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1、(10)申请公布号 CN 102533687 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533687 A *CN102533687A* (21)申请号 201210042595.8 (22)申请日 2012.02.24 C12N 9/08(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 山东博奥克生物科技有限公司 地址 252000 山东省聊城市经济开发区聊牛 路东首路南 (72)发明人 刘钦松 李小刚 (54) 发明名称 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧 化酶的方法 (57) 摘要 本发明是一种大肠杆菌高效表达重组人源超 氧化物歧化酶的方法， 利。
2、用大肠杆菌作为菌种， 以酵母粉、 蛋白胨、 葡萄糖、 KH2PO4、 (NH4)2HPO4、 MgSO47H2O、 柠檬酸、 柠檬酸铁为原料， 进行液体 深层次发酵生产人源超氧化物歧化酶， 本发明的 有益效果在于通过改进发酵方式， 采用二级种子 培养及喷雾干燥制得超氧化物歧化酶酶粉， 简化 了发酵工艺， 节省了设备和时间， 实现了超氧化物 歧化酶的高产率发酵， 使本发明可以适用于大规 模工业生产， 大大降低了超氧化物歧化酶的生产 成本， 具有很好的社会经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 。
3、1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法， 利用大肠杆菌作为菌种， 以酵母粉、 蛋白胨、 葡萄糖、 KH2PO4、 (NH4)2HPO4、 MgSO47H2O、 柠檬酸、 柠檬酸铁为原料， 进行 液体深层次发酵生产人源超氧化物歧化酶， 其特征在于通过改进发酵方式及原料， 实现了 人源超氧化物歧化酶的高产率发酵， 大大降低人源超氧化物歧化酶的生产成本， 具有很好 的社会经济效益。 2. 根据权利要求 1 所述的， 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法， 其特征在于 ： 将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在 3L 三。
4、角瓶 600mL 一级种子培养基中(pH6.87.2 ； 灭菌条件 ： 121灭菌30min)， 250rpm、 371培养12 14 小时备用。 3. 根据权利要求 1 所述的， 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法， 其种子培养液的特征在于 ： 将工业级的酵母粉 480g， 蛋白胨 900g， 1M 磷酸缓冲液 (pH 6.8)6L， 生物素 24mg， 葡萄糖 600g 分别投入 100L 种子罐内， 用自来水定容到 60L ； 搅拌均 匀 ； 然后用蒸汽直接灭菌， 115度保温30分钟， 再降温至37， 接入600mL一级种子菌液 ； 在 风量 0.6 1， 温度 371，。
5、 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养 6 小时， 得扩大培养的 大肠杆菌二级种子液。 4. 根据权利要求 1 所述的， 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方 法， 其特征在于 ： 将工业级的葡萄糖 5kg、 6.65kg 的 KH2PO4、 2kg 的 (NH4)2HPO4、 6kg 的 MgSO47H2O、 柠檬酸 1.5kg、 柠檬酸铁 (III)0.05kg 分别投入 1000L 发酵罐内， 用自来水定 容到 500L， 搅拌均匀 ； 然后用蒸汽直接灭菌， 115 度保温 30 分钟， 再降温至 37 度， 灭菌后由 28 NH4OH 调整 pH 到 7.0， 再添。
