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1、(10)申请公布号 CN 102071135 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102071135 A *CN102071135A* (21)申请号 200910228604.0 (22)申请日 2009.11.20 C12M 1/34(2006.01) G01Q 10/04(2010.01) G01Q 60/44(2010.01) (71)申请人 国家纳米技术与工程研究院 地址 300457 天津市经济技术开发区第四大 街 80 号 (72)发明人 张彦军 (54) 发明名称 基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳 及其工作方法 (57) 摘要 一种基于扫描探针显微镜技术的。
2、高分辨率膜 片钳， 包括充满电解液的玻璃微探针、 置于玻璃微 探针内的 Ag/AgCl 电极、 参比 Ag/AgCl 电极、 内含 细胞与细胞培养液的培养皿、 SICM 样品扫描台、 SICM 负反馈扫描控制电路、 SICM 高精度 XYZ 三维 压电陶瓷扫描台、 商用膜片钳前置电流功率放大 器及膜片钳数模/模数转换器 ； 工作方法为 ： 玻璃 微探针在细胞表面非接触地扫描并获得细胞膜表 面的高分辨率成像 ； 膜片钳玻璃微探针非接触精 确定位于样品表面待研究的特定纳米尺度微结构 上 ； 完成玻璃微探针与细胞膜片兆欧姆封接， 从 而实现离子通道记录。优越性 ： 高分辨率的膜片 钳技术可用于研究多。
3、种细胞膜上纳米尺度微结构 中离子通道的 “开” 、“闭” 动力学、 离子通透性等。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102071139 A1/1 页 2 1. 一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳， 其特征在于它包括充满电解液的 玻璃微探针、 置于玻璃微探针内的 Ag/AgCl 电极、 参比 Ag/AgCl 电极、 内含细胞与细胞培养 液的培养皿、 SICM 样品扫描台、 SICM 负反馈扫描控制电路、 SICM 高精度 XYZ 三维压电陶瓷 扫描台、 商用膜片钳前置电流功率放大器。
4、及膜片钳数模 / 模数转换器 ； 所说的充满电解液 的玻璃微探针和参比 Ag/AgCl 电极均置于培养皿的细胞培养液中 ； 所说的置于玻璃微探针 内的 Ag/AgCl 电极和参比 Ag/AgCl 电极分别与膜片钳前置电流功率放大器连接 ； 所说的膜 片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模 / 模数转换器连接 ； 所说的膜片钳数模 / 模数转换 器与 SICM 负反馈扫描控制电路连接 ； 所说 SICM 负反馈扫描控制电路与 SICM 高精度 XYZ 三 维压电陶瓷扫描台 ； 所说的内含细胞与细胞培养液的培养皿置于 SICM 样品扫描台上。 2. 根据权利要求 1 所说的一种基于扫描探针显微镜技术的。
5、高分辨率膜片钳， 其特征在 于所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳 技术。 3. 根据权利要求 1 所说的一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳， 其特征在 于所说的膜片钳数模 / 模数转换器采用美国 Molecular Device 公司的 Axon 商用膜片钳技 术。 4. 根据权利要求 1 所说的一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳， 其特征在 于所说的 SICM 负反馈控制电路采用英国 IONSCOPE 公司的 ICnano SICM 非接触式扫描离子 电导显微镜技术。 5. 根据权利要求 1 所说的一种基于扫描探针显。
