一种检测T-2毒素的方法及其专用试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102080066 A (43)申请公布日 2011.06.01 CN 102080066 A *CN102080066A* (21)申请号 200910237949.2 (22)申请日 2009.11.26 CGMCC NO:3395 2009.11.03 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/44(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 北京维德维康生物技术有限公司 地址 100085 北京市海淀区上地开拓路 5 号 中关村生物医药园 B 区 421 室 (72)发明人 吴小平 江海洋 王战辉 史为民 徐飞 张兴。

2、祥 王熙 潘净如 王进 李娜 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一种检测 T-2 毒素的方法及其专用试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种检测 T-2 毒素的方法及 其专用试剂盒。本发明提供了保藏编号为 CGMCC No.3395 的杂交瘤细胞株 3E-5A-7H-8B。本发明 还提供了一种单克隆抗体， 是由保藏编号为CGMCC No.3395 的杂交瘤细胞株 3E-5A-7H-8B 分泌产生 的。本发明提供的试剂盒包括所述单克隆抗体。 本发明中将 T-2 毒素进行结构改造， 加入间隔臂， 合成了人工抗原。 用所述人工。

3、抗原免疫动物， 获取 到了一个杂交瘤细胞株， 该杂交瘤细胞株分泌得 到的单克隆抗体特异性很高。 本发明的试剂盒， 操 作简便易行， 造价低廉， 具有特异性高、 灵敏度高、 精确度高等特点， 能够现场监控且适合大量样本 筛查， 将在 T-2 毒素的检测中发挥重要作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 1 页 CN 102080069 A1/2 页 2 1. 保藏编号为 CGMCC No.3395 的 T2 毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。 2.一种单克隆抗体， 是由保藏编号为CGMC。

4、C No.3395的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞 株分泌产生的。 3. 一种检测 T-2 毒素的酶联免疫试剂盒， 包括权利要求 2 所述单克隆抗体。 4. 如权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒为如下 1) 至 4) 中的任意一 种 ： 1) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、 一抗和酶标二抗 ； 所述包被原为式 (I) 所 示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物 ； 所述一抗为所述单克隆抗体 ； 2) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标半抗原 ； 所述包被原为所述单克隆 抗体 ； 所述酶标半抗原中的半抗原为式 (I) 所示的化合物 ； 3) 所述试剂盒包括包被有包被。

5、原的酶标板和酶标一抗 ； 所述包被原为式 (I) 所示的化 合物和载体蛋白偶联得到的偶联物 ； 所述酶标一抗中的一抗为所述单克隆抗体 ； 4) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、 一抗和酶标半抗原 ； 所述包被原为二抗 ； 所述一抗为所述单克隆抗体 ； 所述酶标半抗原中的半抗原为式 (I) 所示的化合物 ； ( 式 I)。 5. 如权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述载体蛋白为鼠血清蛋白、 甲状腺蛋 白、 牛血清白蛋白、 兔血清白蛋白、 人血清白蛋白、 卵清蛋白或血蓝蛋白 ； 所述的二抗为羊抗 鼠二抗或羊抗兔二抗。 6. 如权利要求 4 或 5 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 。

6、1) 中所述的酶标二抗、 2) 或 4) 中所 述的酶标半抗原、 3) 中所述的酶标一抗中， 所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯 酶。 7. 如权利要求 3 至 6 中任一所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒还包括呕吐毒素 标准品溶液、 底物显色液、 终止液、 浓缩洗涤液和样品浓缩液 ； 所述呕吐毒素标准品溶液浓度为 0-4ng/mL ； 所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液 ； 所述浓缩洗涤液优选为将 0.8-1.2mL 吐温 20 和 0.5g 叠氮钠加入 100mL pH7.4 0.01M 磷酸盐缓冲液得到的溶液 ； 所述样品浓缩液为 0.8mol/L pH7.2-7.5 的磷酸盐缓。

7、冲液。 8.如权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述标记酶为辣根过氧化物酶 ； 所述底物 显色液由显色液A液和显色液B液组成 ； 显色液A液为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液 ； 显色 液 B 液为邻苯二胺溶液或四甲基联苯胺溶液 ； 所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。 9.如权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述标记酶为碱性磷酸酯酶 ； 所述底物显 色液为对硝基苯磷酸酯缓冲液 ； 所述终止液为氢氧化钠溶液。 10. 一种检测样品中 T-2 毒素的方法， 包括如下步骤 ： 1) 将待测样品进行前处理， 得到待测样本溶液 ； 2) 用权利要求 3-9 中任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行。

