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1、(10)申请公布号 CN 102586192 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586192 A *CN102586192A* (21)申请号 201210017791.X (22)申请日 2012.01.19 CCTCC NO ： C2011117 2011.12.05 C12N 5/20(2006.01) C12N 15/06(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路 169 号 (72)发明人 张惠中 龙敏 董轲 王希 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 (。
2、54) 发明名称 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细 胞 (57) 摘要 本发明公开了稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗 体的杂交瘤细胞， 该杂交瘤细胞保藏于中国典型 培养物保藏中心， 保藏号为 ： CCTCC C2011117。所 述的稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细 胞， 所分泌的单克隆抗体能够识别细胞内所表达 的AEG-1分子， 尤其是对肿瘤细胞所表达的AEG-1 分子的识别和结合。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明。
3、书 4 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞， 其特征在于， 该杂交瘤细胞保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 ： CCTCC C2011117。 2.如权利要求1所述的稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞， 其特征在于， 所 述的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够识别细胞所表达的 AEG-1 分子。 3.如权利要求2所述的稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞， 其特征在于， 所 述的细胞为肿瘤细胞。 4.如权利要求3所述的稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞， 其特征在于， 所 述的肿瘤细胞为恶性肿瘤细胞。 5.。
4、如权利要求4所述的稳定分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞， 其特征在于， 所 述的恶性肿瘤细胞为宫颈癌细胞或肺癌细胞。 6. 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ： 首先将 AEG-1 胞外段基因克隆于表达载体 pGSTag 构建 pGSTag-AEG-1 载体， 将重组表 达载体 pGSTag-AEG-1 转化大肠杆菌， 利用 IPTG 诱导目的蛋白表达， 超声裂菌， 纯化得到具 有抗原性的 AEG-1 胞外段蛋白 ； 以具有抗原性的 AEG-1 胞外段蛋白作为免疫原免疫小鼠， 取血清效价大于 105的小鼠 脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞。
5、 SP2/0 用 50 PEG 进行融合， 用含有 1HAT 和 20小牛血清的 RPMI-1640 培养， 出现融合细胞后收集上清 ； 以纯化的 AEG-1 胞外段蛋白包被 96 孔板， 通过 ELISA 方法进行筛选， 保留 AEG-1 阳性 的杂交瘤细胞， 在通过有限稀释克隆方法获得稳定分泌抗 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞 株。 权 利 要 求 书 CN 102586192 A 2 1/4 页 3 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞 技术领域 0001 本发明属于杂交瘤细胞技术领域， 涉及一种稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂 交瘤细胞。 背景技术 0002 A。