6、微镜技术的高分辨率膜片钳， 其特征在 于所说的 SICM 高精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台采用英国 IONSCOPE 公司的 ICnano SICM 非 接触式扫描离子电导显微镜技术。 6. 一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳的工作方法， 其特征在于它由以下 步骤构成 ： (1) 用 SICM 高精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台及 SICM 负反馈扫描控制电路控制玻璃微 探针在细胞表面非接触地扫描并获得细胞膜表面的高分辨率成像 ； (2) 在 SICM 负反馈扫描控制电路的作用下膜片钳玻璃微探针非接触地精确定位于样 品表面待研究的特定纳米尺度微结构上 ； (3) 关闭 SICM 负反。
7、馈扫描控制电路， 再像传统膜片钳一样完成玻璃微探针与细胞膜片 接触并形成兆欧姆封接 ； (4) 细胞膜片上的离子通道电流通过膜片钳前置电流功率放大器放大、 膜片钳数模 / 模数转换器采集， 从而实现离子通道记录。 权 利 要 求 书 CN 102071135 A CN 102071139 A1/4 页 3 基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳及其工作方法 ( 一 ) 技术领域 ： 0001 本发明属于生物用膜片钳技术领域， 特别是指一种基于扫描纳米玻璃探针显微镜 技术的探测活体细胞膜表面离子通道活性的高分辨率膜片钳技术， 即一种基于扫描探针显 微镜技术的高分辨率膜片钳及其工作方法。 ( 二 。
8、) 背景技术 ： 0002 电生理学的产生与发展从一开始就与电子仪器的革新与进步紧密相连， 仪器设 备灵敏度和分辨率的提高为深入探知生物电本质创造了条件。1976 年德国马普研究所的 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 博士创建膜片钳技术 (patch-clamptechniques) 以来， 它给 电生理学和细胞生物学的发展乃至整个生物学研究带来了一场革命， 人们因此对离子通道 本质的认识有了一个质的飞跃。这一伟大的贡献使 Neher 和 Sakmann 获得了 1991 年度的 诺贝尔生理学与医学奖。 膜片钳技术的发展对离子通道的功能及细胞功能的调控研究起到 了巨大的推动。
9、作用， 其为阐明离子通道病的发病机理并探索治疗的新途径提供了有效的研 究方法。 然而， 任何技术与方法都不是尽善尽美的， 膜片钳技术自发明伊始就从未停止过被 改进和完善。根据特定的试验条件又发展出了多种模式的膜片钳技术， 从而保证了该技术 可用于多种细胞功能的研究。现在， 每年都有数千篇膜片钳技术方法及其应用方面的文献 报道， 该技术在生物学领域里的广泛应用已成为现代生物学的主要内容之一。大量的膜片 钳技术研究结果表明 ： 大量的膜片钳技术研究结果表明 ： 细胞膜的离子通道并不是均一分 布的， 而是通常分布在细胞表面的微观结构中， 离子通道的这种分布方式与细胞生理功能 紧密相连。 如具有保钠排。
10、钾功能的肾上皮细胞， 其特异性咪吡嗪敏感的上皮细胞Na+通道和 电压敏感型 K+通道多分布在约 100 纳米大小的微绒毛上。离子通道与细胞表面亚细胞微 观结构及其生理功能紧密相关的现实， 向传统的膜片钳技术发起了新的挑战。传统的膜片 钳技术须先借助光学显微镜来在细胞膜表面进行玻璃微电极针尖定位后再进行离子通道 的记录， 由于光学衍射极限的限制使普通光学显微镜的最高分辨率很难突破 200 纳米， 导 致传统的膜片钳技术不能准确研究离子通道与小于 200 纳米的细胞表面微结构的关系。加 之， 许多生物样品的光透过性不好， 这更加降低了传统膜片钳技术的分辨率。因此， 低分辨 率的传统膜片钳技术已不能。
11、满足目前生物学研究的需要。 0003 随着纳米技术的飞速发展及扫描探针显微镜技术 (SPM) 在生物领域的广泛应用， 使高分辨率地实时探测活体生物样品成为可能。1989 年， 加州大学的 Hansma 教授利用扫 描探针显微镜的负反馈控制技术， 用玻璃微探针作为扫描探针设计出了非接触式的扫描离 子电导显微镜技术 (scanning ion conductance microscopy， SICM)( 见图 1)。但是由于 当时负反馈控制方法及精确定位技术的局限与不足， 纤细的玻璃微滴管探针在扫描时经常 意外地与样品表面接触并导致针尖或样品的毁损， 所以扫描离子电导显微镜技术在其发明 后的很长一。
