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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810668692.5 (22)申请日 2018.06.26 (66)本国优先权数据 201710497024.6 2017.06.27 CN (71)申请人 山东金城生物药业有限公司 地址 255130 山东省淄博市淄川区经济开 发区胶王路复线北,东一路西 (72)发明人 杨修亮李江涛孙国祥荣金雷 徐克张成国 (74)专利代理机构 北京康思博达知识产权代理 事务所(普通合伙) 11426 代理人 范国锋李国红 (51)Int.Cl. C07D 471/04(2006.01。
2、) (54)发明名称 吡咯喹啉醌二钠盐晶体及其制备方法 (57)摘要 本发明的目的在于提供一种简单适合大规 模生产的吡咯喹啉醌二钠盐晶体及其制备方法， 所述吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法包括将 含有吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐的水溶液 的pH调节至7.5-8.5， 然后加入酸调节pH至3.0- 4.0， 通过脱盐、 结晶、 干燥得到吡咯喹啉醌二钠 盐晶体。 本发明提供的制备方法简单， 容易控制， 得到的吡咯喹啉醌二钠盐晶体几乎无引湿性。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 109134459 A 2019.01.04 CN 109134459 A 1.一种吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征。
3、在于， 其特征在于， 使用Cu Ka放射线进行X-射 线粉末衍射， 在衍射角2 为6.35， 8.31， 8.80， 18.80， 26.43， 27.35度处具有特征峰， 误差为 0.2 。 2.如权利要求1所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征在于， 使用Cu Ka放射线进行X- 射线粉末衍射， 在衍射角2 为6.35， 7.87， 8.31， 8.80， 13.48， 14.14， 18.43， 18.80， 25.76， 26.08， 26.43， 27.35， 28.34， 28.99， 29.56度处具有特征峰， 误差为0.2 。 3.如权利要求1所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征。
4、在于， 所述晶体的X-射线粉末衍 射如图1所示。 4.如权利要求1-3所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征在于， 所述晶体的热失重分析 的分解温度为325， 在110左右失重10.6， 是三分子水的特征失重。 5.一种权利要求1所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)溶解： 在纯化水中加入吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐， 温度控制在0-40， 搅拌 下加入碱调节pH至7.5-8.5， 搅拌至全部溶解； (2)酸化： 加入酸调节pH3.0-4.0， ； (3)脱盐： 料液经过纳滤脱盐， 纯化水洗涤至透出液电导率50 S/cm； (4)浓缩结晶： 将脱盐后的料液。