8、检测 ； 权 利 要 求 书 CN 102080066 A CN 102080069 A2/2 页 3 所述待测样品为谷物或饲料 ； 所述前处理的方法为 ： 称取待测样品， 溶于 20 体积份甲醇和 80 体积份水的混合液中， 超声波提取， 过滤。 权 利 要 求 书 CN 102080066 A CN 102080069 A1/11 页 4 一种检测 T-2 毒素的方法及其专用试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种检测 T-2 毒素的方法及其专用试剂盒。 背景技术 0002 T-2 毒素 (T-2toxin)， 属于单端孢霉烯族 A 族化合物， 是该类化合物中毒性最强、 污染水平较高的毒。

9、素之一， 主要由镰刀霉菌产生。T-2 毒素主要污染小麦、 玉米、 大麦、 燕麦 和黑麦等谷物及麦芽、 啤酒和面包等农产品。关于 T-2 毒素污染情况的报道， 大多集中于对 谷物和饲料的报道。 T-2毒素是体内蛋白质合成的抑制剂， 人畜误食病谷后， 可引起呕吐、 腹 泻、 发热等急性中毒症状， 严重时可损伤造血组织， 造成伤亡。此外， T-2 毒素还与我国某些 地区食管癌、 克山病和大骨节病的高发病率有着密切的关系。 0003 T-2 毒素的检测方法有气相色谱法、 薄层层析法、 高效液相色谱法和气质联仪法 等。 这些方法有的太复杂， 有的缺乏灵敏度， 有的价格昂贵， 不适于常规毒素分析。 因此有。

10、必 要建立一种特异性强、 灵敏可靠、 简单快速、 适于检测大量样品的方法， 以便加强对 T-2 毒 素的监控。酶联免疫吸附测定 (ELISA) 法是一种准确、 可靠、 快速、 特异的检测方法， 适合于 大量样品的检测。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种检测 T-2 毒素的方法及其专用试剂盒。 0005 本发明提供了分泌 T-2 毒素单抗的杂交瘤细胞株， 即为保藏编号为 CGMCCNo.3395 的 T2 毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株 (3E-5A-7H-8B)。该细胞株已于 2009 年 11 月 3 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址 。

11、： 北京市朝阳区大屯 路， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC No.3395。 0006 本发明还保护一种单克隆抗体， 是由保藏编号为CGMCC No.3395的T2毒素单克隆 抗体杂交瘤细胞株 (3E-5A-7H-8B) 分泌产生的。 0007 本发明同时保护一种检测 T-2 毒素的酶联免疫试剂盒， 包括所述单克隆抗体。 0008 所述试剂盒可为如下 1) 至 4) 中的任意一种 ： 0009 1) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、 一抗和酶标二抗 ； 所述包被原为式 (I) 所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物 ； 所述一抗为所述单克隆抗体 ； 。

12、0010 2) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标半抗原 ； 所述包被原为所述单 克隆抗体 ； 所述酶标半抗原中的半抗原为式 (I) 所示的化合物 ； 0011 3) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标一抗 ； 所述包被原为式 (I) 所示 的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物 ； 所述酶标一抗中的一抗为所述单克隆抗体 ； 0012 4) 所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、 一抗和酶标半抗原 ； 所述包被原为二 抗 ； 所述一抗为所述单克隆抗体 ； 所述酶标半抗原中的半抗原为式 (I) 所示的化合物 ； 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A2/11。

13、 页 5 0013 ( 式 I)。 0014 1) 所述试剂盒的检测原理为 ： 当在微孔条上预包被 T-2 毒素抗原 (CMO-T-2- 载体 蛋白 ) 时， 加入样本溶液或标准品溶液后， 再加入 T-2 毒素特异性抗体溶液， 样本中残留的 T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标板上包被的T-2毒素抗原竞争T-2毒素特异性抗体， 加入 酶标记二抗进行放大作用， 用显色液显色， 样本吸光值与样本中 T-2 毒素的含量成负相关， 与标准曲线比较即可得出样本中 T-2 毒素的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅， 与 系列浓度 T-2 毒素标准品溶液颜色比较粗略判断样品中 T-2 毒素含量的浓度范围。 。

