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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201010575823.9 (22)申请日 2010.11.30 CGMCC No.4332 2010.11.15 C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (73)专利权人 中国科学院微生物研究所 地址 100190 北京市朝阳区大屯路甲 3 号 (72)发明人 谭华荣 刘波 杨海花 张树利 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 王旭 Cheng Zhou et al.Enhancing the thermostability of -glucosidase fr。
2、om Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 by single proline substitution.Journal of Bioscience and Bioengineering .2010, 第 110 卷 ( 第 1 期 ),12-17. D. Koma H. et al.Overexpression and characterization of thermostable serine protease in Escherichia coli encoded by the ORF TTE0824 from Thermoanaerobacter 。
3、tengcongensis.Extremophiles .2007, 第 11 卷 769779. Yanfen Xue, et al.Thermoanaerobacter tengcongensis sp. nov., a novel anaerobic, saccharolytic, thermophilic bacterium isolated from a hot spring in Tengcong, China. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology .2001, 第 51 卷 1335-。
4、1341. (54) 发明名称 用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4 的质粒、 培 养基和转化方法 (57) 摘要 本发明公开了一种腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4 (Thermoanaerobactertengcongensis MB4) 的 遗传转化方法。本发明还涉及用于该转化方法 中的质粒、 培养基、 以及采用该转化方法筛选的 Thermoanaerobactertengcongensis MB4转化子。 另外， 本发明还涉及上述质粒的构建方法。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 翟羽佳 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说。
5、明书10页 序列表6页 附图7页 CN 102477442 B 2016.03.09 CN 102477442 B 1/2 页 2 1.一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4 的质 粒， 所述质粒包含如 SEQ ID NO:2 中划线部分所示的 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子序列， 以及与所述启动子序列可操作地连接的具有编码热稳定性 蛋白酶的抗生素抗性基因， 并且所述质粒以质粒 pHT3101 为骨架， 并包含如 SEQ ID NO:1 所示的 Thermo。
6、anaerobacter tengcongensis MB4 染色体复制起点序列， T.tengcongensis MB4 染色体复制起点序列 ori Tte 插入在质粒 pHT3101 多克隆位点的 EcoR I 和 Xba I 位 点之间， 且如 SEQ ID No ： 2 所示的 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子 Ptte1482 和 卡那霉素抗性基因 kanR构建的融合基因插入在质粒 pHT3101 多克隆位点的 Xba I 和 Pst I 位点之间。 2.一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter tengcongensi。