5、， 真空浓缩结晶， (5)干燥： 将结晶产物抽滤， 用水洗涤， 滤饼真空干燥， 得终产物。 6.如权利要求5所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 步骤(1)中， 所述吡咯喹啉 醌碱金属盐为PQQ一钠盐或三钠盐， 所述吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐浓度在0.2-20g/ L， 所述碱为氢氧化钠。 7.如权利要求5所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 调 节pH所用酸为盐酸、 硫酸、 磷酸、 乙酸、 甲酸、 乳酸和柠檬酸的一种， 或两种或更多中的组合， 更优选为盐酸或硫酸。 8.如权利要求5所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 脱 盐。
6、所用纳滤膜截留分子量300D， 更优选150-300D。 9.如权利要求5所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 真 空浓缩过程中料液内部温度在25-35， 真空浓缩时长为5-24h。 10.如权利要求5所述的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 真空干燥温度为30-80， 真空干燥时间为5-15h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109134459 A 2 吡咯喹啉醌二钠盐晶体及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种吡咯喹啉醌二钠盐晶体及其制备方法。 背景技术 0002 目前研究表明吡咯喹啉醌(pyrroloquinolin。
7、equinone， 下文简称为PQQ)是继烟酰 胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶， 是从微生物中发现的小分子化合物， 广泛分布于人体的各组织器官中， 被称为第十四种维生素。 PQQ具有多种生理功能， 在食品、 医药及化妆品等行业有广泛的应用前景。 PQQ的分子量为330.2， 其化学名为： 4， 5-Dihydro- 4， 5-dioxo-1H-pyrrolo2， 3-fquinoline-2， 7， 9-tricarboxylic Acid， 其结构式如下： 0003 0004 P Q Q 广 泛 存 在 于 原 核 细 胞 与 真 核 组 织 中 ， 例 如 肺 炎 克 雷 。
8、伯 氏 菌 (Klebsiellapneumoniae)， 扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)， 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa) ， 变色多孔菌(Polyporusversicolor) 和漆树 (Rhusvernicifera)等。 此外， 一些肠道微生物， 如大肠杆菌， 不能合成PQQ， 却能生产以PQQ 为辅因子的酶蛋白。 在生物体内， PQQ是参与氧化还原反应的辅因子， 作为许多酶的辅酶， 如 脱氢酶， 氧化酶， 水合酶与脱羧酶。 PQQ含有能直接参与氧化还原反应的邻醌类结构， 以上酶 蛋白可以催化非磷酸化的底物发生氧化反应。
9、， 如醇类， 醛类和醛糖类。 PQQ可以通过化学合 成和发酵法制得， 已有商品化PQQ产品上市销售。 0005 关于PQQ二钠盐晶体已有报道， CN102471336A公开了PQQ二钠盐的结晶， 并测定了 其热稳定性， 但是已有的研究表明其容易吸湿。 CN102942567A公开了PQQ二钠盐的结晶A和 B， 并测定了其吸湿性。 CN103619842A7A公开了PQQ二钠盐的晶形1和2， 并测定了其分散性指 标和对皮肤的渗透试验， 其中实施例5表明晶形1在180会转变为晶形2， 晶形2在30静置 一段时间会吸湿。 WO2015159236A1公开了PQQ二钠盐晶体形式3、 形式4、 形式5、。