14、0015 2) 所述的试剂盒的检测原理为 ： 当在微孔条上预包被 T-2 毒素特异性抗体时， 加 入样本溶液或标准品溶液后， 再加入酶标记T-2毒素半抗原溶液， 样本中残留的T-2毒素或 T-2毒素标准品与酶标记半抗原(CMO-T-2)竞争包被在酶标板上的T-2毒素特异性抗体， 用 显色液显色， 样本吸光值与 T-2 毒素的含量成负相关， 与标准曲线比较即可得出样本中 T-2 毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅， 与系列浓度的 T-2 毒素标准品溶液颜色 比较粗略判断样品中 T-2 毒素含量的浓度范围。 0016 3) 所述的试剂盒的检测原理为 ： 当在微孔条上预包被 T-2 毒素抗原。

15、 (CMO-T-2- 载 体蛋白 ) 时， 加入样本溶液或标准品溶液后， 再加入酶标记 T-2 毒素特异性抗体溶液， 样本 中的 T-2 毒素或 T-2 毒素标准品与酶标板上包被的 T-2 毒素抗原竞争 T-2 毒素特异性抗 体， 用显色液显色， 样本吸光值与样本中 T-2 毒素的含量成负相关， 与标准曲线比较即可得 出样本中 T-2 毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅， 与系列浓度 T-2 毒素标准 品溶液颜色比较粗略判断样品中 T-2 毒素含量的浓度范围。 0017 4) 所述的试剂盒的检测原理为 ： 当在微孔条上预包被二抗时， 加入 T-2 毒素抗体 孵育后， 加入样本溶液或标准。

16、品溶液， 再加入酶标记 T-2 毒素半抗原 (CMO-T-2) 溶液， 样本 中的 T-2 毒素或 T-2 毒素标准品与酶标记 T-2 毒素半抗原竞争 T-2 毒素特异性抗体， 用显 色液显色， 样本吸光度值与样本中 T-2 毒素的含量成负相关， 与标准曲线比较即可得出样 本中 T-2 毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅， 与系列浓度 T-2 毒素标准品溶 液颜色比较粗略判断样品中 T-2 毒素含量的浓度范围。 0018 所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白 (BSA)、 人血清白蛋白 (HSA)、 鼠血清蛋白 (MSA)、 甲状腺蛋白 (BCG)、 兔血清白蛋白 (RSA)、 血蓝蛋白 (。

17、KLH) 或卵清白蛋白 (OVA)， 其中 优选 BSA、 KLH。 0019 所述二抗可为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。 0020 所述试剂盒还可包括 T-2 毒素标准品溶液、 底物显色液、 终止液、 浓缩洗涤液、 样 品浓缩液等组分。把浓缩液进行 20 倍稀释， 即为检测中使用的样品稀释液。 0021 所述 T-2 毒素标准品溶液， 可以是一定浓度范围内的多种浓度的标准溶液， 其浓 度可在 0-4ng/mL 之间。例如可以是含有 8 瓶的标准品溶液， 其浓度分别为 0ng/mL、 0.2ng/ mL、 0.4ng/mL、 0.8ng/mL、 1.6ng/mL、 3.2ng/mL。 0022 所述。

18、浓缩洗涤液可采用任何本领域常用的浓缩洗涤液， 优选为磷酸盐缓冲液， 例 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A3/11 页 6 如含有吐温和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。所述浓缩洗涤液具体可为 ： 将 0.8-1.2mL 吐温 20 和 0.5g 叠氮钠加入 100mL pH7.4 0.01M 磷酸盐缓冲液得到的溶液。 0023 所述样品浓缩液即为试剂盒应用中的样品稀释液的母液， 样品浓缩液稀释后 ( 如 稀释至20倍体积)即为样品稀释液。 所述样品稀释液优选为磷酸盐缓冲液， 例如0.04mol/ L pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液， 还可以是本领域常用的其它样品稀释。

19、液。 所述样品浓缩液具 体可为 0.8mol/L(200.04mol/L)pH7.2-7.5 的磷酸盐缓冲液。 0024 所述酶标记复合物 ( 酶标记的 T-2 毒素半抗原、 酶标记的 T-2 毒素特异性抗体、 酶 标记的二抗 ) 的标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶， 其中优选辣根过氧化物酶。 可采用现有技术中的多种方法将辣根过氧化物酶与二抗进行偶联， 如戊二醛法， 过碘酸钠 法等。具体可采用如下方法将二抗与辣根过氧化物酶 (HRP) 进行偶联 ： 将辣根过氧化物 酶溶解于蒸馏水中 ； 加入 NaIO4溶液， 室温搅拌反应 ； 用醋酸盐缓冲液于 4透析过夜， 除去多余的 NaIO4， 同。

