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1、(10)授权公告号 CN 102660524 B (45)授权公告日 2013.02.20 CN 102660524 B *CN102660524B* (21)申请号 201210141391.X (22)申请日 2012.05.09 C12N 9/64(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 海南华研生物科技有限公司 地址 570102 海南省海口市龙华区义龙西路 21 号侨汇大厦 15 楼 (72)发明人 陈海宁 程云开 (54) 发明名称。
2、 高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、 毕赤 酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 (57) 摘要 本发明涉及皮蝇胶原酶 （HlCollagenase） 突 变 体 的 序 列 及 其 分 泌 表 达 的 酵 母 菌 株 HlCollagenase-m/pGAPZ-A/GS115 构建的关键 技术、 构建结果及利用它来生产高活性皮蝇胶原 酶的纯化方法。本发明采用基因工程表达的方 法生产高活性的皮蝇胶原酶突变体， 比活性达到 1320 国际单位 / 毫克 , 表达量达到 241 毫克 / 升 蛋白， 通过纯化可获得纯度达 95% 以上的目标蛋 白皮蝇胶原酶， 为皮蝇胶原酶今后的推广使用奠 定良好。
3、基础。 (51)Int.Cl. 审查员 杨光 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种皮蝇胶原酶 （Hl Collagenase） 突变体， 其氨基酸序列为如下序列 ValIleCysGlyGlySerLeuIleAspAsnLysTrpIleLeuThrAlaAlaHisCysValHisAspAlaVal SerValValValTyrLeuGlySerAlaValGlnTyrGluGlyGluAlaValValAsn。
4、SerGluArgIleIleSerHi sSerMetPheAsnProAspThrTyrLeuAsnAspValAlaLeuIleLysIleProHisValGluTyrThrAspAsnI leGlnProIleArgLeuProSerGlyGluGluLeuAsnAsnLysPheGluAsnIleTrpAlaThrValSerGlyTrp GlyGlnSerAsnThrAspThrValIleLeuGlnTyrThrTyrAsnLeuValIleAspAsnAspArgCysAlaGlnGl uTyrProProGlyIleIleValGluSerThrIleCysGlyAspTh。
5、rSerAspGlyLysSerProCysPheGlyAspS erGlyGlyProPheValLeuSerAspLysAsnLeuLeuIleGlyValValSerPheValSerGlyAlaGlyCysGlu SerGlyLysProValGlyPheSerArgValThrSerTyrMetAspTrpIleGlnGlnAsnThrGlyIleLysPhe。 2. 一种皮蝇胶原酶突变体表达载体， 其特征在于表达质粒中转入了权利要求 1 所述的 皮蝇胶原酶突变体的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的皮蝇胶原酶突变体表达载体， 其特征在于所述的表达质粒为 pGAPZ-A。 4.。
6、 一种皮蝇胶原酶突变体重组表达载体， 其特征在于是将权利要求 1 所述的皮蝇胶原 酶 Hl Collagenase 突变体的编码基因插入 pGAPZ-A 空载体的 GAP 启动子 /-factor 信 号肽下游位点， 并删除载体上的Kex2位点 Lys-Arg 之后的Ste13位点 Glu-Ala-Glu-Ala, 构建成的皮蝇胶原酶基因分泌型表达载体 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A。 5. 一种转化子， 其特征在于宿主菌被权利要求 2 或 3 所述的皮蝇胶原酶突变体表达载 体所转化。 6. 根据权利要求 5 所述的转化子， 其特征在于所述的宿主菌为毕赤酵母 （Pichia。
7、 pastoris） 菌株 GS115。 7.一种生产皮蝇胶原酶突变体的方法， 其特征在于培养权利要求5或6所述的转化子， 收集其分泌产物。 8. 一种皮蝇胶原酶突变体毕赤酵母表达产物的纯化方法， 其特征在于直接从含权 利要求 4 所述的分泌型表达载体 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A 的毕赤酵母 （Pichia pastoris） 菌株 GS115 的发酵液中分离纯化皮蝇胶原酶突变体 ： 离心收集上清液， 以氢氧化 钠调节pH值， 过阴离子交换层析柱， 收集目标洗脱峰， 得到纯度约70%的皮蝇胶原酶突变体 粗品， 透析除盐， 超滤浓缩， 过分子筛层析柱， 收集目标蛋白， 得。