6、EG-1 又名 LYRIC、 Metadherin(MTDH)， 2002 年该基因在 HIV、 TNF 诱导的胎儿星形 胶质细胞上调基因中被克隆。人 AEG-1 为单次跨膜蛋白， 分子量 64kD， pI 为 9.3， 基因序列 中含有 12 个外显子和 11 个内含子， 染色体定位于 8q22。AEG-1 表达蛋白由 582 个富含赖 氨酸的氨基酸组成， 含有三个核定位肽 (NSL)79-91aa、 432-451aa、 561-580aa， 一个跨膜结 构域 (TMD)51-72aa， 一个肺归巢结构域 (LHD)381-443aa 和一个 N-terminal LXXLL motif 。
7、基序。 0003 AEG-1 与肿瘤发生、 发展以及预后密切相关。应用细胞系表达分析显示， AEG-1 在 乳腺癌、 前列腺癌、 食管癌、 肝癌、 黑色素瘤、 胶质瘤及神经细胞瘤中表达明显高于其正常对 照组织。应用肝组织标本检测结果显示， 9 例正常肝组织几乎检测不到 AEG-1 表达， 而 109 例肝癌组织中仅有 7 例检测不到表达， 其余 102 例不同分期、 不同分级肝癌组织中 AEG-1 表 达水平与其分期和分级呈正相关性。 AEG-1过表达还可增强乳腺癌细胞和293T细胞的肺部 转移能力， 增加乳腺癌细胞与肺的内皮细胞粘附性， 抑制 AEG-1 基因的表达则会逆转肿瘤 细胞与内皮细。
8、胞的粘附作用进而抑制其转移能力。下调具有高度肺转移能力的 LM2 乳腺癌 细胞系中 AEG-1 表达， 可明显抑制肿瘤细胞肺转移。目前虽然发现了不少癌基因可作为肿 瘤生物治疗的靶基因， 但临床效果均不理想， 有待进一步研发临床效果更好的恶性肿瘤治 疗新靶点， 而 AEG-1 基因及其表达产物有望成为一个恶性肿瘤预后评估及靶向治疗新的切 入点。 0004 AEG-1参与了多种信号转导通路。 Ha-ras及PI3K/Akt通路 ： 荧光素酶活性分析 显示， 永生化细胞THV中过表达Ha-ras可使MTDH启动子活性上调4倍。 乳腺癌细胞中原癌 基因 Ha-ras 通过激活 PI3K/Akt 通路，。
9、 促进转录调控因子 c-Myc 与 MTDH 启动子 -356/-302 区域的E-box元件结合， 从而启动AEG-1基因转录。 NF-B通路 ： 第一个被证实受AEG-1 上调的通路是 NF-kB 通路， 在 Hela 细胞和恶性胶质瘤细胞中， TNF-a 可诱导 AEG-1 表达， 后 者转位到核内与 NF-B 的 p65 亚单位结合并上调 NF-kB 基因的表达。 MEK/ERK 通路 ： 在 进一步对多种肿瘤的研究中发现， MEK/ERK下游的癌基因转录因子AP-1受到AEG-1的激活。 抑制 MEK/ERK 或 p38MAPK 通路可减弱恶性肿瘤细胞的侵袭能力。恶性肿瘤细胞内信号转。
10、导 通路的研究虽然取得了巨大的进展， 但恶性肿瘤的发生、 发展以及预后是一个多因素、 多环 节、 多阶段的复杂演变过程， 因此仍需进一步探讨并明确信号转导通路中各分子的作用， 为 恶性肿瘤的预防、 治疗及早期诊断奠定基础。 发明内容 0005 本发明解决的问题在于提供稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞， 可用 说 明 书 CN 102586192 A 3 2/4 页 4 于研究 AEG-1 在恶性肿瘤细胞中的功能以及信号转导通路中的作用， 并用于恶性肿瘤的诊 断、 预后判断和治疗研究。 0006 本发明是通过以下技术方案来实现 ： 0007 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的。
11、杂交瘤细胞， 该杂交瘤细胞保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏号为 ： CCTCC C2011117。 0008 所述的稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞， 所分泌的单克隆抗体能够 识别细胞内所表达的 AEG-1 分子。 0009 所述的细胞为肿瘤细胞。 0010 所述的肿瘤细胞为恶性肿瘤细胞。 0011 所述的恶性肿瘤细胞为宫颈癌细胞或肺癌细胞。 0012 稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法， 包括以下步骤 ： 0013 首先将 AEG-1 胞外段基因克隆于表达载体 pGSTag 构建 pGSTag-AEG-1 载体， 将重 组表达载体 pGSTag-。
12、AEG-1 转化大肠杆菌， 利用 IPTG 诱导目的蛋白表达， 超声裂菌， 纯化得 到具有抗原性的 AEG-1 胞外段蛋白 ； 0014 以具有抗原性的 AEG-1 胞外段蛋白作为免疫原免疫小鼠， 取血清效价大于 105的 小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 用 50 PEG 进行融合， 用含有 1HAT 和 20小牛血 清的 RPMI-1640 培养， 出现融合细胞后收集上清 ； 0015 以纯化的 AEG-1 胞外段蛋白包被 96 孔板， 通过 ELISA 方法进行筛选， 保留 AEG-1 阳性的杂交瘤细胞， 在通过有限稀释克隆方法获得稳定分泌抗 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。
