技术领域
本发明涉及体外诊断试剂，具体的涉及一种人染色体基因IL28B位点多态性检测 试剂盒及其检测方法和用途。
背景技术
宿主IL28B基因多态性，其密切关联的单核苷酸多态性位点主要有位于染色体 (19q13)IL28B基因上游的rs12979860、rs12980275、rs8099917。
目前对IL28B位点多态性的检测方法主要有基因测序法(比如201210234084.6用 于检测丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多态性的试剂盒)及反向杂交法(比如 201010019477.5丙型肝炎病毒基因分型及IL28位点多态性)。这两种方法都要先进行目标 基因扩增，然后对扩增产物二次检测，所以操作复杂。同时，基因扩增产物比模板在数量上 放大了亿倍以上，很容易造成实验室污染，影响检测结果。现行的基因测序法或反向杂交法 由于要求两次操作，所以很难实现全程自动化。
专利ZL201110263288.8(一种快速检测IL28BSNPrs12979860多态性的试剂盒) 是根据PCR扩增片段大小进行结果判断。专利申请201210353290.9(检测IL28B(rs8099917) 和ITPA(rs1127354)的突变的方法)是通过基于包含IL28B基因多态性的rs8099917的特定 区域以及包含ITPA基因多态性的rs1127354的特定区域来设计探针，使用该探针，来通过检 测基于与靶标核酸形成杂交体和/或杂交体解离的信号，来检测所述的突变。
以上现有技术均存在检测结果有不确定性，同时只能检测多态性位点信息不充 分，检测过程操作复杂，具有局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确、快捷、低廉的IL28B基因位点多态性检测方法。
为实现上述目的，本发明提供一种人染色体基因IL28B位点多态性检测试剂盒，其 特征在于，含有以下a、b和c三组中至少一组的引物和探针，所述引物和探针分别为：
a：860L1：AGCTCCCCGAAGGAGC(SEQIDNO：1)
860L2：AGCTCCCCGAAGGAGT(SEQIDNO：2)
860R：AGGCTCAGGGTCAATCACAG(SEQIDNO：3)
860P：TTGAATTGCACTCCGCGCTC(SEQIDNO：4)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL；
b：275L1：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCA(SEQIDNO：5)
275L2：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCG(SEQIDNO：6)
275R：TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQIDNO：7)
275P：AATATTTGCCGGGGTAGCGG(SEQIDNO：8)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL；
c：917L1：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTT(SEQIDNO：9)
917L2：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTG(SEQIDNO：10)
917R：TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQIDNO：11)
917P：TCACCCAAATTGGAACCATGC(SEQIDNO：12)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL。
一种人染色体基因IL28B位点多态性检测方法，包括使用权利要求1试剂盒中的引 物和探针的步骤。其步骤为：
DNA提取：采用磁性纳米颗粒固相吸附法提取全血基因组DNA；
PCR扩增：使用权利要求1所述的引物和探针对提取的全血基因组DNA进行PCR扩 增；
结果判断。
所述DNA提取步骤为：
裂解：取待测病人乙二胺四乙酸(EDTA)三钾盐或枸椽酸钠抗凝全血标本加入到裂 解缓冲液中，所述裂解缓冲液为3M异硫氰酸瓜、10mMEDTA、1％Triton-X100、20mMTris- HClpH6；再加入蛋白酶K，混均55℃加热l0min；
磁吸附：加入l0μl磁性纳米颗粒，混匀静置10min，置于磁力架上进行磁分离，弃废 液。
洗涤：加入洗涤液，所述洗涤液成分为1.5MNaCl、0.5％Triton-X100、10mMEDTA、 20mMTris-HClpH6，振摇混匀，置磁吸附架上，固化磁性颗粒，吸净废液；
洗脱：加入洗脱液，65℃加热10min，期间振摇2次，磁性分离磁珠，上清即为全血基 因组DNA；所述洗脱液成分为1mMEDTA、10mMTris-HClpH8。
所述PCR扩增的步骤中PCR扩增反应体系为：
所述1X1.67反应缓冲液为33.4mMTris-HClpH9.0、83.5mMKCl、8.4mM二硫苏糖 醇、2.5mMMgCl2、0.17％小牛血清白蛋白；
任选的，上述各成分混匀后12000rpm离心10秒钟后再开始扩增；
所述PCR扩增的程序为：95℃5min
循环数40；
每个PCR反应管中，均有相应下游引物和相应探针，和其中一个上游引物；
当检测rs12979860位点时，相应下游引物和相应探针为860R和860P；上游引物为 860L1
或者860L2；
当检测rs12980275位点时，相应下游引物和相应探针为275R、275P；上游引物分别 为
275L1和275L2；
当检测rs8099917位点时，相应下游引物和相应探针为917R、917P；上游引物分别 为
917L1和917L2；
每个位点检测，均有两个PCR反应管。