8、到纯度大于 95% 的皮蝇胶原 酶突变体蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102660524 B 2 1/3 页 3 高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、 毕赤酵母表达质粒 的构建及菌株筛选和纯化方法 0001 技术领域 0002 本发明涉及具有高比活皮蝇胶原酶 （Hl Collagenase） 序列的确认、 该序列 毕赤酵母表达载体的构建、 分泌表达皮蝇胶原酶的毕赤酵母菌株 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A/GS115 构建的关键技术、 构建结果及利用它来生产高活性皮蝇胶原酶的纯化方 法。本发明属于生物技术领域。 0003 背景技术 0004 胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶 。
9、(Collagenase)， 它能在生理 PH 和温度条件下 特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构， 而不损伤其它蛋白质和组织。来自梭菌的胶 原酶， 切割胶原蛋白中甘氨酸残基的氨基端肽键。而来自皮蝇 (Hypoderma lineatum) 幼虫 的胶原酶， 切割天然胶原蛋白丙氨酸残基的氨基端肽键。目前医疗上广泛使用的胶原酶是 从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的， 主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。而来自皮蝇 幼虫的胶原酶， 由于幼虫体内含量低， 提取工艺复杂， 生产成本高， 至今无法大量生产， 阻碍 了皮蝇胶原酶的推广使用。 0005 发明内容 0006 皮蝇胶原酶是皮蝇一期幼虫可溶性抗原的。
10、主要成分， 是一种丝氨酸蛋白酶， 分子 量为 25223 道尔顿， 成熟的皮蝇胶原酶含有 230 个氨基酸， 比其前体少了 30 个氨基酸， 整 个氨基酸序列和胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有高度的相似性。其活性 功能片段为 45180 位氨基酸 , 底物结合区是 174201 位氨基酸 ； 全序列共有 6 个半胱氨 酸 （30,46 ； 151,166 ； 176,204 位氨基酸） ， 形成 3 对二硫键。根据对皮蝇胶原酶分子结构及 序列的分析， 我们设计切除 127 位的氨基酸序列， 使功能区域更大范围地暴露， 使之能够 更好的和反应底物结合， 从而提高酶的活性。并将第 29 。
11、位的色氨酸 （Trp） 突变为异亮氨酸 (Ile), 以保持分子结构的稳定性 ； 0007 具有高活性的皮蝇胶原酶突变体序列如下 ： 0008 ValIleCysGlyGlySerLeuIleAspAsnLysTrpIleLeuThrAlaAlaHisCysValHisAspAl aValSerValValValTyrLeuGlySerAlaValGlnTyrGluGlyGluAlaValValAsnSerGluArgIleIle SerHisSerMetPheAsnProAspThrTyrLeuAsnAspValAlaLeuIleLysIleProHisValGluTyrThr AspAsn。
12、IleGlnProIleArgLeuProSerGlyGluGluLeuAsnAsnLysPheGluAsnIleTrpAlaThrVal SerGlyTrpGlyGlnSerAsnThrAspThrValIleLeuGlnTyrThrTyrAsnLeuValIleAspAsnAspArg CysAlaGlnGluTyrProProGlyIleIleValGluSerThrIleCysGlyAspThrSerAspGlyLysSerPro CysPheGlyAspSerGlyGlyProPheValLeuSerAspLysAsnLeuLeuIleGlyValValSerPheValSer Gl。
13、yAlaGlyCysGluSerGlyLysProValGlyPheSerArgValThrSerTyrMetAspTrpIleGlnGlnAsn ThrGlyIleLysPhe 0009 该序列的特点是只保留了成熟皮蝇胶原酶序列中的功能区域和底物结合区 （28230 位氨基酸） 并将 29 位的色氨酸点突变为亮氨酸， 这种改变在理论上使功能区域更 大范围地暴露， 使之能够更好的和反应底物结合， 从而提高酶的活性 ； 说 明 书 CN 102660524 B 3 2/3 页 4 0010 同时， 本发明采用毕赤酵母分泌表达系统， 该系统产量高、 生产成本低兼有真核表 达系统翻译后修饰功能等优点。
