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1、(10)申请公布号 CN 102604877 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102604877 A *CN102604877A* (21)申请号 201110024958.0 (22)申请日 2011.01.24 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/74(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市经济技术开发区第十三 大街 29 号 (72)发明人 王艳萍 王菁蕊 王金菊。
2、 (54) 发明名称 基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定 植特性的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种基于绿色荧光蛋白检测乳酸 菌在胃肠道中定植特性的方法。提供带有荧光蛋 白的乳酸菌表达载体(比如pMG36e-nisI-gfp)用 于使乳酸菌自身表达绿色荧光蛋白， 该载体含有 nisin 抗性基因 nisI 和绿色荧光蛋白基因 gfp。 将该载体转化乳酸菌， 转化子自身能够表达绿色 荧光蛋白。 将转化菌株饲喂昆明小鼠， 通过跟踪监 测荧光菌体在小鼠消化道各段的情况来准确分析 乳酸菌在动物消化道各段中的定植、 黏附状况。 本 发明提供的方法可应用于多种乳酸菌， 不受细菌 型别和种类的限制， 。
3、也不受细菌生长环境的限制， 可广泛应用于科研、 生产等各种领域， 有望成为乳 酸菌口服疫苗的表达载体。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种表达绿色荧光蛋白的乳酸菌 LAB-GFP， 其特征在于由以下方法构建 ： (1) 设计引物 N1 和 N2， 以 pLEB590 为模板， 扩增出编码 nisin 抗性基因 nisI 片断， 其 中 N1 序列为 ： N1 ： 5 -AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAA。
4、TGAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶切位点 ) ； N2 序列为 ： N2 ： 5 -CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 PstI 酶切位点 ) ； (2) 采用内切酶酶切， 比如将 nisI 片断纯化后， 用 XbaI 和 PstI 进行双酶切 ； (3) 经双酶切后的 nisI 片断与经相同酶切处理的 pMG36e 在 T4DNA 连接酶的作用下进 行连接， 连接液电转化至乳酸菌感受态 ； (4) 取转化菌液涂布在含红霉素和 nisin 的 GM17 平板上， 30培养 48 72h 后， 挑单 克。
5、隆至含红霉素和 nisin 的液体 GM17 培养基中培养， 提取质粒进行单酶切和 PCR 鉴定， 将 阳性重组子命名为 pMG36e-nisI ； (5) 设计引物 G1 和 G2， 以 pGFP 为模板， 扩增出编码绿色荧光蛋白基因 gfp 片断， 其中 G1 序列为 ： G1 ： 5 -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 SacI 酶切位点 ) ； G2 序列为 ： G2 ： 5 -GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶 切位点 ) ； (6) 将 gfp 片。
6、断纯化后， 用内切酶进行双酶切 ( 如 XbaI 和 SacI) ； (7) 经双酶切后的 gfp 片断与经相同酶切处理的 pMG36e-nisI 在 T4DNA 连接酶的作用 下进行连接， 连接液电转化至乳酸菌感受态 ； (8) 取转化菌液涂布在含红霉素和 nisin 的 GM17 平板上， 30培养 48 72h 后， 挑单 克隆至含红霉素和 nisin 的液体 GM17 培养基中培养， 提取质粒进行单酶切和 PCR 鉴定， 将 阳性重组子载体命名为 pMG36e-nisI-gfp， 阳性菌株命名为 LAB-GFP。 2. 如权利要求 1 所述表达绿色荧光蛋白的乳酸菌的制备方法， 其特征在。