10、 形式6和形式 7， 没有给出任何效果实验数据。 WO2017050171A1公开了PQQ二钠盐的晶型I、 晶型II和晶型 III、 并测定了其吸湿性。 根据上述文献的报道以及发明人对上述晶体进行的研究， 发现已 有的PQQ二钠盐结晶容易吸湿的问题， 稳定性不好， 不适合用于开发， 影响了PQQ的推广使 用。 0006 本发明的发明人通过研究发现， 通过将含有吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐的水 溶液的pH调节至7.5-8.5， 然后加入酸调节pH至3.0-4.0， 通过脱盐、 结晶、 干燥得到吡咯喹 啉醌二钠盐晶体。 本发明提供的PQQ二钠盐新晶体， 相比现有技术已有的晶体， 在吸湿性方 面具有。
11、优势， 取得了预料不到的技术效果。 说明书 1/8 页 3 CN 109134459 A 3 发明内容 0007 本发明的目的之一是提供一种吡咯喹啉醌二钠盐新晶体。 0008 本发明提供一种吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征在于， 使用Cu Ka放射线进行X-射 线粉末衍射， 在衍射角2 为6.35， 8.31， 8.80， 18.80， 26.43， 27.35度处具有特征峰， 误差为 0.2 。 0009 本发明提供一种吡咯喹啉醌二钠盐晶体， 其特征在于， 使用Cu Ka放射线进行X-射 线粉末衍射， 在衍射角2 为6.35， 7.87， 8.31， 8.80， 13.48， 14.14， 1。
12、8.43， 18.80， 25.76， 26.08， 26.43， 27.35， 28.34， 28.99， 29.56度处具有特征峰， 误差为0.2 。 0010 本发明的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的X-射线粉末衍射具有如下表1的2 、 d和相对强 度数据： 0011 表1本发明的PQQ二钠盐X-射线粉末衍射数据 0012 说明书 2/8 页 4 CN 109134459 A 4 0013 0014 本发明的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的X-射线粉末衍射如图1所示。 0015 本发明的吡咯喹啉醌二钠盐晶体的进行热失重分析， 分解温度为325， 在110 左右失重10.6， 是三分子水的特征失重。 0016。
13、 本发明的另一目的是提供一种吡咯喹啉醌二钠盐晶体的制备方法， 包括以下步 骤： 0017 (1)溶解： 在纯化水中加入吡咯喹啉醌游离态或其碱金属盐， 温度控制在0-40， 搅拌下加入碱调节pH至7.5-8.5， 搅拌至全部溶解； 0018 (2)酸化： 加入酸调节pH3.0-4.0， ； 0019 (3)脱盐： 料液经过纳滤脱盐， 纯化水洗涤至透出液电导率50 S/cm； 0020 (4)浓缩结晶： 将脱盐后的料液， 真空浓缩结晶， 0021 (5)干燥： 将结晶产物抽滤， 用水洗涤， 滤饼真空干燥， 得终产物。 0022 步骤(1)中， 所述吡咯喹啉醌碱金属盐为PQQ一钠盐或三钠盐， 所述吡。
14、咯喹啉醌游 离态或其碱金属盐浓度在0.2-20g/L。 0023 步骤(1)中， 所述碱为氢氧化钠。 0024 步骤(2)中， 调节pH所用酸为盐酸、 硫酸、 磷酸、 乙酸、 甲酸、 乳酸和柠檬酸的一种， 或两种或更多中的组合， 更优选为盐酸或硫酸。 0025 步骤(3)中， 脱盐所用纳滤膜截留分子量300D， 更优选150-300D。 0026 步骤(4)中， 真空浓缩过程中料液内部温度在25-35， 真空浓缩时长为5-24h。 0027 步骤(4)中， 真空干燥温度为30-80， 真空干燥时间为5-15h。 0028 采用本发明的技术方案， 可以在不用任何有机溶剂的情况下方便地制造吡咯喹啉。