7、s)MB4 的质 粒， 所述质粒包含如 SEQ ID NO:2 中划线部分所示的 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子序列， 以及与所述启动子序列可操作地连接的具有编码热稳定 性蛋白酶的抗生素抗性基因， 并且所述质粒以质粒 pBluescript KSII+ 为骨架， 并包含 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 染色体上 hisG 的左右相邻的 1.0 2.0kb DNA 片段， 所述用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4 的质粒通过以下方法构建 ： 1) 将如 SEQ ID NO ： 2 所示的。
8、 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子 Ptte1482 和卡那霉素抗性基因 kanR 构建的融合基因插入质粒 pBluescript KSII+ 的 EcoR V 位点上， 得到质粒 pTHA ； 2) 以 T.tengcongensis MB4 染色体作模板， SEQ ID No ： 9、 SEQ ID No ： 10 为引物扩增 SEQ ID No ： 11 后， 将 SEQ ID No ： 11 插入质粒 pTHA 的 Not I、 spe I 位点间， 得到质粒 pTHB ； 3) 以 T.tengcongensis MB4染色体作模板， SEQ ID。
9、 No ： 12、 SEQ ID No ： 13为引物扩增SEQ ID No ： 14 后， 将 SEQ ID No ： 14 插入质粒 pTHB 的 Hind III、 Xho I 位点之间。 3.如权利要求 1-2 中任一项所述的质粒， 其特征在于所述的抗生素抗性基因为卡那霉 素氨基糖苷磷酸转移酶基因 kanR。 4.一种转化 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 的方法， 该方法包括以下步骤 ： 1)菌种活化 ： 将保存于-70的Thermoanaerobacter tengcongensis MB4菌体悬液于 60厌氧滚管培养 60 72h ； 挑取。
10、较大的菌落接入液体 TTE 培养基中， 于 75培养至 OD600 为 0.8 1.2 ； 2) 菌体培养 ： 在液体 TTE 培养基中以所述液体 TTE 培养基体积的 1 2接种步骤 1) 中活化的密度为 106细胞 /ml 的 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4， 并在 75下培 养 12 18h 至菌体密度为 1 2108细胞 /ml ； 3) 菌 体 转 化 ： 用 权 利 要 求 1-2 所 述 的 用 于 转 化 腾 冲 嗜 热 厌 氧 杆 菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4 的质粒对步骤 2) 中得。
11、到的培养物使用电击转 化法或自然感受态法进行转化获得转化子 ； 4) 转化子筛选 ： 将步骤 3) 中得到的转化子在 400 600g/ml 含具有热稳定性的抗 生素的固体 TTE 培养基在 55 60下温育 60 72h 进行转化子筛选， 在所述固体 TTE 培 养基上生长的为Thermoanaerobacter tengcongensis MB4转化子， 其中所述具有热稳定性 的抗生素与步骤 3) 中使用的质粒所包含的抗生素抗性基因相对应。 5.如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于在步骤 4) 中， 将步骤 3) 中得到的转化子在 400g/ml 含具有热稳定性的抗生素的固体 TTE 。
12、培养基在 60下温育 60 72h 进行转化 权 利 要 求 书 CN 102477442 B 2 2/2 页 3 子筛选。 6.如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于当使用电击转化法时， 使用的电击电压为 1.8 3.0kv ； 电击时间为 ： 4 6ms。 7.如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于用的电击电压为 1.8kv。 8.如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于当使用自然感受态法时无需厌氧设备来创造 厌氧环境。 9.一种Thermoanaerobacter tengcongensis MB4转化子， 所述转化子是通过权利要求 4-8 中任一项所述的方法产生和筛选的。 10.如。