7、于所述步骤 (1) 中， N1 引入 XbaI 位点， N2 引入 PstI 位点。 3. 如权利要求 1 所述表达绿色荧光蛋白的乳酸菌的制备方法， 其特征在于所述步骤 (5) 中， G1 引入 SacI 位点， G2 引入 XbaI 位点。 4.应用权利要求1所构建的能够表达绿色荧光蛋白的乳酸菌LAB-GFP分析其在胃肠道 中定植特性的方法， 其特征在于步骤如下 ： (1) 挑取 GM17 平板上构建成功的表达绿色荧光蛋白的乳酸菌 LAB-GFP 单个菌落于 GM17 液体培养基中， 30静置培养 48 72h， 此时浓度约为 109cfu/mL ； (2) 小鼠口服免疫前， 过夜禁食、 禁。
8、水， 每只小鼠饲喂 1mL LAB-GFP 乳酸菌菌液， 为实验 组， 同时对照组小鼠口服 1mL 0.85生理盐水 ； (3) 分别于接种后 2、 6、 18、 26、 42 和 72h 宰杀， 分别取胃、 空肠、 回肠和盲肠内容物 0.5g， 用无菌生理盐水倍比稀释后分三个稀释度接种于含抗生素平板上， 30培养 48 权 利 要 求 书 CN 102604877 A 2 2/2 页 3 72h， 计数菌落 ； (4) 取胃、 空肠、 回肠、 盲肠的内容物和肠壁做成连续的冰冻切片 (12m)， 在荧光显微 镜下观察重组菌的分布。 5. 应用权利要求 1 所构建的乳酸菌绿色荧光蛋白表达载体 p。
9、MG36e-nisI-gfp， 其特征 在于可应用于多种乳酸菌， 包括乳酸乳球菌、 植物乳杆菌、 德氏乳杆菌保加利亚亚种等。 权 利 要 求 书 CN 102604877 A 3 1/5 页 4 基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及分子生物学及微生物学领域， 尤其涉及一种基于绿色荧光蛋白检测乳 酸菌在胃肠道中定植特性的方法， 属于基础生命科学领域的前沿科学。 技术背景 ： 0002 乳酸菌 (LAB) 是一类能利用碳水化合物产生乳酸的革兰阳性菌的通称， 是乳品工 业发酵的重要菌类， 被公认安全的食品级微生物 (generally regard 。
10、as safe， GRAS)， 它包 括乳酸乳球菌、 乳酸杆菌、 双歧杆菌等至少 23 个属， 是人类一大益生菌， 可促进营养成分在 动物体内的分解和吸收、 缓解乳糖不耐症、 改善肠道环境、 拮抗病原微生物、 控制血清胆固 醇水平、 缓解高血压以及抗肿瘤作用等， 在食品发酵、 医药等与人类生活密切相关的领域有 着极其重要的作用。 0003 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP)是海洋中无脊椎动物体内(如 水母 ) 的一种天然蛋白， 相对分子质量为 27000， 由 238 个氨基酸组成。GFP 标记系统具有 标记基因小 ( 约 1kb)， 直接肉眼检测荧光。
11、、 对细胞安全、 稳定等优点， 已被成功用于微生物 定殖、 对宿主组织侵染、 微生物动态监测、 基因表达调控等研究。 0004 肠道微生态系统是动物体内最大、 最复杂的一个微生态系统， 其中存在着大量的 细菌， 它们之间相互拮抗、 互利共生， 共同维持肠道微生态系统的平衡。 近年来， 随着肠道微 生态学的深入研究， 人们发现益生乳酸菌的适当使用不仅可以维持动物体及人体的肠道微 生态平衡， 达到益生防病的效果， 还可以避免滥用抗生素引起的副作用。 0005 显然， 对肠道的粘附是乳酸菌发挥其众多生理功能的必要前提， 乳酸菌可通过脂 磷壁酸以及菌体分泌的表面蛋白对肠道粘膜细胞产生强大的粘附作用， 。
12、与肠道厌氧菌共同 形成生物屏障， 阻止致病菌的入侵。 肠道乳酸菌对机体免疫有多方面的调节作用， 能显著提 高机体的免疫功能， 尤其是在对病原菌的定植拮抗方面， 这使得对乳酸菌等益生菌的研究 成为当今生物技术的热门课题之一。 然而， 其在体内生物效应的准确机制方面的研究甚少， 这样对开发新型乳酸菌制品造成巨大障碍， 故深入研究乳酸菌粘附特性很有必要。 发明内容 ： 0006 本发明的目的在于解决现有技术所存在的上述问题， 提供一种基于绿色荧光蛋白 检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法。 0007 本发明的技术解决方案是 ： 一种表达绿色荧光蛋白的乳酸菌 LAB-GFP， 其特征在 于由下述方法构建。