20、时使自身偶联的酶还原 ； 加入磷酸盐缓冲液和含有 IgG( 羊抗鼠二 抗 ) 的磷酸盐缓冲液， 室温搅拌反应 ； 加入 NaBH4水溶液， 在 4反应 4h， 以还原 Schiff 碱 ； 纯化保存。该改良的过碘酸钠法省时、 降低了辣根过氧化物酶 (HRP) 与二抗的浓度 比率， 节省了原材料。当标记酶为辣根过氧化物酶时 ： 底物显色液由显色液 A 液和显色液 B 液组成 ； 显色液 A 液优选为过氧化氢或过氧化脲溶液 ； 显色液 B 液优选为邻苯二胺或四甲 基联苯胺溶液 ； 终止液为硫酸或盐酸溶液， 优选为硫酸溶液， 其浓度例如为 1-2mol/L。当标 记酶为碱性磷酸酯酶时 ： 显色液优选。

21、为对硝基苯磷酸酯缓冲液 ； 终止液优选为氢氧化钠溶 液， 其浓度优选为 1-2mol/L， 更特别的优选为 2mol/L。显色液和终止液也可以是本领域常 用的其它显色液和终止液。 0025 可采用如下方法用包被原包被酶标板 ： 用包被缓冲液将包被原稀释， 并加入各孔 中， 37左右温育数小时(或4左右过夜)， 倾去包被缓冲液， 用洗涤液洗涤， 拍干， 然后在 每孔中加入封闭液， 温育， 倾去孔内液体拍干， 干燥后用铝膜真空密封保存。 例如， 用包被缓 冲液将包被原稀释为 0.05-0.1g/mL， 每孔加入 100L， 37温育 2h， 倾去包被缓冲液， 用 洗涤液洗涤 2 次， 每次 30s。

22、， 拍干， 然后在每孔中加入 150-200L 封闭液， 37温育 1-2h， 倾 去孔内液体拍干， 干燥后用铝膜真空密封保存。 0026 以上包被酶标板的方法中 ： 所用的包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液， 例如 pH9.6、 0.01-0.1mol/L 的碳酸钠缓冲液。所用的封闭液优选为磷酸盐缓冲液， 例如如下溶液 ： 将 0.5mL 马血清、 0.1g 叠氮化钠和 3g 酪蛋白加入 100mL 0.02M pH7.2 磷酸盐缓冲液中得到的 溶液 ； 包被缓冲液和封闭液也可以是本领域常用的其它包被缓冲液和封闭液。 0027 本发明还保护一种检测样品中 T-2 毒素的方法， 包括如下步骤 ： 0。

23、028 1) 将待测样品进行前处理， 得到待测样本溶液 ； 0029 2) 用以上任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测 ； 0030 1) 将待测样品进行前处理， 得到待测样本溶液 ； 0031 2) 用以上任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测 ； 0032 所述待测样品为谷物或饲料 ； 0033 所述前处理的方法为 ： 0034 称取待测样品， 溶于甲醇/蒸馏水(体积比为8020)溶液中， 超声波提取， 过滤， 即为待测样本溶液。 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A4/11 页 7 0035 T-2 毒素是只有免疫反应性， 没有免疫原性， 不能诱发。

24、机体产生免疫应答， 必须与 大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明中将 T-2 毒素进行结构改造， 加入间隔臂， 合成了人工抗原。 用所述人工抗原免疫动物， 获取到了一个杂交瘤细胞株， 该杂交瘤细胞株 分泌得到的单克隆抗体特异性很高。本发明还提供了基于不同 ELISA 原理的四种试剂盒， 可以定性或定量检测谷物、 饲料及其加工产品中 T-2 毒素的含量， 样品前处理过程简单， 能 同时检测大批样品。本发明的试剂盒， 操作简便易行， 造价低廉， 具有特异性高、 灵敏度高、 精确度高等特点， 能够现场监控且适合大量样本(谷物、 饲料及其加工产品)筛查， 将在T-2 毒素的检测中发挥重要作用。 。

