR反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外成像。将具有目的条带的阳性克隆的菌液委托中美泰和生物技术（北京）有限公司进行序列测定。 

该800bp左右特异性条带的序列测定结果如SEQ ID No.3，其大小为832bp。根据SEQ ID No.3设计出由SR-6×4-F和SR-6×4-R这两条单链DNA组成的PCR引物对SR-6×4，其序列如下： 

SR-6×4-F:5’-AACCGGTAGGCAGTTACTTT-3’（SEQ ID No.1） 

SR-6×4-R:5’-AGAGCAAGCCTTTCATACAGT-3’（SEQ ID No.2）。