13、权利要求 9 所述的转化子， 其特征在于所述转化子含有权利要求 1 所述的质粒。 11.如权利要求 9 所述的转化子， 其特征在于所述转化子含有权利要求 2 所述的质粒。 12.如权利要求 9 所述的转化子， 其特征在于所述转化子含有权利要求 3 所述的质粒， 且其 hisG 基因已被破坏。 13.如权利要求 9 所述的转化子， 其特征在于所述转化子含有权利要求 4 所述的质粒， 且其 hisG 基因已被破坏。 14.如权利要求 9 所述的转化子， 其特征在于所述转化子为 CGMCC4332。 权 利 要 求 书 CN 102477442 B 3 1/10 页 4 用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 M。
14、B4 的质粒、 培养基和转化方 法 技术领域 0001 本发明属于微生物基因工程和发酵工程领域， 涉及一种细菌的遗传转化方法， 具 体是关于腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4(Thermoanaerobactertengcongensis MB4， 以下简称为 T.tengcongensis MB4)的遗传转化方法。 本发明还涉及用于该转化方法中的质粒、 培养基、 以及采用该转化方法筛选的转化子。另外， 本发明还涉及上述质粒的构建方法。 背景技术 0002 嗜热厌氧菌的生境与原始地球的高温无氧环境较为接近， 对其环境适应性机制和 生理特征的研究对于研究生命进化乃至生命的起源都有重要的意义。 0003 T。
15、.tengcongensis MB4 是从我国云南腾冲温泉中分离到的一株嗜热、 厌氧、 革兰氏阴性、 杆状真细菌， 其可在 50 80下生长， 最适生长温度为 75 (Xue 等人， 2001， International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology， 51 ： 1335-1341)。 T.tengcongensis MB4也是我国自主完成基因组测序的第一个微生物基因组， 其基因组中大多数基因的功能已得到注释 (Bao 等人， 2002， Genome Res.， 12 ： 689-700)。 基因组测序及基因功能注释极。
16、大地促进了对 T.tengcongensis MB4 的研究， 目前已有 60 余篇与 T.tengcongensis MB4 相关的研究得以发表 (Zhang 等人， 2007， Archivesof Biochemistry and Biophysics， 466 ： 211-220 ； Zhang等人， 2010， NucleicAcids Research， 38 ： 3709-3720 ； Qian 等人， 2010， J Bacteriol.， 192 ： 4311-4316)。然而， 纵观已发表的研 究结果， 可以发现相关的研究都集中于 T.tengcongensis MB4 相。
17、关基因用大肠杆菌系统进 行克隆、 异源表达和蛋白纯化， 进而研究相关蛋白的体外生化功能。迄今为止， 世界上还 没有 T.tengcongensis MB4 体内遗传学研究的任何报道， 究其主因是因为到目前为止还 未能建立该菌株的遗传操作系统。实际上， 只有从生理功能水平上 对相关蛋白进行研究 才能揭示 T.tengcongensis MB4 环境适应的机制， 这也使得建立该菌的遗传操作系统是 相当迫切和必要的。目前来看， 以下几方面问题的存在致使建立该菌遗传操作系统变得 相当困难 ： 1)T.tengcongensis MB4 菌株本身不含内源性质粒， 从而需要寻找或构建能在 T.tengco。
18、ngensis MB4 中自主复制的质粒 ； 2) 建立遗传操作系统往往采用含有抗生素的环 境来筛选转化子， 但 T.tengcongensis MB4 的最适生长温度为 75， 仅有少数几种抗生素 能在此温度下不失活 ； 3) 只有极少数抗生素抗性基因能在 75下有效表达， 也就使得筛选 转化子的筛选标记相当匮乏 ； 4) 培养 T.tengcongensis MB4 所需要的严格厌氧环境也进一 步加大了操作的难度。因此， 要建立 T.tengcongensis MB4 的遗传操作系统就必须克服上 述问题， 简而言之就是 ： 构建能在 T.tengcongensis MB4 中复制和表达抗生。
19、素抗性的质粒、 设计将构建好的质粒转入细胞内的遗传转化方法和转化子筛选条件。 0004 对于转化方法而言， 电击转化由于其制备感受态细胞简单和转化率高的特点， 对未知特性的菌株的转化来说一直都是首选的方法。但自然界也存在自然感受态的菌 株， 如 Thermus thermophilus HB27(Friedrich 等人， 2001， Applied and Environmental 说 明 书 CN 102477442 B 4 2/10 页 5 Microbiology， 67 ： 3140-3148) 和 Acinetobacter calcoaceticus(Juni 等人， 1969。