6、加 0.8L 的微量元素液 ； 100g 的 CuSO45H2O、 50g 的 ZnSO4， 接入 60L 一级种子培养液 ； 在风量 1 0.6 0.8、 温度 371、 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养， 一段时间以后补葡萄糖， 到 OD600达到 40 左右开始用 IPTG 诱导， 诱导 2 小时 后， 向发酵罐中流加微量元素、 CuSO45H2O 和 ZnSO4， 共诱导 10 小时， 得到发酵液， 利用管式 离心机将发酵液进行固液分离， 得到菌体和发酵液清液， 经超声破碎后测得抗氧化歧化酶 的酶活 21723U/L。 5. 根据权利要求 4 所述的一种大肠杆菌高效表达重。
7、组人源超氧化物歧化酶的方法， 其特征在于 ： 2.5mg/L 的微量元素为 KI、 1.5mg/L 的 MnCl24H2O、 1.5mg/L 的 CuCl22H2O、 3.0mg/L 的 H3BO3、 2.5mg/L 的 Na2MoO4 2H2O、 1.3mg/L 的 Zn(CH3COO)2 2H2O、 盐酸硫铵 4.5mg/ L。 权 利 要 求 书 CN 102533687 A 2 1/3 页 3 一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法 技术领域 0001 本发明提供了一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法， 属于发酵 工程技术领域。 背景技术 0002 超氧化物歧化酶。
8、 (SOD) 是具有专一清除生物体内的超氧离子， 平衡机体的氧自由 基， 保护人体细胞免受有毒化学物质、 幅射、 紫外等环境因素破坏， SOD 酶在抗衰老， 抗辐射 性， 消炎， 抑制肿瘤和癌症， 以及自身免疫疾病的治疗方面有重要的作用 ； 目前 SOD 酶已作 为一种保健医药产品广泛应用于食品饮料、 化妆品等行业， 具有非常广阔的市场。 目前国内 的 SOD 大多是从动物血液中提取的， 由于含有各种难以消除的病毒及外源污染， 欧盟已于 1999 年颁布法令， 禁止从动物血液中提取的 SOD 用于人类 ； 而从植物中提取 SOD 的方法往 往受到原材料的制约， 且成本较高 ； 因此开发其他更安。
9、全、 更经济的提取或合成方法取代传 统 SOD 生产方法将是一个趋势。利用工程微生物制备 SOD 的工艺具有工艺简单， 生产成本 低， 对环境友好等特点， 已成为 SOD 产业化的发展方向 ； 目前日本、 加拿大等国家也开始研 究采用基因重组等新的生物工程技术来合成 SOD ； 国内已有企业利用生物工程技术来生产 SOD， 但产量远不能满足日益增长的市场需求， 随着人们对超氧化物歧化酶 (SOD) 逐渐认识 并应用， 超氧化物歧化酶市场具备较好的机遇。 发明内容 0003 本发明是为了提供了一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方 法。 0004 本发明的技术方案是这样实现的 ： 0。
10、005 本发明为一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方法 ； 利用大肠 杆菌作为菌种， 以酵母粉、 蛋白胨、 葡萄糖、 KHPO4、 (NH4)2HPO4、 MgSO47H2O、 柠檬酸、 柠檬酸铁 为原料， 进行液体深层次发酵生产超氧化物歧化酶， 发酵液经管式离心机进行固液分离， 得 到菌体及发酵液上清液 ； 所得到的菌体再经过均质机破碎， 热处理， 离心收集上清液， 超滤， 微滤和喷雾干燥得到粉状超氧化物歧化酶产品 ； 具体包括下述步骤 ： 0006 1、 菌种及种子液扩大培养 0007 1.1 本发明所用菌种为大肠杆菌 BL21(hSOD-pET-28a) 重组菌株。 000。
11、8 1.2将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在3L三角瓶600mL 一级种子培养基中 (pH 6.8 7.2 ； 灭菌条件 ： 121灭菌 30min) ； 250rpm、 371培养 12 14 小时备用。 0009 1.3 用 100L 种子罐对菌种进行扩大培养 0010 将工业级的酵母粉480g， 蛋白胨900g， 1M磷酸缓冲液(pH6.8)6L， 生物素24mg， 葡萄糖 600g 分别投入 100L 种子罐内， 用自来水定容到 60L ； 搅拌均匀 ； 然后用蒸汽直接灭 菌， 115 度保温 30 分钟， 再降温至 37 度， 接入按步骤 1.2 所得的 600mL。