25、附图说明 0036 图 1 为 T-2 毒素的检测标准曲线图。 具体实施方式 0037 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0038 T-2毒素标准品 ： Sigma Aldrich公司， CAS号 ： 21259-20-1 ； DBalb/c小鼠 ： 北京实 验动物研究中心 ； SP2/0 骨髓瘤细胞 ： 上海玉博生物科技有限公司 ； 新西兰大白兔 ： 北京实 验动物研究中心。 0039 实施例 1、 试剂盒组分的制备 0040 产。

26、率转化为产物所消耗掉的主反应物量 / 主反应物消耗总量 100。 0041 一、 抗原的制备 0042 1、 半抗原 (CMO-T-2) 的制备 0043 所述 T-2 毒素半抗原是指 T-2 毒素与 O-( 羧甲基 ) 羟胺半盐酸盐反应得到的产物 (CMO-T-2)。制备的具体步骤如下 ： 0044 称取 9.5mg T-2 毒素溶解于 1ml 干燥的二氯甲烷中， 称为 A 液 ； 称取 17mg 氯铬 酸吡啶嗡盐 (PCC) 溶解于 2ml 干燥的二氯甲烷中， 称为 B 液 ； 0045 室温条件下， 在搅拌状态下， B 液逐滴加入到 A 液中， 搅拌反应 66h ； 0046 反应混合物。

27、 ( 黑色 ) 用 5ml 二氯甲烷稀释， 5ml 饱和食盐水洗涤 4 次， 无水硫酸 钠干燥， 浓缩得到淡黄色化合物 3-Dehydro-T-2 7.7mg， 产率 81.2 ； 0047 5.0mg 3-Dehydro-T-2 溶于 3ml 90甲醇溶液 ( 溶有 1mg 乙酸钠 ； 体积百分含 量 )， 随后再加入 2mg 羧甲氧基胺半盐酸盐， 室温搅拌过夜 ； 0048 反应混合物蒸干， 10ml乙酸乙酯复溶， 10ml 0.1M HCl洗涤3次， 蒸干浓缩， 得到 3.43mg CMO-T-2( 式 I 所示化合物 )， 产率 57.4。 0049 ( 式 I) 说 明 书 CN 1。

28、02080066 A CN 102080069 A5/11 页 8 0050 2、 抗原 (CMO-T-2- 载体蛋白 ) 的制备 0051 将 T-2 毒素半抗原与载体蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到抗原。 0052 (1)CMO-T-2-BSA 的制备 0053 称取 5mg CMO-T-2 溶于 1ml N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 称为 A 液 ； 20mg BSA 和 10mg 1- 乙基 -3-(3- 二甲胺基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDCHCl) 溶于 10ml 蒸馏水中， 称 为 B 液 ； 在搅拌状态下， A 液逐滴加入到 B 液中， 10min 后， 再加。

29、入 5mgN- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， 室温下搅拌 18h， 期间通过滴加 Na2HPO4维持 pH 在 5.5 ； 反应结束后， 4透析 72h， 冻 干， 得到 CMO-T-2-BSA， 产率为 62.3。 0054 (2)CMO-T-2-OVA 的制备 0055 称取 5mg CMO-T-2 溶于 1ml N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中， 称为 A 液 ； 20mg OVA 和 10mg 1- 乙基 -3-(3- 二甲胺基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDCHCl) 溶于 10ml 蒸馏水中， 称 为 B 液 ； 在搅拌状态下， A 液逐滴加入到 B 液中， 10min 后。

30、， 再加入 5mgN- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， 室温下搅拌 18h， 期间通过滴加 Na2HPO4维持 pH 在 5.5 ； 反应结束后， 4透析 72h， 冻 干， 得到 CMO-T-2-OVA， 产率为 62.3。 0056 用其它载体蛋白与 CMO-T-2 偶联， 同样可以制备得到抗原， 在制备过程中， 用其它 载体蛋白代替 BSA 即可。 0057 二、 特异性抗体的制备 0058 ( 一 ) 单克隆抗体的制备 0059 1、 动物免疫 0060 将步骤一制备的 CMO-T-2-BSA 作为免疫原注入到 Balb/c 小鼠体内， 免疫剂量为 75g/ 只， 使其产生多克隆抗体。 。

31、0061 2、 细胞融合和克隆化 0062 取步骤 1 的小鼠的脾细胞， 按 5 1 比例与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合， 采用间接竞争 ELISA 测定细胞上清液， 筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化， 直到得到稳定 分泌单克隆抗体的 T2 毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株 (3E-5A-7H-8B)。该细胞株已于 2009 年 11 月 3 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC No.3395。 0063 3、 细胞冻存和复苏 0064 将 T-。