12、段时间仅适用于平坦的 PET 薄膜的扫描成像。1997 年英国伦敦帝国理工学院 的 Korchev 教授对扫描离子电导探针显微镜的负反馈控制等技术进行重大改进后， 使该显 微镜技术实现了对活体生物样品表面结构的非接触三维实时探测， 并逐步成为纳米生物医 说 明 书 CN 102071135 A CN 102071139 A2/4 页 4 学研究领域具有发展潜力及应用前景的一种扫描纳米玻璃探针显微镜技术。 SICM可以实时 高分辨率地非接触式探测活体生物样品表面形貌， 其纳米尺度玻璃微滴管扫描探针与膜片 钳用玻璃微电极相似且同样在电解液中工作， 因此为建立高分辨率的膜片钳技术提供了技 术保障。 。
13、( 三 ) 发明内容 ： 0004 本发明的目的在于提供一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳及其工 作方法， 它针对传统膜片钳技术分辨率的不足， 提供了一种利用扫描探针显微镜非接触式 扫描的高分辨率来精确定位膜片钳玻璃微滴管电极， 建立了一种基于非接触扫描探针显微 镜扫描控制技术的高分辨率膜片钳技术， 从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定 生理功能 ( 离子通道特性 ) 的关系提供了全新技术手段。 0005 本发明的技术方案 ： 一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳， 其特征在 于它包括充满电解液的玻璃微探针、 置于玻璃微探针内的 Ag/AgCl 电极、 参比 Ag/AgCl。
14、 电 极、 内含细胞与细胞培养液的培养皿、 SICM 样品扫描台、 SICM 负反馈扫描控制电路、 SICM 高 精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台、 商用膜片钳前置电流功率放大器及膜片钳数模 / 模数转换 器 ； 所说的充满电解液的玻璃微探针和参比 Ag/AgCl 电极均置于培养皿的细胞培养液中 ； 所说的置于玻璃微探针内的Ag/AgCl电极和参比Ag/AgCl电极分别与膜片钳前置电流功率 放大器连接 ； 所说的膜片钳前置电流功率放大器与膜片钳数模 / 模数转换器连接 ； 所说的 膜片钳数模 / 模数转换器与 SICM 负反馈扫描控制电路连接 ； 所说 SICM 负反馈扫描控制电 路与 SIC。
15、M 高精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台 ； 所说的内含细胞与细胞培养液的培养皿置于 SICM 样品扫描台上。 0006 上述所说的膜片钳前置电流功率放大器采用美国 Molecular Device 公司的 Axon 商用膜片钳技术。 0007 上述所说的膜片钳数模 / 模数转换器采用美国 Molecular Device 公司的 Axon 商 用膜片钳技术。 0008 上述所说的 SICM 负反馈控制电路采用英国 IONSCOPE 公司的 ICnano SICM 非接触 式扫描离子电导显微镜技术。 0009 上述所说的 SICM 高精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台采用英国 IONSCOPE 公。
16、司的 ICnano SICM 非接触式扫描离子电导显微镜技术。 0010 一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳的工作方法， 其特征在于它由以 下步骤构成 ： 0011 (1) 用 SICM 高精度 XYZ 三维压电陶瓷扫描台及 SICM 负反馈扫描控制电路控制玻 璃微探针在细胞表面非接触地扫描并获得细胞膜表面的高分辨率成像 ； 0012 (2) 在 SICM 负反馈扫描控制电路的作用下膜片钳玻璃微探针非接触地精确定位 于样品表面待研究的特定纳米尺度微结构上 ； 0013 (3) 关闭 SICM 负反馈扫描控制电路， 再像传统膜片钳一样完成玻璃微探针与细胞 膜片接触并形成兆欧姆封接 ； 0。