12、 一级种子菌液 ； 在通 说 明 书 CN 102533687 A 3 2/3 页 4 气量 0.6 1 ； 温度 371； 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养 6h， 得扩大培养的大肠 杆菌二级种子液。 0011 2、 用 1000L 发酵罐发酵生产超氧化物歧化酶 0012 将工业级的葡萄糖5kg、 6.65kg的KH2PO4、 2kg的(NH4)2HPO4、 6kg的MgSO4 7H2O、 柠 檬酸 1.5kg、 柠檬酸铁 (III)0.05kg 分别投入 1000L 发酵罐内， 用自来水定容到 500L， 搅拌 均匀 ； 然后用蒸汽直接灭菌， 115 度保温 30 分钟， 再。
13、降温至 37 度， 灭菌后由 28 NH4OH 调整 pH 到 7.0， 再添加 0.8L 的微量元素液 (2.5mg/L 的 KI、 1.5mg/L 的 MnCl24H2O、 1.5mg/L 的 CuCl22H2O、 3.0mg/L 的 H3BO3、2.5mg/L 的 Na2MoO42H2O、 1.3mg/L 的 Zn(CH3COO)22H2O 盐酸 硫铵4.5mg/L) ； 100g的CuSO4 5H2O、 50g ZnSO4接入60L一级种子培养液 ； 在风量10.6 0.8、 温度 371、 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养， 一段时间以后补葡萄糖， 到 OD600 达到。
14、 40 左右开始用 IPTG 诱导， 诱导 2 小时后， 向发酵罐中流加微量元素 CuSO45H2O 和 ZnSO4， 共诱导 10 小时， 得到发酵液， 利用管式离心机将发酵液进行固液分离， 所得到的菌体 再经过均质机破碎， 热处理， 离心收集上清液， 得到超氧化物歧化酶清液 ； 所谓风量比是一 立方米发酵液与每分钟所需要的进气量之比。 0013 3、 将步骤 2 得到的超氧化物歧化酶清液采用 0.22m 的超滤膜和 6k 的微滤膜 对粗酶液进行过滤和浓缩 ； 然后采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥 ； 进口温度 130 140， 出口 50 60， 得到粉状超氧化物歧化酶包埋产品。 0014。
15、 4、 超氧化物歧化酶活性测定 0015 在一般情况下， SOD 酶活性测定只能应用间接活性测定法 ； 本实验采用邻苯三酚 自氧化方法 ； 邻苯三酚在碱性条件下， 能迅速自氧化， 释放出 O2-， 生成带色的中间产物， 反 应 开始后反应液先变成黄棕色， 几分钟后转绿， 几小时后又转变成黄色， 这是因为生成的 中间物不断氧化的结果 ； 这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段， 中间物的积累 在滞留 30 45s 后， 与时间成线性关系， 一般线性时间维持在 4min 的范围内， 中间物在 325nm 波长出有强烈光吸收 ； 当有 SOD 存在时， 由于它能催化 O2-与 H+ 结合生成 O。
16、2和 H2O2， 从而阻止了中间产物的积累， 因此， 通过计算即可求出 SOD 的酶活性。 0016 酶活力单位定义 ： 在 25恒温条件下， 每毫升反应液中， 每分钟抑制邻苯酚自氧 化率达 50的酶量定义为 1 个酶活力单位。 0017 具体操作如下 ： 0018 测自氧化速率 ： 0019 (1) 取 PH8.2 的 SOD buffer 4.5ml 于石英比色杯 325nm 测光密度值， 调零。 0020 (2)取PH8.2的SOD buffer4.5ml于10mL ep管中(25水浴保温)， 加入45mmol/ L 邻苯三酚溶液 10ul 混匀后迅速于石英比色杯 325nm 波长测光密。