15、 醌二钠盐， 工艺简单， 重现性好， 适合大规模生产。 采用本发明的技术方案， 得到的吡咯喹啉 醌二钠盐晶体， 其晶体形态规则， 纯度高， 几乎无引湿性， 稳定性好。 附图说明 说明书 3/8 页 5 CN 109134459 A 5 0029 图1为实施例1提供的PQQ二钠盐晶体的X-射线粉末衍射图。 0030 图2为实施例1提供的PQQ二钠盐晶体的热失重分析图。 具体实施方式 0031 以下实施例对本发明进行详细说明， 但本发明不受实施例所限制。 0032 用于本发明的分析进行如下： 0033 PQQ分析 0034 仪器： SHIMADZU， LC-20A， 高效液相色谱 0035 色谱柱。
16、： Inertsil ODS-4(5 m)， 4.6150mm 0036 柱温： 40 0037 检测波长： 260nm 0038 洗脱液： 100mM乙酸/100mM乙酸铵(30/70， PH 5.1) 0039 洗脱速度： 1.5ml/min 0040 Na分析 0041 仪器： Metrohm 883Basic IC plus， 离子色谱仪 0042 色谱柱： Metrosep C 4 150/4.0 0043 柱温： 40 0044 洗脱液： 1.7mM硝酸/0.7mM吡啶二酸 0045 洗脱速度： 0.9ml/min 0046 X-射线粉末衍射分析 0047 仪器： BRUKERD2。
17、PHASER X-射线粉末衍射仪 0048 扫描速度： 4.000 /min 0049 扫描步宽： 0.01 0050 热失重分析 0051 仪器： MettlerTGA/DSC1/1100LF同步热分析仪 0052 升温速率： 10/min 0053 温度范围： 30-400 0054 实施例1 0055 将吡咯喹啉醌酸游离态100g加入10L水中， 搅拌成悬浊液， 加入氢氧化钠调节pH至 8.5， 搅拌15min基本全溶； 过滤， 得到滤液， 搅拌下缓慢加入盐酸调节pH至3.5； 通过截留分 子量150-300D的纳滤膜纳滤脱盐， 纯化水洗涤至透出液电导率50 S/cm， 结束； 真空浓缩。
18、 结晶， 浓缩过程中料液内部温度在25-35； 抽滤， 洗涤湿品， 50真空干燥6h， 得晶体 109.5g。 对所得晶体进行检测， HPLC测定其纯度为99.7； 阳离子色谱检测Na离子含量， 结 合HPLC外标法测得PQQ含量， 求出该晶体所含PQQ与Na的物质量比为PQQ Na1 1.98， 表明 该晶体为PQQ二钠盐； 热失重分析结果表明该晶体分解温度为325， 在110左右失重 10.6， 是三分子水的特征失重； X-射线粉末衍射检测结果表明该晶体为新晶型。 该晶体粉 末衍射谱图详见图1， 热失重分析谱图详见图2。 0056 实施例2 0057 将吡咯喹啉醌单钠盐100g加入10L水。
19、中， 搅拌成悬浊液， 加入氢氧化钠调节pH至 说明书 4/8 页 6 CN 109134459 A 6 7.5， 搅拌15min基本全溶； 过滤， 得到滤液， 搅拌下缓慢加入盐酸调节pH至3.2； 通过截留分 子量150-300D的纳滤膜纳滤脱盐， 纯化水洗涤至透出液电导率50 S/cm， 结束； 真空浓缩 结晶， 浓缩过程中料液内部温度在25-35； 抽滤， 洗涤湿品， 60真空干燥5h， 得晶体 96.8g。 对所得晶体进行检测， HPLC测定其纯度为99.8； 阳离子色谱检测Na离子含量， 结合 HPLC外标法测得PQQ含量， 求出该晶体所含PQQ与Na的物质量比为PQQ Na1 1.9。
20、6， 表明该 晶体为PQQ二钠盐。 相应热失重分析谱图及粉末衍射谱图同实施例1。 0058 实施例3 0059 将吡咯喹啉醌三钠盐100g加入10L水中， 搅拌成悬浊液， 加入氢氧化钠调节pH至 8.0， 搅拌15min基本全溶； 过滤， 得到滤液， 搅拌下缓慢加入硫酸调节pH至3.7； 通过截留分 子量150-300D的纳滤膜纳滤脱盐， 纯化水洗涤至透出液电导率50 S/cm， 结束； 真空浓缩 结晶， 浓缩过程中料液内部温度在25-35； 抽滤， 洗涤湿品， 40真空干燥10h， 得晶体 78.3g。 对所得晶体进行检测， HPLC测定其纯度为99.7； 阳离子色谱检测Na离子含量， 结合。