13、 ： 0008 (1)设计引物N1和N2， 以pLEB590为模板， 扩增出编码nisin抗性基因nisI片断， 其中 N1 序列为 ： 0009 N1 ： 5 -AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶切位点 ) ； 0010 N2 序列为 ： 说 明 书 CN 102604877 A 4 2/5 页 5 0011 N2 ： 5 -CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 PstI 酶切位点 ) ； 0012 (2) 采用内切酶酶切， 比如将 nisI 片断纯。
14、化后， 用 XbaI 和 PstI 进行双酶切 ； 0013 (3) 经双酶切后的 nisI 片断与经相同酶切处理的 pMG36e 在 T4DNA 连接酶的作用 下进行连接， 连接液电转化至乳酸菌感受态 ； 0014 (4) 取转化菌液涂布在含红霉素和 nisin 的 GM17 平板上， 30培养 48 72h 后， 挑单克隆至含红霉素和 nisin 的液体 GM17 培养基中培养， 提取质粒进行单酶切和 PCR 鉴 定， 将阳性重组子命名为 pMG36e-nisI ； 0015 (5) 设计引物 G1 和 G2， 以 pGFP 为模板， 扩增出编码绿色荧光蛋白基因 gfp 片断， 其中 G1。
15、 序列为 ： 0016 G1 ： 5 -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 SacI 酶切位点 ) ； 0017 G2 序列为 ： 0018 G2 ： 5 -GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶切位点 ) ； 0019 (6) 将 gfp 片断纯化后， 用内切酶进行双酶切 ( 如 XbaI 和 SacI) ； 0020 (7) 经双酶切后的 gfp 片断与经相同酶切处理的 pMG36e-nisI 在 T4DNA 连接酶的 作用下进行连接， 连接液电转化至乳酸菌感受。
16、态 ； 0021 (8) 取转化菌液涂布在含红霉素和 nisin 的 GM17 平板上， 30培养 48 72h 后， 挑单克隆至含红霉素和 nisin 的液体 GM17 培养基中培养， 提取质粒进行单酶切和 PCR 鉴 定， 将阳性重组子载体命名为 pMG36e-nisI-gfp， 阳性菌株命名为 LAB-GFP。 0022 其中， 所述步骤 (1) 中， N1 引入 XbaI 位点， N2 引入 PstI 位点。 0023 所述步骤 (5) 中， G1 引入 SacI 位点， G2 引入 XbaI 位点。 0024 应用上述所构建的能够表达绿色荧光蛋白的乳酸菌 LAB-GFP 分析其在胃肠。
17、道中 定植特性的方法， 步骤如下 ： 0025 (1)挑取GM17平板上构建成功的表达绿色荧光蛋白的乳酸菌LAB-GFP单个菌落于 GM17 液体培养基中， 30静置培养 48 72h， 此时浓度约为 109cfu/mL ； 0026 (2) 小鼠口服免疫前， 过夜禁食、 禁水， 每只小鼠饲喂 1mLLAB-GFP 乳酸菌菌液， 为 实验组， 同时对照组小鼠口服 1mL 0.85生理盐水 ； 0027 (3) 分别于接种后 2、 6、 18、 26、 42 和 72h 宰杀， 分别取胃、 空肠、 回肠和盲肠内容 物 0.5g， 用无菌生理盐水倍比稀释后分三个稀释度接种于含抗生素平板上， 30培。
18、养 48 72h， 计数菌落 ； 0028 (4) 取胃、 空肠、 回肠、 盲肠的内容物和肠壁做成连续的冰冻切片 (12m)， 在荧光 显微镜下观察重组菌的分布。 0029 本发明所构建的乳酸菌绿色荧光蛋白表达载体 pMG36e-nisI-gfp， 其特征在于可 应用于多种乳酸菌， 包括乳酸乳球菌、 植物乳杆菌、 德氏乳杆菌保加利亚亚种等。 0030 本发明的优点和积极效果是 ： 0031 本发明提供一种基于绿色荧光蛋白 (GFP) 检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方 法， 将转化乳酸菌株饲喂小鼠， 通过跟踪监测荧光菌体在小鼠胃肠道各段的情况， 以准确地 说 明 书 CN 102604877 A。