20、， J.Bacteriol.， 98 ： 281-288)， 这些菌株不需要特殊处理 ( 如制备感受态和电击等 ) 就能吸 收体外环境中质粒。这类菌株的自然感受态的存在大大地简便了转化过程。 0005 综上所述， 构建T.tengcongensis MB4遗传操作系统存在相当多的难题， 因此本领 域中需要构建一种适宜的质粒以及使用该质粒遗传转化 T.tengcongensis MB4 的方法。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4(T.tengcongensis MB4) 的质粒以及使用该质粒遗传转化 T.tengcongensis MB4 的方法。另外，。
21、 本发明中还构 建了破坏T.tengcongensis MB4中组氨酸合成操纵子中的hisG基因的质粒， 并利用所建立 的转化方法将该质粒转入 T.tengcongensis MB4 中， 并实现了对 hisG 基因的破坏。 0007 因 此， 在 本 发 明 的 第 一 个 方 面， 提 供 了 一 种 用 于 转 化 腾 冲 嗜 热 厌 氧 杆 菌 T.tengcongensis MB4 的 质 粒 ( 以 下 简 称 为 “本 发 明 的 质 粒” )， 所 述 质 粒 包 含 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子序列， 以及与所述启动子序列可操作地连接的。
22、 具有编码热稳定性蛋白酶的抗生素抗性基因。 0008 在本发明的质粒的一个实施方案中， 所述质粒以质粒 pHT3101 为骨架， 并包含 T.tengcongensis MB4 染色体复制起点序列。在本发明的一个优选实施方案中， 该质粒为 pBFL01。 0009 在本发明的质粒的另一个实施方案中， 本发明的质粒以质粒 pBluescript KSII+ 为骨架， 并包含T.tengcongensis MB4染色体上hisG的左右相邻的1.02.0kb DNA片段。 在一个优选实施方案中， 所述质粒用于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 中组 氨酸合成操纵子中的 hi。
23、sG 基因， 例如该质粒为 pTTH01。 0010 在本发明的质粒的一个优选实施方案中， 所述抗生素抗性基因为卡那霉素氨基糖 苷磷酸转移酶基因 kanR。 0011 在第二个方面， 本发明提供了一种用于转化T.tengcongensis MB4的TTE培养基， 所述 TTE 培养基的配方为以每升计包含下列成分 ： 酵母浸出物 2.0 2.5g， 蛋白胨 2.5 7.5g， 氯化钠 1.5 3.0g， 硫酸铵 1.0 3.0g， 磷酸二氢钾 0.1 0.5g， 磷酸氢二钾 0.1 0.5g， L-半胱氨酸盐酸盐0.20.8g， 可溶性淀粉7.515g， 1刃天青溶液0.81.2ml， 硫代硫酸。
24、钠 0.3 0.8g， pH 值为 7.5。 0012 在第三个方面， 本发明提供了一种转化 T.tengcongensis MB4 的方法 ( 以下简称 为 “本发明的转化方法” )， 该方法包括以下步骤 ： 0013 1) 菌种活化 ： 菌种活化 ： 将保存于 -70的腾冲嗜热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 菌体悬液于 60厌氧滚管培养 60 72h ； 挑取较大的菌落接入液体 TTE 培养基中， 于 75培养至 OD600为 0.8 1.2。 0014 2) 菌体培养 ： 在液体 TTE 培养基中以所述液体 TTE 培养基体积的 1 2接种步 骤 1) 中活化的密度为 。
25、106细胞 /ml 的 T.tengcongensis MB4， 并在 75下培养 12 18h 至 菌体密度为 1 2108细胞 /ml ； 0015 3) 菌体转化 ： 用本发明的质粒对步骤 2) 中得到的培养物使用电击转化法或自然 感受态法进行转化获得转化子 ； 说 明 书 CN 102477442 B 5 3/10 页 6 0016 4) 转化子筛选 ： 将步骤 3) 中得到的转化子在 400 600g/ml， 优选 400g/ml 含具有热稳定性的抗生素 ( 所述抗生素与本发明的质粒中的抗生素基因相对应， 诸如卡那 霉素 ) 的固体 TTE 培养基在 55 60， 优选 60下温育 。
26、60 72h 进行转化子筛选， 在所 述固体 TTE 培养基上生长的为 T.tengcongensis MB4 转化子。 0017 在本发明的转化方法的一个优选实施方案中， 当使用电击转化法时， 使用的电击 电压为 1.8 3.0kv， 优选 1.8kv ； 电击时间为 ： 4 6ms。 0018 在本发明的转化方法的另一个优选实施方案中， 当使用自然感受态法时无需厌氧 设备来创造厌氧环境。 0019 在第四个方面， 本发明提供了T.tengcongensis MB4转化子， 所述转化子是通过本 发明的转化方法产生和筛选的。 0020 在本发明的转化株的一个优选实施方案中， 所述转化株含有本发。