所述结果判断为同一位点的两个特异性检测管如果一个Ct值在25-30之间，另一 个Ct值大于38，则是对应Ct值小的基因型纯合子；如果两个特异性检测管Ct值相等均在25- 30之间则是杂合子；如果两个特异性检测管Ct值均大于38，说明检测出现假阴性需重新检 测。
所述人染色体基因IL28B位点多态性检测试剂盒用于检测人染色体基因IL28B位 点多态性的用途。
本发明采用的实时跟踪荧光定量基因扩增技术(Real-TimePCR)可以避免现有的 检测技术包括基因测序法及反向杂交法的操作复杂的缺点；可以避免现有检测技术容易污 染导致检测不准确的缺点；本发明可以利用目前市场普及的设备实现全程自动化，缩短检 测时间，有利于大规模标本的筛查；减少了操作步骤，节约试剂费用，降低试剂的生产成本。
本发明的主要目的是为市场提供一种比现有的检测方法更为准确的IL28B基因位 点多态性检测方法；为市场提供一种比现有方法更快捷、可全程自动化的检测方法，可以实 现病人当天即可取得化验结果；为市场提供一种比现有方法更低廉的检测方法。
本发明采用扩增阻碍突变系统(Amplificationrefractorymutationsystem， ARMS)又称等位基因特异性扩增(Allele-specificamplification，ASA)技术联合双荧光 标记探针实时跟踪基因扩增(Real-TimePCR)检测技术，替代现有的基因测序法及反向杂 交法检测基因多态性。采用本发明的技术，只有当目的基因与扩增引物3‘端碱基互补时才 能够有效扩增，如果3’端碱基不互补，则扩增效率明显受到阻碍，从而可以非常方便的检出 多态基因位点的信息。本发明根据人19号染色体的基因序列，充分分析IL28B基因上游 2.5KB-8KB基因区rs12979860(gi409253327)、rs12980275(gi409253327)及rs8099917 (gi409253327)位点的基因多态性情况，设计以下引物及探针：
860L1：AGCTCCCCGAAGGAGC(SEQIDNO：1)
860L2：AGCTCCCCGAAGGAGT(SEQIDNO：2)
860R：AGGCTCAGGGTCAATCACAG(SEQIDNO：3)
860P：TTGAATTGCACTCCGCGCTC(SEQIDNO：4)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL；
275L1：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCA(SEQIDNO：5)
275L2：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCG(SEQIDNO：6)
275R：TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQIDNO：7)
275P：AATATTTGCCGGGGTAGCGG(SEQIDNO：8)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL；
917L1：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTT(SEQIDNO：9)
917L2：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTG(SEQIDNO：10)
917R：TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQIDNO：11)
917P：TCACCCAAATTGGAACCATGC(SEQIDNO：12)，其5’端标记FAM，3’端标记DACYL；
检测试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、对照参比品、PCR扩增体系等组分。
全血基因组DNA提取试剂：采用磁性纳米颗粒固相吸附法提取基因组DNA，由细胞 裂解试剂、磁性纳米颗粒，洗涤试剂及洗脱试剂组成。使用时，取乙二胺四乙酸(EDTA)三钾 盐或枸椽酸钠抗凝全血标本100μl，按照以下步骤操作：1.裂解，于1.5ml离心管中加入抗凝 全血标本100μl、200μl裂解缓冲液(3M异硫氰酸瓜、10mMEDTA、1％Triton-X100、20mM Tris-HClpH6)，蛋白酶K50μg/ml，混均55℃加热10min。2.磁吸附，加入10μl磁性纳米颗粒， 混匀静置10min，置于磁力架上进行磁分离，弃废液。3.洗涤，加入300μl洗涤液(1.5MNaCl、 0.5％Triton-X100、10mMEDTA、20mMTris-HClpH6)，振摇混匀，置磁吸附架上，固化磁性 颗粒，吸净废液。4.洗脱，加入100μl洗脱液(1mMEDTA、10mMTris-HClpH8)，65℃加热 10min，期间振摇2次，磁性分离磁珠，取上清备用。
对照参比品：分别为rs12979860、rs12980275、rs8099917相应位点基因片段(400- 500bp)的克隆重组质粒(分别为103、105、107/ml的pUC18质粒)，同时互相作为阴性对照。
PCR扩增体系：包括酶混合液、反应缓冲液。本发明PCR反应中采用TaqDNA聚合 酶，每个检测的反应液中含2uTaqDNA聚合酶。PCR反应的缓冲液的缓冲体系为20mmol/L Tris-HCl(pH9.0，20℃)、50mmol/LKCl、小牛血清白蛋白(100μg/ml)、5mmol/l的二硫苏糖 醇(DTT)、1.5mmol/l的Mg2+。每个反应中左、右引物及特异性双荧光标记探针的终浓度为 0.3μmol/。四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)dNTPs的浓度为100μmol/L。
本发明首次采用ASA联合RT-PCR技术用于IL28B基因多态性鉴定，针对突变位点进 行引物探针的设计是有相应的技巧的。