19、 5 3/5 页 6 确定该乳酸菌在动物消化道各段的定植、 黏附状况。 本发明可应用于多种乳酸菌， 不受细菌 的型别和种类限制， 大大扩展了其应用领域， 操作简单、 形象生动， 便于掌握乳酸菌对肠道 定植或机体清除病原菌的动态变化， 有利于弄清乳酸菌诱导粘膜免疫反应的机制。本发明 提供的能够表达绿色荧光蛋白的乳酸菌载体有望成为非常具有吸引力的口服基因工程疫 苗传送载体。 附图说明 ： 0032 图 1 是本发明 PCR 所扩增得到的 nisin 抗性基因 nisI 片断电泳图。 0033 图 2 是本发明 PCR 所扩增得到的绿色荧光蛋白基因 gfp 片断电泳图。 0034 图 3 是本发明所。
20、构建能够表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的乳球菌菌体荧光显微照片。 0035 图4是荧光菌体在胃肠道各段组织中的菌数代谢情况。 其中， ()代表胃 ； () 代表空肠 ； ( ) 代表回肠 ； (X) 代表盲肠。 0036 图 5(A-F) 是荧光菌体在胃肠道组织切片的定植照片。 0037 图 5(G、 H) 是对照组小鼠胃肠道组织切片照片。 具体实施方式 ： 0038 1.nisin 抗性基因 nisI 片段的获得 0039 根据 Genbank 中报道的 nisI 的碱基序列 ( 登录号 ： X76884)， 结合质粒 pMG36e 的 酶切位点， 设计特异性引物N1和N2， 并分别引入Xb。
21、aI和PstI酶切位点， 以质粒pLEB590为 模板， 进行 PCR 扩增， 引物序列如下 ： 0040 N1 ： 5 -AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶切位点 ) ； 0041 N2 ： 5 -CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 PstI 酶切位点 )。 0042 PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 最后， 72延伸 10min。 0043 PCR 结。
22、果得到一条单一条带， 大小为 780bp， 与预期结果一致 ( 图 1)。 0044 2. 重组质粒 pMG36e-nisI 的构建 0045 将 PCR 产物纯化后， 使用 XbaI 和 PstI 对其进行双酶切， 然后与经相同酶切的 pMG36e 在 T4DNA 连接酶的作用下进行连接。将连接液电转化至乳酸菌感受态细胞中， 然后 涂布在含有红霉素 ( 终浓度为 2.5g/ml) 和 nisin( 终浓度为 40IU/ml) 的 GM17 平板培养 基上， 30培养 72h 左右， 挑取单克隆到含有红霉素 ( 终浓度为 2.5g/ml) 和 nisin( 终浓 度为 40IU/ml) 的 G。
23、M17 液体培养基中， 30培养 48 72h。提取质粒进行单酶切和 PCR 鉴 定， 将阳性重组子命名为 pMG36e-nisI。 0046 3. 绿色荧光蛋白基因 gfp 片段的获得 0047 根 据 Genbank 中 报 道 的 gfp 的 碱 基 序 列 ( 登 录 号 ： AF049064.1)， 结 合 质 粒 pMG36e-nisI 的酶切位点， 设计特异性引物 G1 和 G2， 并分别引入 SacI 和 XbaI 酶切位点， 以 质粒 pGFP 为模板， 进行 PCR 扩增， 引物序列如下 ： 0048 G1 ： 5 -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT。
24、-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 说 明 书 CN 102604877 A 6 4/5 页 7 SacI 酶切位点 ) ； 0049 G2 ： 5 -GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3 并附有内切酶位点 ( 比如下划线为 XbaI 酶切位点 )。 0050 PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 58退火 30s， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 最后， 72延伸 10min。 0051 PCR 结果得到一条单一条带， 大小为 750bp， 与预期结果一致 ( 图 2)。 0052 4. 重组质粒 pMG36e-nisI-gf。