32、2 毒素的单克隆杂交瘤细胞株 3E-5A-7H-8B 用冻存液制成 1106个 /mL 的 细胞悬液， 在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管， 立即放入 37水浴中速融， 离心去除冻 存液后， 移入培养瓶内培养。 0065 4、 单克隆抗体的制备与纯化 0066 (1)增量培养法 ： 将杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B置于细胞培养基中， 在37条件下 进行培养， 用辛酸 - 饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化， 得到单克隆抗体， -20保存。 所述细胞培养基是将 20mL 小牛血清和 0.2g 碳酸氢钠加入 100mLRPMI-1640 培养基中得到 的 ； 所述细胞培养基的 pH 为 7.4。

33、。 0067 抗体效价的测定 ： 通过棋盘法测定抗体的效价为 1.5107， 其中包被抗原为 CMO-T-2-OVA。 0068 (2) 上述单克隆抗体还可以采取以下方法制备 ： 将 Balb/c 小鼠腹腔注入灭菌石蜡 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A6/11 页 9 油 0.4mL/ 只， 7 天后腹腔注射 T-2 毒素的单克隆杂交瘤细胞株 3E-5A-7H-8B5105个 / 只， 7 天后采集腹水。用辛酸 - 饱和硫酸铵法进行纯化， 纯化后的腹水放入 -20环境保存。 0069 当抗原为其他载体蛋白与 CMO-T-2 的偶联物时， 单克隆抗体的制备方。

34、法同上。 0070 ( 二 ) 多克隆抗体的制备 0071 采用新西兰大白兔作为免疫动物， 采用步骤一制备的 CMO-T-2-BSA 为免疫原， 免 疫剂量为 1.5mg/kg ； 首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂， 颈背部皮下 多点注射， 间隔 3 4 周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化， 加强免疫一 次， 共免疫5次， 最后一次不加佐剂 ； 最后一次免疫10天后采血， 测定血清抗体效价， 心脏采 血， 用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。 0072 当抗原为其他载体蛋白与 CMO-T-2 的偶联物时， 多克隆抗体的制备方法同上。 0073 三、 二抗的制备 0。

35、074 以山羊作为免疫动物， 以步骤二的 ( 一 ) 的 4 的 (1) 制备的单克隆抗体为免疫原 对无病原体山羊进行免疫， 得到羊抗鼠二抗。以山羊作为免疫动物， 以步骤二的 ( 二 ) 制备 的多克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫， 得到羊抗兔二抗。 0075 用其它动物制备二抗时， 用特异性抗体 ( 单克隆抗体或多克隆抗体 ) 免疫动物即 可。 0076 四、 酶标复合物的制备 0077 1、 酶标记羊抗鼠二抗的制备 0078 采用改良的碘酸钠法将步骤三制备的羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶 (HRP) 进行 偶联， 具体方法如下 ： 0079 将 8mg 辣根过氧化物酶溶解于 2mL 蒸馏。

36、水中。 0080 加入现配制的 100mmol/L NaIO4溶液 0.4mL， 室温搅拌反应 20min。 0081 用 1mmol/L 醋酸盐缓冲液于 4透析过夜， 除去多余的 NaIO4， 同时使自身偶联 的酶还原。 0082 加入磷酸盐缓冲液 (pH8.6、 0.5mol/L)40L 和含有 IgG( 羊抗鼠二抗 )16mg 的 磷酸盐缓冲液 (pH 8.6、 5mol/L)2.0mL， 室温搅拌反应 4h。 0083 加入现配制的 NaBH4水溶液 (1mol/L)0.1mL， 在 4反应 4h， 以还原 Schiff 碱。 0084 纯化保存。 0085 改良的碘酸钠法省时， 且降。

37、低辣根过氧化物酶 (HRP) 与二抗的浓度比率， 节省了 原材料。 0086 用其它二抗制备酶标二抗的方法参见酶标羊抗鼠二抗的制备方法。 0087 五、 酶标板的包被 0088 包被缓冲液为pH9.6、 0.010.1mol/L的碳酸钠缓冲液 ； 封闭液为 ： 将0.5mL马血 清、 0.1g 叠氮化钠和 3g 酪蛋白加入 100mL pH7.2 0.02M 磷酸盐缓冲液中得到的。 0089 用包被缓冲液将步骤一制备的 CMO-T-2-OVA 稀释成 0.5-10.0g/mL， 每孔加入 100L， 37温育 2h( 或 4过夜 )， 倾去包被缓冲液， 用样品稀释液 ( 将样品浓缩液 20 倍。