14、， 可以用于大量生产皮蝇胶原酶， 降低生产成本 ； 0011 皮蝇胶原酶毕赤酵母重组菌株的构建方法为 ： 将修饰突变的皮蝇胶原酶 Hl Collagenase 基因插入 pGAPZ-A 空载体的 GAP 启动子 /-factor 信号肽下游位点， 并删 除载体上的Kex2位点 Lys-Arg 之后的Ste13位点 Glu-Ala-Glu-Ala, 构建成皮蝇胶原酶基 因分泌型表达载体 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A ； 利用电转化的方法将 Collagenase-m/ pGAPZ-A 载体转化毕赤酵母 （Pichia pastoris） 的菌株 GS115， 构建成分泌型表。
15、达皮蝇胶 原酶突变体的毕赤酵母工程菌株 - Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A/GS115 ； 通过抗生素 筛选、 SDS-PAGE 电泳分析及生物比活性测定， 获得高表达高活性的皮蝇胶原酶突变体毕赤 酵母重组菌株 ； 0012 上述的毕赤酵母重组菌株目标蛋白 ： 皮蝇胶原酶突变体 （Hl Collagenase-m） 的表 达量达到 241 毫克 / 升， 比活性为 1320 国际单位 / 毫克 ； 目标蛋白皮蝇胶原酶突变体比天 然的皮蝇胶原酶比活性高 56 倍， 且具有很高的稳定性 ； 0013 皮蝇胶原酶突变体的纯化方法为 ： 利用获得高表达高活性的皮蝇胶原酶突变体毕 赤。
16、酵母重组菌株进行发酵， 离心收集上清液， 以氢氧化钠调节 PH 值， 过阴离子交换层析柱， 收集目标洗脱峰， 得到纯度约 70% 的皮蝇胶原酶突变体粗品， 透析除盐， 超滤浓缩， 过分子 筛层析柱， 收集目标蛋白， 得到纯度大于 95% 的皮蝇胶原酶突变体蛋白。 0014 【附图说明】 0015 附图为皮蝇胶原酶突变体 （Hl Collagenase-m） 表达载体构建图 0016 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A 表达载体分子大小为 3.759kb。其中 pGAPZ-A 为 3.147kb， Hl Collagenase-m 为 612bp( 包含终止子密码 ) ； Hl 。
17、Collagenase-m 插入于载 体 pGAPZ-A 第 747 与 824bp（XbaI 位点） 之间 ； 0017 pGAPZ-A 载体结构为 ： 0018 磷酸甘油酸脱氢酶基因 （GAP） 启动子区域 ： 第 1-483bp 0019 磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点 ： 第 455-476bp 0020 - 交配因子分泌信号肽序列 ： 第 493-759bp 0021 - 交配因子分泌信号肽引物位点 ： 第 696-716bp 0022 载体多克隆位点 ： 第 760-828bp 0023 Myc抗原决定簇包 ： 第 827-856bp 0024 3 - 乙醇氧化酶 1 基因引物。
18、位点 ： 第 974-994bp 0025 乙醇氧化酶 1 转录终止区域 ： 第 593-1233bp 0026 转录延伸因子 1 启动子区域 ： 第 1234-1644bp 0027 合成原核启动子 ： 第 1645-1712bp 0028 链霉菌 zeocin 抗性基因阅读框 ： 第 1713-2087bp 0029 细胞色素合成酶 1 转录终止区域 ： 第 2088-2405bp 0030 大肠杆菌复制子 1（来源于 pUC 载体） ： 第 2416-3089bp。 0031 【具体实施方式】 0032 下面结合实施例详细介绍本发明在皮蝇胶原酶突变体重组毕赤酵母工程菌株的 构建和皮蝇胶原。
19、酶突变体纯化工艺中的具体应用 ； 说 明 书 CN 102660524 B 4 3/3 页 5 0033 实施例 1 0034 皮蝇胶原酶突变体 （Hl Collagenase-m） 毕赤酵母工程菌的构建 0035 1、 根据皮蝇胶原酶突变体的氨基酸序列和酵母对密码子的偏好， 设计皮蝇胶原酶 突变体全核苷酸序列， 并在序列两端引入相应的酶切位点 XhoI 和 XbaI， 由大连宝生物公司 合成该序列 ； 0036 2、 采用基因克隆技术将皮蝇胶原酶突变体基因经 XhoI/XbaI 双酶切后插入 pGAPZ-A 之 GAP 启动子 /-factor 信号肽下游的 XhoI/XbaI 位点， 构建。
20、成含 -factor 信号肽的分泌型毕赤酵母表达载体 ； Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A 表达载体分子大小为 3.759kb, 其中 pGAPZ-A 为 3.147kb， Hl Collagenase-m 为 612bp( 包含终止子 )， 皮蝇胶 原酶突变体插入于载体 pGAPZ-A 第 747bp 与 824bp(XbaI 位点 ) 之间， 具体情况见附图 ； 0037 3、 通过电转化方法， 将线性化的 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A 质粒转入毕赤酵 母 GS115 感受态 （购于 Invitrogen 公司） 中， 通过 zeocin 抗生素筛选。