13、。 0016 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0017 本发明构建了能稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞， 所分泌的单克隆 抗体能够特异性的识别 AEG-1 分子， Western Blot 法证明此腹水中的抗体能够识别肿瘤细 胞中 AEG-1 抗原， 利用免疫组织化学方法证明此抗体可以识别恶性肿瘤细胞中的 AEG-1 蛋 白。此株杂交瘤细胞分泌的抗 AEG-1 单克隆抗体为进一步研究 AEG-1 在肿瘤细胞中信号转 导通路以及其在肿瘤发生、 发展中的作用研究奠定了基础， 同时也为恶性肿瘤诊断、 治疗及 预后判断奠定了物质基础。 附图说明 0018 图 1 为。
14、利用 western blot 法检测纯化的 AEG-1 胞外段蛋白的抗原性 ； 0019 图 2 为杂交瘤细胞 1E3 染色体分析 ； 0020 图 3 为 ELISA 方法检测腹水中抗 AEG-1 单克隆抗体的效价 ； 0021 图 4 为利用 western blot 法检测杂交瘤细胞所分泌的单抗与肿瘤细胞裂解物的 反应结果图 ； 0022 图 5 为利用免疫组织化学法检测杂交瘤细胞所分泌的单抗与肺癌细胞 A549 中表 达的 AEG-1 蛋白的结合结果图 ； 0023 图 6 为杂交瘤细胞 1E3 分泌的抗 AEG-1 抗体亚型鉴定结果。 0024 保藏说明 0025 本发明获得的稳定。
15、分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞进行了以下保藏 ： 说 明 书 CN 102586192 A 4 3/4 页 5 0026 保藏单位 ： 中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) ； 地址 ： 武汉市武昌珞珈山 ； 保 藏时间 ： 2011 年 12 月 5 日 ； 保藏号为 ： CCTCC C2011117， 培养物名称为小鼠杂交瘤细胞 AEG-1/1E3。 具体实施方式 0027 本发明通过以表达纯化的 AEG-1 蛋白为免疫原， 应用杂交瘤细胞技术， 得到一株 能稳定分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体 能特异性的识别AEG-1。 。
16、下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是对本 发明的解释而不是限定。 0028 1. 抗原的制备 ： 0029 利用分子克隆方法将 AEG-1 胞外段基因克隆于表达载体 pGSTag 的 NcoI/Sac I 之间， 构建 pGSTag-AEG-1 载体， 将重组表达载体 pGSTag-AEG-1 转化大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS， 利用IPTG诱导目的蛋白表达， 超声裂菌， 利用Glutathione Sepharose 4B beads纯 化目的蛋白， 以 Western Blot 方法进行所表达蛋白的鉴定。结果显示， 纯化的 AEG-1 胞外 段蛋白 ( 分子。
17、量约 46KD) 与商品化的抗 AEG-1 多克隆抗体 (Proteintech 公司， Cat.No. ： 13860-1-AP) 能够发生免疫反应， 如图 1 所示， 在 46KD 大小有明显的阳性条带出现， 结果表 明纯化的 AEG-1 胞外段蛋白具有抗原性。 0030 2. 免疫 ： 0031 第一次免疫 ： 取 8 周龄雌性 BALB/C 小鼠， 于背部皮下注射与等体积弗氏完全佐剂 混合的 25g 纯化的 AEG-1 胞外段蛋白。 0032 第二次免疫 ： 3-4 周后用等体积弗氏不完全佐剂加 25g 纯化的 AEG-1 胞外段蛋 白重复免疫一次。免疫 20 天后通过间接 ELISA。
18、 方法监测小鼠血清抗体效价。 0033 第三次免疫 ： 间隔 4 周后， 融合前 72h， 腹腔注射 50g 纯化的 AEG-1 胞外段蛋白 加强免疫。 0034 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂均使用 Sigma 公司商品化产品。 0035 3. 杂交瘤细胞株的制备和筛选 0036 按单克隆抗体制备方法 ( 细胞和分子免疫学实验技术第一版， P9-P17)， 经腹腔注 射抗原再加强免疫后， 3 天后处死动物取脾进行细胞融合， 收集免疫小鼠脾细胞并计数。 0037 取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 计数， 同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤 细胞与脾细胞按 1 10 比例混合进行细胞融合 ( 。