27、明的质粒， 例如 含有质粒 pTTH01 或 pBFL01。在一个实施方案中， 该转化子含有质粒 pTTH01， 并且其 hisG 基因已被破坏。 0021 在本发明的转化子的另一个优选实施方案中， 所述转化子为保藏号为 CGMCC4332 的转化子， 该转化子于 11 月 15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 该转化子包含本发明的质粒 pTTH01。 0022 本发明的有益效果如下 ： 0023 1. 建立了有效转化 T.tengcongensis MB4 的方法， 并优化电击转化的条件， 在较 低电压 ( 如 1.8kv) 条件下转化效率最高。 002。
28、4 2. 建立了采用自然感受态转化法转化 T.tengcongensis MB4 的方法， 该法不需要 特殊处理 ( 如制备感受态和电击等 )， 且其转化效率不低于电击转化效率。 0025 3. 构建了用于转化 T.tengcongensis MB4 的适宜质粒及其构建方法， 实现了 T.tengcongensis MB4 遗传转化和体内研究的突破。该质粒 pBFL01 含有 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 启动子 (Ptte1482)、 编码热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶的基因 (kanR)、 苏云金芽孢杆菌复制起点(ori B.t)和T.tengconge。
29、nsis MB4染色体复制起点(ori Tte) 的特征， 其能有效地携带耐热抗生素抗性基因， 从而有利于转化子在高温下的筛选。 0026 4. 发明了用于本发明的转化方法的改良 TTE 培养基。 0027 5. 制 备 了 用 于 破 坏 hisG 基 因 的 质 粒， 利 用 本 发 明 的 转 化 方 法 实 现 了 T.tengcongensis MB4 中 hisG 基因的破坏。 附图说明 0028 图 1 为 T.tengcongensis MB4 染色体复制原点 (ori Tte) 的序列表。 0029 图 2 为 T.tengcongensis MB4 磷酸乙酰基转移酶启动子 。
30、(Ptte1482)( 下划线部分 ) 和卡那霉素抗性基因 (KanR)( 非下划线部分 ) 的序列表。 0030 图 3 为 pHT3101 的物理图谱。 0031 图 4 为本发明的质粒 pBFL01 的构建示意图。 0032 图 5 为本发明的质粒 pBFL01 的电泳图， 其中质粒经 EcoR I 酶切。 0033 图 6 为 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 基因的启动子启动卡那霉素抗性基因 表达的验证结果， 在图中， A ： 含有质粒 pHT3101 的 E.coli JM109 在含有 100g/mL 氨苄青 说 明 书 CN 102477442 B 6。
31、 4/10 页 7 霉素的 LB 培养基上能生长 ； B ： 含有质粒 pHT3101 的 E.coli JM109 在含有 100g/mL 氨苄 青霉素和卡那霉素的 LB 培养基上不能生长 ； C ： 含有质粒 pBFL01 的 E.coli JM109 在含有 100g/mL 氨苄青霉素和卡那霉素的 LB 培养基上能生长。 0034 图 7 为转化子筛选， 在图中， A ： 质粒 pBFL01 转化 T.tengcongensisMB4 后在含 有 400g/mL 卡那霉素固体 TTE 培养基中有菌落出现 ； B ： T.tengcongensis MB4 在含 有 400g/mL 卡那霉。
32、素固体 TTE 培养基中无菌落出现 ； C ： T.tengcongensis MB4 在不含 400g/mL 卡那霉素固体 TTE 培养基中形成菌膜。 0035 图8为菌落PCR方法验证转化子(扩增卡那霉素抗性基因)， 其中PCR的模板分别 为 ： 112 ： 转化子的总DNA， 包括染色体和质粒DNA， 13 ： T.tengcongensis MB4染色体DNA， 14 ： Marker。 0036 图 9 为显示本发明的转化方法中电击电压与转化效率的图。 0037 图 10 为利用质粒 pTTH01 破坏 hisG 基因示意图。 0038 图 11 为破坏 T.tengcongensi。
33、s MB4 的 hisG 基因的验证结果， 其中 1， 2， 3， 4 ： hisG 破坏菌株染色体作模板的PCR扩增结果 ； 5 ： 野生菌株染色体 作模板的PCR扩增结果 ； 6 ： 质 粒 pTTH01 作模板的 PCR 扩增结果 ； 7 ： 1kb ladder。 0039 图 12 为 SEQ ID ： 3-10 的序列， SEQ ID No ： 3、 SEQ ID No ： 4 为进行 PCR 扩增 T.tengcongensis MB4 染色体复制起点相关序列的上下游引物 ； SEQ ID No ： 5、 SEQ ID No ： 6 为进行 PCR 扩增 T.tengcongen。