21、获得阳性菌株， 进一 步用 PCR 和 Southern blotting 技术鉴定筛选出的阳性菌株， 再用 SDS-PAGE 电泳方法和 SDS-PAGE活性测定方法筛选高表达高活性的Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A/GS115工程菌 株 ； 0038 实施例 2 0039 皮蝇胶原酶突变体的纯化方法 0040 1、 从 -80种子库中取出 Hl Collagenase-m/ pGAPZ-A/GS115 工程菌， 接种平 板， 使菌株活化 ； 0041 2、 从平板中挑单菌落于 200 毫升 YPD+zeocin100 毫克 / 升培养基中， 30 ,250 转 / 分钟，。
22、 培养 48 小时， 此为一级种子液 ； 0042 3、 吸取 100 毫升的一级种子液接种于 2 升的 YPD 培养基中， 30 ,250 转 / 分钟， 培养 24 小时， 此为二级种子液 ； 0043 4、 将 2 升的二级种子液接种于含 40 升 YPD 培养基的发酵罐中， 发酵 72 小时， 离心 收集发酵上清液， 以 1 摩尔氢氧化钠溶液调节 PH8.0-9.0， 过 DEAE SepharoseFF 层析柱， 收 集 0.3 摩尔 / 升氯化钠溶液洗脱峰， 透析过夜除盐， 此时可得到纯度大约为 70% 左右的皮蝇 胶原酶突变体蛋白粗品， 超滤浓缩， 过G25层析柱， 收集目标蛋白。
23、峰， 得到纯度大于95%的皮 蝇胶原酶突变体蛋白原液， 将原液冻干保存。 说 明 书 CN 102660524 B 5 1/1 页 6 海南华研生物科技有限公司 高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、 毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和 纯化方法 1 PatentIn Version 2.1 1 203 氨基酸 Hypoderma lineatum (early cattle grub) misc_difference 1 Val Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asp Asn Lys Trp Ile Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ala His Cys Va。
24、l His Asp Ala Val Ser Val Val Val Tyr Leu Gly Ser 20 25 30 Ala Val Gln Tyr Glu Gly Glu Ala Val Val Asn Ser Glu Arg Ile Ile 35 40 45 Ser His Ser Met Phe Asn Pro Asp Thr Tyr Leu Asn Asp Val Ala Leu 50 55 60 Ile Lys Ile Pro His Val Glu Tyr Thr Asp Asn Ile Gln Pro Ile Arg 65 70 75 80 Leu Pro Ser Gly Glu。
25、 Glu Leu Asn Asn Lys Phe Glu Asn Ile Trp Ala 85 90 95 Thr Val Ser Gly Trp Gly Gln Ser Asn Thr Asp Thr Val Ile Leu Gln 100 105 110 Tyr Thr Tyr Asn Leu Val Ile Asp Asn Asp Arg Cys Ala Gln Glu Tyr 115 120 125 Pro Pro Gly Ile Ile Val Glu Ser Thr Ile Cys Gly Asp Thr Ser Asp 130 135 140 Gly Lys Ser Pro Cy。
26、s Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Leu Ser 145 150 155 160 Asp Lys Asn Leu Leu Ile Gly Val Val Ser Phe Val Ser Gly Ala Gly 165 170 175 Cys Glu Ser Gly Lys Pro Val Gly Phe Ser Arg Val Thr Ser Tyr Met 180 185 190 Asp Trp Ile Gln Gln Asn Thr Gly Ile Lys Phe 195 200 203 序 列 表 CN 102660524 B 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102660524 B 7 。