17、014 (4) 细胞膜片上的离子通道电流通过膜片钳前置电流功率放大器放大、 膜片钳数 模 / 模数转换器采集， 从而实现离子通道记录。 说 明 书 CN 102071135 A CN 102071139 A3/4 页 5 0015 本发明的工作原理 ： Ag/AgCl 电极置于充满电解液的玻璃微探针中作为扫描探 针， 内含细胞与细胞培养液的培养皿置于 SICM 样品扫描台上， 参比电极置于培养皿的细胞 培养液中， 并通过负反馈电路实时监测探针内电极与参比电极之间电导的变化。当探针接 近细胞表面时， 由于允许离子流入玻璃微探针针尖自由空间的减小， 离子电导也随之减小。 在扫描过程中， SICM 。
18、负反馈控制电路通过高精度 XYZ 三维压电陶瓷来保持玻璃探针电极与 细胞表面距离的恒定 ( 即非接触 )。 0016 本发明的优越性 ： 本发明的高分辨率的膜片钳技术可被方便地用于研究多种细胞 膜上纳米尺度微结构中离子通道的 “开” 、“闭” 动力学、 离子通透性等， 从而为研究细胞膜表 面纳米尺度微观结构与特定生理功能的关系提供了全新的技术手段。 ( 四 ) 附图说明 ： 0017 图 1 为现有技术非接触式的扫描离子电导显微镜技术的结构示意图。 0018 图 2 为本发明所涉一种基于扫描探针显微镜技术的高分辨率膜片钳的结构示意 图。 0019 图 3 为本发明所涉一种基于扫描探针显微镜技术。
19、的高分辨率膜片钳的工作流程 图。 ( 五 ) 具体实施方式 ： 0020 实施例 ： 我们利用英国IONSCOPE公司的ICnano SICM非接触式扫描离子电导显微 镜技术融合美国 Molecular Device 公司的 Axon 商用膜片钳技术， 来建立新型的基于非接 触扫描探针显微镜技术扫描控制技术的高分辨率膜片钳。主要用 Axon 商用膜片钳系统的 前置电流功率放大器和数模 / 模数转换器来替代 SICM 显微镜自有电流放大器 ( 见图 2)。 图中， Ag/AgCl 电极置于充满电解液的玻璃微探针中作为扫描探针， 内含细胞与细胞培养液 的培养皿置于 SICM 样品扫描台上， 参比电。
20、极置于培养皿的细胞培养液中， 并通过负反馈电 路实时监测探针内电极与参比电极之间电导的变化。当探针接近细胞表面时， 由于允许离 子流入玻璃微探针针尖自由空间的减小， 离子电导也随之减小。在扫描过程中， SICM 负反 馈控制电路通过高精度XYZ三维压电陶瓷来保持玻璃探针电极与细胞表面距离的恒定(即 非接触 )。 0021 在高分辨率膜片钳实施例的具体操作步骤中(见图3)， 首先用SICM高精度XYZ三 维压电陶瓷扫描台及负反馈扫描控制系统控制玻璃电极探针在细胞表面非接触地扫描并 获得细胞膜表面的高分辨率成像 ； 在负反馈和扫描控制系统帮助下膜片钳玻璃电极非接触 精确定位于样品表面待研究的特定纳。
21、米尺度微结构上 ； 关闭负反馈和扫描控制系统， 再像 传统膜片钳一样完成玻璃电极与细胞膜片兆欧姆封接及进行离子通道记录。 这种高分辨率 的膜片钳技术可被方便地用于研究多种细胞膜上纳米尺度微结构中离子通道的 “开” 、“闭” 动力学、 离子通透性等， 从而为研究细胞膜表面纳米尺度微观结构与特定生理功能的关系 提供了全新的技术手段。 0022 以上所述仅为本发明基于英国 IONSCOPE 公司的 ICnano SICM 非接触式扫描离子 电导显微镜技术融合美国Molecular Device公司的Axon商用膜片钳技术所建立的活体细 胞的高分辨率膜片钳技术手段， 应当指出， 对于本领域的技术人员来说， 依据本发明的构成 说 明 书 CN 102071135 A CN 102071139 A4/4 页 6 方式和操作原理， 还可以将其他扫描探针显微镜技术与其他商用膜片钳系统相结合而建立 类似的高分辨率膜片钳系统， 这些均落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102071135 A CN 102071139 A1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102071135 A 。