34、sis MB4 染色体上 tte1482 的启动子区域的上下游引物 ； SEQ ID No ： 7、 SEQ ID No ： 8为PCR扩增编码热稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因 (kanR) 的上下游引物 ； SEQ ID No ： 9、 SEQ ID No ： 100 为 PCR 扩增 SEQ ID No ： 11 的上下游 引物。 0040 图 13 为 SEQ ID ： 11-13 的序列， SEQ ID ： 11 为 T.tengcongensis MB4 染色体上包 括 hisG 及该基因左侧基因的部分序列， 即用于破坏 hisG 的左端同源序列 ； SEQ ID ： 12、。
35、 SEQ ID ： 13 为 PCR 扩增 SEQ ID No ： 14 的上下游引物。 0041 图 14 为 SEQ ID ： 14-16 的序列， SEQ ID ： 14 为 T.tengcongensis MB4 染色体上包 括 hisG 及该基因右侧基因的部分序列， 即用于破坏 hisG 的右端同源序列 ； SEQ ID ： 15、 SEQ ID ： 16 为验证 hisG 破坏株的上下游引物。 具体实施方式 0042 在本发明的第一个方面， 提供了一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 MB4(T. tengcongensis MB4) 的 质 粒 ( 以 下 简 称 为 “本 发 明 的 。
36、质 粒” )，所 述 质 粒 包 含 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子序列， 以及与所述启动子序列可操作地连接的 具有编码热稳定性蛋白酶的抗生素抗性基因。 0043 本发明中所述的具有热稳定性的抗生素是指能耐受 60 -75左右的温度的抗 生素。 在本发明中， 用于转化质粒中的抗生素基因不受限制， 只要其能够在适于质粒转化的 转化子表达的条件下能够表达能耐受 60 -75温度的抗生素， 诸如卡那霉素、 氯霉素等， 因为只有耐受该温度才能够达到筛选腾冲嗜热厌氧杆菌转化子的目的。 0044 在本发明的质粒的另一个优选实施方案中， 所述抗生素抗性基因为具有热稳定 。
37、性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因 kanR。由于在众多的抗生素中， 卡那霉素在较高 说 明 书 CN 102477442 B 7 5/10 页 8 的温度下能有效存在， 这也使其成为用于嗜热菌研 究的常用抗生素 ； 加之， 与之相应的热 稳定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因 (kanR) 也开发成功。卡那霉素及其相应的 抗性基因也因此成为研究嗜热菌的理想工具之一 (Lasa 等人， 1992， Mol.Microbiol.， 11 ： 1555-1564 ； Mather 等人， 1992， Appl.Environ.Microbiol.， 58 ： 421-425)。同样， 卡那霉素 及。
38、其相应的抗性基因也可用于对 T.tengcongensis MB4 的研究工作。 0045 在本文中，“可操作地连接” 是指与启动子序列连接的基因可以在适于表达该基因 的条件下表达。另外， 根据需要本发明的质粒还可以任选地包含调控序列以调节该基因的 表达。 0046 在本发明的质粒的一个实施方案中， 所述质粒以质粒 pHT3101 为骨架， 并包含 T.tengcongensis MB4 染色体复制起点序列。在本发明的质粒中， T.tengcongensis MB4 染 色体复制起点序列(ori Tte)见序列表中的SEQID No ： 1， T.tengcongensis MB4的tte14。
39、82 的启动子序列见序列表中 SEQ IDNo ： 2 中的划线部分。质粒 pHT3101 的物理图谱已公开， 具 体参见 Yu 等人， 2000， Current microbiology， 40 ： 123-127。 0047 该质粒的构建方法可以采用以下方式进行 ： 以质粒 pHT3101 为骨架， 将 T.tengcongensis MB4 染色体复制起点序列 ori Tte 插入质粒 pHT3101 多克隆位点的 EcoR I 和 Xba I 位点之间， 再将 T.tengcongensis MB4 的 tte1482 的启动子 Ptte1482 和卡那霉 素抗性基因 kanR构建的。