17、度值。 0021 (3) 每隔 30s 测一次， 若测 2min， 求出邻苯三酚的自氧化率 ODA， (ODA/min 在 0.060.002 最好 )， 因为这时得误差较小， 如果自氧化速率高则加浓 Hcl， 看情况而定， 自 氧化速率低加 SOD buffer) 0022 测酶活 ： 0023 (1) 取调整好的 SOD buffer 4.5ml 于 10ml EP 管中 ( 于 25水浴中保温 )， 分别 加入待测酶液 10ul 和 45mmol/L 邻苯三酚溶液 10ul， 混匀后迅速于石英比色杯中， 325nm 波 长测光密度值。 说 明 书 CN 102533687 A 4 3/3。
18、 页 5 0024 (2) 每隔 30s 测一次， 共测 2min， 求出光密度值变化速率 ODB。 0025 计算酶活力 ： 0026 0027 注 ： ODA 为邻苯三酚自氧化速率 0028 ODB 为样品密度值变化速率 0029 V1为反应液总体积 0030 V2为测定样品总体积 具体实施方式 0031 以下通过实例更详细地对本发明的技术要点进行解释， 为更好地理解本发明提供 依据。 0032 实施例 1 ： 0033 1) 将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在 3L 三角瓶 600mL 一级种子培养基中 (pH 6.8 7.2 ； 灭菌条件 ： 121灭菌 30min)。
19、 ； 250rpm、 371培养 12 14 小时备用。 0034 2) 用 100L 种子罐对菌种进行扩大培养 0035 将工业级的酵母粉480g， 蛋白胨900g， 1M磷酸缓冲液(pH6.8)6L， 生物素24mg， 葡萄 糖600g分别投入100L种子罐内， 用自来水定容到60L ； 搅拌均匀 ； 然后用蒸汽直接灭菌， 115度 保温30分钟， 再降温至37度， 接入按步骤1.2所得的600mL一级种子菌液 ； 在通气量0.61 ； 温度 371 ； 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养 6h， 得扩大培养的大肠杆菌二级种子液。 0036 3) 用 1000L 发酵罐发酵生产。
20、超氧化物歧化酶 0037 将工业级的葡萄糖 5kg、 6.65kg 的 KH2PO4、 2kg 的 (NH4)2HPO4、6kg 的 MgSO47H2O、 柠檬酸 1.5kg、 柠檬酸铁 (III)0.05kg 分别投入 1000L 发酵罐内， 用自来水定容到 500L， 搅 拌均匀 ； 然后用蒸汽直接灭菌， 115 度保温 30 分钟， 再降温至 37 度， 灭菌后由 28 NH4OH 调 整 pH 到 7.0， 再添加 0.8L 的微量元素液 (2.5mg/L 的 KI、 1.5mg/L 的 MnCl24H2O、 1.5mg/L 的 CuCl22H2O、 3.0mg/L 的 H3BO3、2。
21、.5mg/L 的 Na2MoO42H2O、 1.3mg/L 的 Zn(CH3COO)22H2O 盐酸硫铵 4.5mg/L) ； 100g 的 CuSO45H2O、 50g 的 ZnSO4， 接入 60L 一级种子培养液 ； 在风 量 1 0.6 0.8、 温度 371、 罐压力 0.03 0.05MPa 的条件下培养， 一段时间以后补 葡萄糖， 到 OD600达到 40 左右开始用 IPTG 诱导， 诱导 2 小时后， 向发酵罐中流加微量元素、 CuSO45H2O 和 ZnSO4， 共诱导 10 小时， 培养过程中为了消除发酵过程中所产生的泡沫， 向 100L 发酵罐和 1000L 发酵罐中加入硅油类的消泡剂， 得到发酵液， 利用管式离心机将发酵 液进行固液分离， 所得到的菌体再经过均质机破碎， 热处理， 离心收集上清液， 得到超氧化 物歧化酶清液。测得超氧化物歧化酶的酶活力为 21723U/mL。 0038 4) 将步骤 2 得到的超氧化物歧化酶清液采用 0.22m 的超滤膜和 6k 的微滤膜 对粗酶液进行过滤和浓缩 ； 然后采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥 ； 进口温度 130 140， 出口 50 60， 得到粉状超氧化物歧化酶包埋产品。测得超氧化物 0039 歧化酶的酶活力为 2650U/mg。 说 明 书 CN 102533687 A 5 。