38、 稀释 ) 洗涤 2 次， 每次 30s， 拍干， 然后在每孔中加入 200L 封闭液， 37温育 2h， 倾去孔内 液体， 拍干， 干燥后用铝膜真空密封保存。即为包被有包被原 (CMO-T-2-OVA) 的酶标板。 0090 包被有其它包被原的酶标板的制备方法同上， 用其它包被原 ( 如其他载体蛋白与 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A7/11 页 10 CMO-T-2 的偶联物、 步骤二制备的特异性抗体或步骤三制备的二抗 ) 代替 CMO-T-2-OVA 即 可。 0091 实施例 2、 检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒的制备、 应用和性能鉴定 0092 一。

39、、 试剂盒的组成 0093 1、 T-2 毒素标准品溶液 0094 T-2 毒素标准品溶液 6 瓶， 浓度分别为 0ng/mL、 0.2ng/mL、 0.4ng/mL、 0.8ng/mL、 1.6ng/mL、 3.2ng/mL。 0095 2、 底物显色液 0096 底物显色液由 A 液和 B 液组成， 底物显色液 A 液为 2过氧化脲溶液， 底物显色液 B 液为 1四甲基联苯胺溶液 (TMB)。 0097 3、 终止液 0098 终止液为 2mol/L 硫酸。 0099 4、 浓缩洗涤液 0100 浓缩洗涤液为将 1.0mL 吐温 20 和 0.5g 叠氮钠加入 100mL pH7.4 0.。

40、01M 磷酸盐缓 冲液得到的溶液。 0101 5、 样品浓缩液 0102 样品浓缩液为 0.8mol/L(200.04mol/L)pH7.3 的磷酸盐缓冲液。 0103 6、 包被有包被原的酶标板 0104 实施例 1 制备的包被有 CMO-T-2-OVA 的酶标板。 0105 7、 酶标二抗 0106 实施例 1 制备的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。 0107 8、 一抗 0108 实施例 1 的步骤二的 ( 一 ) 的 4 的 (1) 制备的单克隆抗体。 0109 二、 应用试剂盒进行检测的方法 0110 1、 谷物和饲料样品的前处理 0111 称取 5g 粉碎后的样品， 溶于 25ml。

41、 甲醇 / 蒸馏水 ( 体积比为 80 20) 溶液中， 室 温条件下， 超声波提取 20min。过滤后， 取 1ml 上清液溶于 4ml 样品稀释液 ( 将样品浓缩液 20 倍稀释 ) 中， 充分混匀。取 50l 稀释后滤液进行检测。 0112 2、 用试剂盒对样品进行检测 0113 向包被有包被原的酶标板微孔中加入 T-2 毒素标准品溶液或样本溶液 50L， 再 加入一抗 50L， 用盖板膜封板， 37恒温箱中反应 30min， 倒出孔中液体， 每孔加入 250L 浓缩洗涤液， 30s 后倒出孔中液体， 如此重复操作共洗板 5 次， 用吸水纸拍干。加入酶标二 抗 100L， 37恒温箱中反。

42、应 30min， 倒出孔中液体， 重复洗涤步骤， 每孔加入底物显色液 A 液， 底物显色液 B 液， 轻轻振荡混匀， 37恒温箱避光显色 15min， 每孔加入 2mol/L 终止液 50L， 轻轻振荡混匀， 用酶标仪， 测定每孔吸光度值。 0114 3、 检测结果分析 0115 用得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值 (B) 除以第一个标准品溶液 (0 标准 ) 的吸光度值 (B0) 再乘以 100， 得到百分吸光度值 ( 百分吸光度值 ( ) (B/ B0)100 )。以 T-2 毒素标准品浓度 (L/L) 为 X 轴， 百分吸光度值为 Y 轴， 绘制标准曲 说 明 书 CN 10208。

43、0066 A CN 102080069 A8/11 页 11 线图(见图1)。 用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值， 相对应每一个样品的浓度， 则 可从标准曲线上读出样本中 T-2 毒素的含量。 0116 检测结果的分析也可以采用回归方程法， 计算出样品溶液浓度。检测结果的分析 还可以利用计算机专业软件， 此法更便于大量样品的快速分析， 整个检测过程只需较短时 间， 1.5h 内即可以完成。 0117 三、 试剂盒的性能鉴定 0118 1、 标准品精密度试验 0119 分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板， 每批各抽取 10 个 试剂盒， 每板各抽出20个微孔， 测定0.8。