21、 HPLC外标法测得PQQ含量， 求出该晶体所含PQQ与Na的物质量比为PQQ Na1 2.03， 表明该 晶体为PQQ二钠盐。 相应热失重分析谱图及粉末衍射谱图同实施例1。 0060 对比例1 0061 根据CN102942567A的实施例1的方法制备PQQ二钠盐晶体： 取10mg PQQ二钠盐， 在 25下与1ml乙腈搅拌平衡5天， 随后过滤溶液， 在空气中干燥10min， 得到PQQ二钠盐晶体， 对其进行X-射线粉末衍射分析， 与CN102942567A的图1的X-射线衍射数据一致。 0062 对比例2 0063 根据WO2017050171A1的实施例1的方法制备PQQ二钠盐晶体： 将。
22、PQQ三钠盐溶液 100g(浓度0.7)升温至40， 持续搅拌30min， 调节pH至1.0-2.0； 过滤， 得到澄清滤液， 滤 液以10/h的速率降温至25， 并在25下搅拌析晶12h， 调节pH至3.0-4.0； 搅拌， 过滤， 25 下真空干燥， 得到PQQ二钠盐晶体， 对其进行X-射线粉末衍射分析， 与WO2017050171A1的 图1的X-射线衍射数据一致。 0064 对比例3 0065 根据WO2017050171A1的实施例11的方法制备PQQ二钠盐晶体： 将吡咯并喹啉醌 100g溶于10L水中， 10L乙醇升温至50， 持续搅拌30min， 溶解； 过滤， 降温至10， 调。
23、节pH至 3.0-4.0； 搅拌， 过滤， 25下真空干燥， 得到PQQ二钠盐晶体， 对其进行X-射线粉末衍射分 析， 与WO2017050171A1的图9的X-射线衍射数据一致。 0066 实施例4： 引湿性实验 0067 采用以下条件进行测试： 将称量瓶敞口置于25的恒温干燥器(下层放置硫酸铵 饱和溶液)， 相对湿度为80， 放置24h和48h后充分吸湿， 合盖称重； 计算增重结果如下： 0068 表2 PQQ二钠盐吸湿性数据 说明书 5/8 页 7 CN 109134459 A 7 0069 0070 通过表2可以看出， 现有技术中常见的几种二钠盐晶体均有一定的吸湿性， 而本发 明提供的。
24、二钠盐晶体在高湿度的环境下几乎无吸湿性， 使得其具有更广泛地应用。 0071 对比例4 0072 根据CN201580019780.7的实施例4的方法， 按照说明书第119-120段的程序， 制备 PQQ二钠盐晶体(PQQ.2Na多晶物)， 对其进行X-射线粉末衍射分析等表征， 粉末XRD图谱与 CN201580019780.7的图4的X-射线衍射数据基本一致。 0073 本发明提供的PQQ二钠盐新晶体， 相比现有技术已有的晶体， 在生物利用度方面也 具有优势， 取得了预料不到的技术效果， 以下通过实施例5和6加以验证和说明。 0074 实施例5： 生物利用度实验 0075 以下进行蛋鸡血液中。
25、PQQ的生物利用度实验： 0076 将本地12只芦花鸡随机分四组， 分别为对照组、 试验组一、 试验组二、 试验组三， 每 组3只芦花鸡。 0077 四组鸡先用基础饲料饲喂一周后， 从第八天开始， 对照组继续饲喂基础饲料； 试验 组一， 在饲喂基础饲料基础上， 按800 g/kg水平添加实施例1制得的PQQ二钠盐晶体(记为： 晶型A)。 试验组二， 在饲喂基础饲料基础上， 按800 g/kg水平添加对比例2制得的PQQ晶体 (记为： 晶型B)。 试验组三， 在饲喂基础饲料基础上， 按800 g/kg水平添加对比例4制得的PQQ 晶体(记为： 晶型C)。 饲喂七天后， 测定鸡血中PQQ的含量。 。
26、0078 鸡血中PQQ含量的测定： 0079 用注射器直接自供试鸡的心脏抽取血液10-15ml， 经预处理， 采用HPLC检测， 检测 限0.5nd/ml。 0080 根据研究， PQQ在254nm处有吸收峰， 以甲醇、 水为流动相， 以紫外检测器在254nm处 C18柱即可检测PQQ含量。 鸡血中PQQ含量列于表3中： 0081 表3： 鸡血中PQQ含量 0082 对照(ng/ml)A(ng/ml)B(ng/ml)C(ng/ml) 51.354.653.152.7 0083 表3的结果表明： 饲喂PQQ二钠盐一周后， 鸡血中PQQ含量比对照组均明显增加， 但 是饲喂晶型A的试验组一比饲喂晶型。