19、用 50 PEG)。融合后细胞悬液加入含 有饲养细胞 ( 正常 Balb/c 小鼠腹腔巨噬细胞 ) 的 96 孔板， 以含 1 HAT、 20小牛血清的 RPMI-1640 筛选培养， 37、 5 CO2孵箱培养。 0038 当克隆长至 1/3 板底时， 收集培养上清。以纯化的 AEG-1 抗原及 GST 抗原分别包 被ELISA板， 间接ELISA法检测培养上清中抗AEG-1抗体， 筛选分泌抗人AEG-1抗体的克隆 ； 对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化， 直至获得能够稳定分泌抗体的杂交 瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)， 最终获得一株可稳定分泌抗AEG-1单克隆抗体的细 胞株。
20、， 标记为 1E3， 扩大培养。 0039 4. 杂交瘤细胞染色体分析 0040 筛选出的分泌抗人 AEG-1 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1E3， 20 1640 扩大培养至 说 明 书 CN 102586192 A 5 4/4 页 6 对数生长期， 添加0.4g/ml秋水仙素， 37培养3h ； 0.075M KC低渗处理后固定细胞， 10 Giemsa 染液染色， 100 倍油镜下观察。观察结果如图 2 所示， 1E3 细胞染色体平均数目为 92 条， 可见明显的特征性中部着丝粒染色体。 0041 5. 腹水的制备和亚型测定 0042 应用此株杂交瘤细胞株以 5107/ 只腹腔注射预先用液。
21、体石蜡处理的 8-10 周龄 BALB/C 雌性小鼠， 10-14 天后采集腹水并纯化抗体， 以纯化的 AEG-1 抗原包被 96 孔板， 利用 ELISA 方法检测腹水， 以吸光度 A 为纵坐标， 以稀释倍数为横坐标， 绘制曲线图。如图 3 所 示， 腹水中有抗 AEG-1 的单克隆抗体产生， 能与纯化的 AEG-1 胞外段蛋白发生免疫反应， 其 效价为 110-7， 结果表明 ： 所筛选的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够与 AEG-1 特异性 结合。 0043 以宫颈癌 HeLa 细胞和肺癌 A549 细胞的全细胞裂解蛋白 (25ug) 为抗原， Western Blot方法检测此腹水中的。
22、抗体与肿瘤细胞中的AEG-1蛋白的结合， 结果如图4所示， 可以看 到在A549、 Hela细胞中均有80kd的目的条带出现， 说明所分泌的抗体能够识别肿瘤细胞中 的 AEG-1 抗原分子， 并发生了免疫结合。 0044 肺癌细胞 A549 制备细胞爬片， 以腹水作为检测抗体， 山羊抗小鼠 IgG-HRP 为第二 抗体， 免疫组织化学法检测腹水中单克隆抗体与肿瘤细胞 AEG-1 的结合， 结果如图 5 所示， 在 A549 细胞中 ( 主要在胞膜和胞浆 )， 可见明显的棕色阳性反应产物， 结果表明 ： 所分泌的 单克隆抗体与 AEG-1 分子识别并生了免疫结合。 0045 利用AbD sero。
23、tec公司的MOUSE MONOCLONAL ANTIBODYISOTYPING TEST KIT试纸 条方法确定细胞株1E3分泌的抗体亚型， 检测结果如图6所示， 结果表明所分泌的抗体的亚 型为 IgG1， 轻链为 链。 0046 以上检测结果表明所筛选的杂交瘤细胞株能稳定的分泌抗 AEG-1 的单克隆抗体， 将该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC C2011117。 0047 杂交瘤细胞 CCTCC C2011117 分泌的抗 AEG-1 单克隆抗体为进一步研究 AEG-1 在 肿瘤细胞中信号转导通路以及其在肿瘤发生、 发展中的作用研究奠定了基础， 同时也为恶 性肿瘤诊断、 治疗及预后判断奠定了物质基础。 0048 鉴于该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异识别肿瘤细胞内所表达的 AEG-1 蛋白分子并且产生免疫反应。以此为基础， 可以对肿瘤组织、 细胞内的 AEG-1 进行研究、 检 测， 从而可以预防、 诊断、 治疗相关肿瘤。 说 明 书 CN 102586192 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586192 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102586192 A 8 3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102586192 A 9 。