44、g/L标准品溶液的吸光度值， 计算变异系数， 结果 见表 1。变异系数的计算方法 ： 变异系数 (CV) 测定结果的标准差与其平均值的百分比。 0120 表 1 标准品精密度试验结果 (CV ) 0121 0122 通过上述试验结果可以得出， 每批试剂盒各测定 10 次标准品变异系数在 4.6 -13.5之间， 符合精密度小于或等于 20的规定。 0123 2、 样本精密度和准确度试验 0124 a. 样品精密度试验 ： 0125 向不含 T-2 毒素的样品 ( 小麦或饲料 ) 中添加 T-2 毒素标准品， 使 T-2 毒素在小 麦中的浓度为 5ng/g、 在饲料中的浓度为 10ng/g， 每。

45、个样品设置 5 个重复。分别取三个不同 批次的试剂盒各三个， 分别计算变异系数。试验结果分别见表 2 和表 3。板内变异系数的计 算方法 ： 板内变异系数同一次测定的同一块板内某样本 ( 一般为中等水平 ) 重复测定次 数所得结果的变异系数。 0126 批内变异系数的计算方法 ： 批内变异系数同一次测定中各平行样本的变异系 数。 0127 批间变异系数的计算方法 ： 批间变异系数同一样本在不同批次测定结果的变异 系数， 取其平均值。 0128 表 2 小麦的精密度试验结果 ( 添加浓度 5ng/g) 0129 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A9/11 页 。

46、12 0130 表 3 饲料样品精密度试验 ( 添加浓度 10ng/g) 0131 0132 结果表明， 本试剂盒对以上 2 种添加样品， 板内变异系数小于 10， 批内变异系数 小于 15， 批间变异系数小于 20， 满足试剂盒精密度的规定。 0133 b. 样本回收率试验 0134 向不含 T-2 毒素的样品 ( 小麦或饲料 ) 中添加 T-2 毒素标准品， 得到如下四种样 品 ： T-2毒素在小麦中的浓度为5ng/g ； T-2毒素在小麦中的浓度为10ng/g ； T-2毒素在饲料 中的浓度为 5ng/g ； T-2 毒素在饲料中的浓度为 10ng/g ； 每个样品设置 5 个重复。分别。

47、取三 个不同批次的试剂盒各三个， 分别计算回收率。试验结果分别见表 4。回收率实测值 / 添 加值。 0135 表 4 试剂盒的样本回收率测定 0136 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A10/11 页 13 0137 从表中可看出， 小麦样品的添加回收率在 73 -113之间 ； 饲料样品的添加回收 率在 69 -100之间， 符合准确度的测定标准。 0138 3、 交叉反应率试验 0139 选择与 T-2 毒素类似结构的化合物， 测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得 到其 50抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。 0140 0141 结。

48、果见表 5。 0142 表 5 试剂盒的特异性 0143 名称 购买途径 交叉反应率 ( ) T-2 毒素 Sigma Aldrich 公司 产品目录号 ： 33947 100.0 HT-2 毒素 Sigma Aldrich 公司 产品目录号 ： 34136 8.0 HT-2 毒素 Sigma Aldrich 公司 产品目录号 ： T127 1.0 黄曲霉毒素 B1 Sigma Aldrich公司 产品目录号 ： 34029 1.0 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A11/11 页 14 呕吐毒素 (DON) Sigma Aldrich公司 产品目录号 ： 。

49、32943 1.0 0144 0145 4、 试剂盒的保存期 0146 试剂盒保存条件为 2-8， 经过 12 个月的测定， 试剂盒的最大吸光度值 ( 零标 准 )、 50抑制浓度、 T-2 毒素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程 中， 会有非正常保存条件出现， 将试剂盒在 37保存的条件下放置 8 天， 进行加速老化实 验， 结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。 考虑到试剂盒冷冻情况发生， 将试剂盒放 入-20冰箱冷冻8天， 测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。 从以上结果可得出试剂 盒可以在 2-8至少可以保存 12 个月以上。 0147 5、 试剂盒的最低检测限 0148 本试剂盒对小麦等谷物样品的最低检测限为 4ppb， 对饲料样品的最低检测限为 3.5ppb。 说 明 书 CN 102080066 A CN 102080069 A1/1 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102080066 A 。