本发明可以很好地现有技术的缺点，操作简便快捷，易于自动化，适合实验室诊断 及流行病学调查应用。
本发明方法有益效果是：
1、与现有方法相比检测更简便快捷；
2、与现有方法相比本发明的方法易于实现全程自动化；
3、与现有方法相比可以避免PCR产物的二次操作，减少污染；
4、与现有方法相比成本更低，更经济；
5、与现有方法相比可以利用目前市场普及的设备，不必新增投资。
附图说明
图1是基因型纯合子对应的图谱。
图2是基因型杂合子对应的图谱。
图3是结果为假阴性时对应的图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
1、裂解：取待测病人(厦门市中医院)乙二胺四乙酸(EDTA)三钾盐或枸椽酸钠抗凝 全血100μl加入1.5ml离心管中，依次加入200μl裂解缓冲液(3M异硫氰酸瓜、10mMEDTA、1％ Triton-X100、20mMTris-HClpH6)、20μl蛋白酶K，混均，55℃加热10min。2.磁吸附，向上述 离心管中加入10μl磁性纳米颗粒(上海奥润微纳新材料科技有限公司SM-015D)，混匀静置 10min，置于磁力架上进行磁分离，吸去废液，尽量吸净。3.洗涤，向上述离心管中加入300μl 洗涤液(1.5MNaCl、0.5％Triton-X100、10mMEDTA、20mMTris-HClpH6)，振摇混匀，置磁吸 附架上，固化磁性颗粒，吸净废液。4.洗脱，加入100μl洗脱液(1mMEDTA、10mMTris-HCl pH8)振摇混匀，65℃加热10min，期间振摇2次，磁性分离磁珠，取上清备用。
取6只PCR扩增管，分别加入2μlTaqDNA聚合酶及配制好的分别含有上述6种特异 性引物、探针的反应缓冲液33μl(各管引物探针组合如下：
1号管rs12979860C型
860L1：AGCTCCCCGAAGGAGC(SEQIDNO：1)
860R：AGGCTCAGGGTCAATCACAG(SEQIDNO：3)
860P：FAM-TTGAATTGCACTCCGCGCTC-DACYL(SEQIDNO：4)
2号管rs12979860T型
860L2：AGCTCCCCGAAGGAGT(SEQIDNO：2)
860R：AGGCTCAGGGTCAATCACAG(SEQIDNO：3)
860P：FAM-TTGAATTGCACTCCGCGCTC-DACYL(SEQIDNO：4)
3号管rs12980275A型
275L1：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCA(SEQIDNO：5)
275R：TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQIDNO：7)
275P：FAM-AATATTTGCCGGGGTAGCGG-DACYL(SEQIDNO：8)
4号管rs12980275G型
275L2：CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCG(SEQIDNO：6)
275R：TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQIDNO：7)
275P：FAM-AATATTTGCCGGGGTAGCGG-DACYL(SEQIDNO：8)
5号管rs8099917T型
917L1：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTT(SEQIDNO：9)
917R：TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQIDNO：11)
917P：FAM-TCACCCAAATTGGAACCATGC-DACYL(SEQIDNO：12)
6号管rs8099917G型
917L2：TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTG(SEQIDNO：10)
917R：TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQIDNO：11)
917P：FAM-TCACCCAAATTGGAACCATGC-DACYL(SEQIDNO：12)
磁珠法分离的基因组DNA15μl，混匀，12000rpm离心10秒钟，置荧光定量PCR仪中扩 增并自动分析结果。反应条件，首先95℃5min使模板充分解链，然后95℃变性30s、58℃退火 并延伸50s，循环数40。每个循环的延伸期间检测反应管中的荧光信号强度，定量分析待测 模板的基因数量，给出分析结果。结果判断，同一位点的两个特异性检测管如果一个Ct值在 25-30之间，另一个Ct值大于38，则是对应Ct值小的基因型纯合子(见图1)；如果两个特异性 检测管Ct值相等均在25-30之间则是杂合子(见图2)；如果两个特异性检测管Ct值均大于38 说明检测出现假阴性要找出问题重新检测(见图3)。
采集厦门市中医院慢性丙型肝炎病人100例，其中抗病毒治疗持续病毒应答(SVR) 病人60例，抗病毒治疗无应答(NVR)病人40例，采用上述方法检测具体结果如下表1、2和3：
表1慢性丙型肝炎病人IL28B等位基因rs12979860位点频率对比表
病例 CC CT 合计 SVR 51 9 60 NVR 27 13 40 合计 78 22 100
表2慢性丙型肝炎病人IL28B等位基因rs12980275位点频率对比表
病例 CC CT 合计
SVR 52 8 60 NVR 27 13 40 合计 79 21 100
表3慢性丙型肝炎病人IL28B等位基因rs8099917位点频率对比表
病例 CC CT 合计 SVR 53 7 60 NVR 28 12 40 合计 81 19 100
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。