25、p 的构建 0053 将 PCR 产物纯化后， 使用 SacI 和 XbaI 对其进行双酶切， 然后与经相同酶切的 pMG36e-nisI在T4DNA连接酶的作用下进行连接。 将连接液电转化至乳球菌感受态细胞中， 然后涂布在含有红霉素 ( 终浓度为 2.5g/ml) 和 nisin( 终浓度为 40IU/ml) 的 GM17 平板 培养基上， 30培养 48 72h 左右， 挑取单克隆到含有红霉素 ( 终浓度为 2.5g/ml) 和 nisin( 终浓度为 40IU/ml) 的 GM17 液体培养基中， 30培养 48 72h。提取质粒进行单酶 切和 PCR 鉴定， 将阳性重组子命名为 pMG。
26、36e-nisI-gfp， 阳性菌株命名为 LAB-GFP。 0054 5. 绿色荧光蛋白表达的观察 0055 液体培养基中的乳酸菌离心后收集沉淀， 用盐溶液 (0.85 NaCl) 润洗， 然后涂抹 在载波片上， 使用 Nikon ECLIPSE 90i 荧光显微镜进行荧光观察结合 MOTDX 35 进行拍照， 结果发现， 在荧光显微镜下可清晰看到乳球菌的形态， 并且有绿色荧光蛋白的表达 ( 图 3)。 0056 6. 表达绿色荧光蛋白重组菌 LAB-GFP 在胃肠道中定植的动物实验 0057 挑取 GM17 平板上构建成功的表达绿色荧光蛋白的乳酸菌 LAB-GFP 单个菌落于 GM17液体。
27、培养基中， 30静置培养4872h， 此时浓度约为109cfu/mL ； 小鼠口服免疫前， 过 夜禁食、 禁水， 每只小鼠饲喂 1mL LAB-GFP 乳酸菌菌液， 作为实验组 ； 同时对照组小鼠口服 1mL 0.85生理盐水。 0058 分别于接种后 2、 6、 18、 26、 42 和 72h 宰杀， 分别取胃、 空肠、 回肠和盲肠内容物 0.5g， 用无菌生理盐水倍比稀释后接种于含红霉素 ( 终浓度为 2.5g/ml) 和 nisin( 终浓 度为 40IU/ml) 的 GM17 平板培养基上， 30培养 48 72h， 计数菌落。 0059 结果表明， 在口服菌液 6h 后， 在所有取。
28、样的肠段内容物中均清晰地发现荧光乳酸 菌， 并在 42h 达到最大浓度， 表明此时乳酸菌已能在胃肠道中定植、 繁殖， 之后虽有所下降， 但口服三天后菌量仍然保持在 104cfu/g 左右， 结果如表 1、 图 4 所示。 0060 表 1 不同胃肠段中表达绿色荧光蛋白乳酸菌 LAB-GFP 的数量 单位 ： Log(cfu/g) 0061 0062 取胃、 空肠、 回肠、 盲肠的内容物和肠壁做成连续的冰冻切片 (12m)， 在荧光显微 镜下观察重组菌的分布。结果表明， 在荧光显微镜下， 可清晰看到 LAB-GFP 主要存在于肠道 的内容物中， 少数细菌黏附在各肠段的黏膜上， 个别细菌存在于上皮。
29、细胞间， 如图 5(A-F)。 说 明 书 CN 102604877 A 7 5/5 页 8 而对照组中无任何荧光菌体存在， 如图 5(G、 H)。 0063 7. 结论 0064 借助于绿色荧光蛋白 GFP 的高效表达， 我们首次清晰观察到乳酸菌在小鼠胃肠道 中的准确分布。研究乳酸菌在胃肠道中的定植特性以及 GFP 在乳酸菌中的表达并成功运用 于动物实验， 将有助于我们更好地理解乳酸菌在机体中的定植， 与肠上皮细胞间的相互关 系以及如何引起免疫应答等一系列问题， 更将促进有关在细胞水平上的微生物与宿主细胞 间的相互作用， 微生物对肠道固有菌群的影响等一系列实验。本发明所提供的基于绿色荧 光蛋。
30、白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法， 操作简单， 清晰直观， 在科研、 生产等领域 具有广阔的应用前景。 0065 应用 ： 0066 本发明所构建的乳酸菌绿色荧光蛋白表达载体 pMG36e-nisI-gfp 可转化多种乳 酸菌， 其中包括乳酸乳球菌、 植物乳杆菌、 德氏乳杆菌保加利亚亚种等， 转化菌株在普通生 长条件下均能够表达绿色荧光蛋白。 本发明所提供的方法可用于研究乳酸菌在胃肠道中的 定植特性、 代谢状况以及与肠道相互作用机理等， 操作简单， 清晰直观， 形象生动， 可广泛应 用于科研、 生产等各种领域， 为研究乳酸菌口服疫苗提供了很好的基础。 说 明 书 CN 102604877 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102604877 A 9 2/2 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102604877 A 10 。