27、B的试验组二和饲喂晶型C的试验组三鸡血中PQQ含量 显著增加一个水平， 其原因可能是晶型A更利于芦花鸡体内的吸收利用。 0084 实施例6： 对蛋鸡产蛋率的影响 说明书 6/8 页 8 CN 109134459 A 8 0085 选用山东本地400日龄的芦花母鸡360只作为蛋鸡， 随机分为四组， 分别为对照组、 试验组一、 试验组二、 试验组三， 每组90只芦花鸡。 三组芦花鸡先用基础饲料饲喂7天。 从第8 天开始， 进行30天正式试验。 在此期间， 对照组仍用基础饲料饲喂； 试验组一在饲喂基础饲 料基础上按800 g/kg水平添加实施例1制得的PQQ二钠盐晶体(记为： 晶型A)； 试验组二在。
28、饲 喂基础饲料基础上以800 g/kg水平添加对比例2制得的PQQ晶体(记为： 晶型B)。 试验组三在 饲喂基础饲料基础上以800 g/kg水平添加对比例4制得的PQQ晶体(记为： 晶型C)。 正式试验 30天结束后， 计算产蛋率、 平均日采食量。 0086 产蛋率(Laying rate/)： 30天总的产蛋数/(母鸡数*30天)*100 0087 平均日采食量(ADFI/g)： 记录三十天各组母鸡的饲料消耗量/总天数 0088 PQQ二钠盐对蛋鸡产蛋率的影响情况列于表4中： 0089 表4： PQQ二钠盐对蛋鸡产蛋率的影响 0090 0091 表4的结果表明： 添加PQQ二钠盐的饲料饲喂显。
29、著提高产蛋率， 晶型A提高产蛋率的 效果明显优于晶型B和晶型C。 0092 由实施例5和表3的结果可知， 饲喂晶型A的PQQ二钠盐的芦花鸡血液中PQQ浓度比 饲喂晶型B的PQQ二钠盐和饲喂晶型C的PQQ二钠盐的芦花鸡血液PQQ浓度明显高一个水平， 推知A晶型更利于芦花鸡自身的吸收和利用。 综合实施例5和6以及表3和4的结果， 表明， 本 发明提供的PQQ二钠盐(A晶型)更利于芦花鸡的吸收和利用， 并最终对蛋鸡产蛋率带来显著 的积极影响。 0093 本发明提供的PQQ二钠盐新晶体， 相比现有技术已有的晶体， 在压片加工方面同样 具有优势， 取得了预料不到的技术效果， 以下通过实施例7加以验证和说。
30、明。 0094 实施例7： 压片性能比较 0095 一、 流动性对比 0096 考察实施例1制得的PQQ二钠盐晶体(记为： 晶型A)、 对比例2制得的PQQ晶体(记为： 晶型B)和对比例4制得的PQQ晶体(记为： 晶型C)这三种不同晶型的休止角和卡尔指数(Carr index)， 来表征三种晶型的流动性， 结果如表5所示： 。 0097 表5： 流动性 说明书 7/8 页 9 CN 109134459 A 9 0098 0099 表5的结果显示， 晶型A的流动性明显好于晶型B和晶型C， 更适合于直接压片工艺。 0100 二、 压片对比 0101 考察以上三种晶型原料药加入相同辅料(处方组成如下。
31、表6所示)后， 加入三维运 动混合机(型号： SYH-5型)中混合10min， 混合频率为25Hz， 考察混合后物料压片(型号： ZP- 10A旋转式压片机)时的片重差异、 压力和片子硬度的关系、 脆碎度等指标， 压片情况对比如 下表7所示。 0102 表6： 处方组成 0103 0104 表7： 压片情况对比 0105 0106 结果显示， 三种晶型相同处方混合后压片， 晶型A流动性更好， 压片时片重差异小； 施加相同压力， 晶型A的片子硬度更高， 说明晶型A可压性优于晶型B和晶型C； 由于晶型A处 方的硬度高， 脆碎度明显好于晶型B和晶型C处方。 综合评估， 晶型A更适合于直接压片。 说明书 8/8 页 10 CN 109134459 A 10 图1 说明书附图 1/2 页 11 CN 109134459 A 11 图2 说明书附图 2/2 页 12 CN 109134459 A 12 。