40、融合基因 ( 见 SEQ IDNo ： 2) 插入质粒 pHT3101 多克隆位点的 Xba I 和 Pst I 位点之间。 0048 作为示例性的实施例， 本发明提供了如上所述基于 pHT3101 构建的质粒， 即 pBFL01。在本发明的一个优选实施方案中， 还提供了质粒 pBFL01 的具体构建步骤 ： 0049 1) 以 T.tengcongensis MB4 染色体为模板， SEQ ID No ： 3、 SEQ ID No ： 4 分别为上 下游引物进行PCR扩增T.tengcongensis MB4染色体复制起点相关序列(见SEQ ID No ： 1) ； 2)用EcoR I和Xb。
41、a I分别酶切所扩增的PCR产物和质粒pHT3101， 回收目的片段， 将目的片 段进行连接而得到质粒 pHT3101O ； 3) 以 T.tengcongensis MB4 染色体为模板， SEQ ID No ： 5、 SEQ ID No ： 6分别为上下游引物进行PCR扩增T.tengcongensis MB4染色体上tte1482的 启动子区域 ； 4) 以质粒 pMK18 为模板， SEQ ID No ： 7、 SEQ ID No ： 8 为引物扩增编码热稳定 性的卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因(kanR) ； 5)以上述两个PCR产物为模板， SEQ ID No ： 5 和 SEQ 。
42、IDNo ： 8 为上下游引物通过 fusion PCR 把上述的 PCR 产物融合成由 tte1482 的启 动子调控kanR表达的基因(见SEQ ID No ： 2) ； 6)用Xba I和PstI分别酶切质粒pHT3101O 和融合PCR产物， 回收目的片段， 将两个目的片段连接而得到能在T.tengcongensis MB4中 进行复制和表达抗性基因的质粒 pBFL01。 0050 在本发明的质粒的另一个实施方案中， 本发明的质粒以质粒 pBluescript KSII+( 购自 Stratagene 公司， La Jolla， .CA， USA) 为骨架， 并包含 T.tengcon。
43、gensis MB4 染色体上 hisG 的左右相邻的 1.0 2.0kb DNA 片段， 此段 DNA 的具体大小和片段以能够插 入至质粒中并可以整合至 T.tengcongensis MB4 的基因组中为度， 根据本发明的介绍其选 择是显而易见的。该质粒可用于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 中组氨酸 合成操纵子中的 hisG 基因， 例如该质粒为 pTTH01， 其构建方法可参见实施例 7。当然， 根 据本发明的介绍， 本领域技术人员能够制备出各种其他的质粒用于破坏腾冲嗜热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 中的其他目的基因， 诸如海藻糖磷酸化酶。
44、基因和海藻糖合成酶基因 说 明 书 CN 102477442 B 8 6/10 页 9 等与该菌的热适应性相关基因。 0051 在另一个方面， 本发明提供了一种用于转化腾冲嗜热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 的 TTE 培养基， 所述 TTE 培养基的配方为以每升计包含下列成分 ： 酵母浸出物 2.0 2.5g， 蛋白胨2.57.5g， 氯化钠1.53.0g， 硫酸铵1.03.0g， 磷酸二氢钾0.10.5g， 磷酸氢二钾 0.1 0.5g， L- 半胱氨酸盐酸盐 0.2 0.8g， 可溶性淀粉 7.5 15g， 1刃天 青溶液 0.8 1.2ml， 硫代硫酸钠 0.3 0.。
45、8g， pH 值为 7.5( 具体参见实施例 1)。 0052 在实施本发明时， 当 TTE 培养基以液体培养基使用时， 通过如下示例性的步骤制 备 ( 溶液总体积以一升计 ) ： 1) 用适量去离子水将称量好的酵母浸出物、 蛋白胨、 氯化钠、 硫酸铵、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾溶解 ； 2) 将称量好的可溶性淀粉倾入少量的水中并搅拌 成糊状后， 缓慢地将淀粉悬液倾入适量的沸水， 并继续煮沸510分钟后， 将淀粉溶液转移 至 1) 所配的溶液中 ； 3) 向上述溶液中加入 1ml 的 1刃天青溶液， 并煮沸至溶液 成无色， 将溶液移至无氧环境中， 并冷却至 60以下 ； 4) 加入 0.5g 。
46、L- 半胱氨酸盐酸盐并混匀， 调 pH值至7.5 ； 5)在无氧的环境中， 将溶液分装至厌氧管或厌氧瓶中 ； 6)灭菌(121、 30min) 后， 备用。7) 在接种之前， 加入 50硫代硫酸盐溶液至其终浓度为 0.5wt。 0053 当本发明的 TTE 培养基以固体培养基使用时， 通过如下示例性的步骤制备 ： 固体 TTE 培养基配制步骤与液体 TTE 培养基的配制步骤基本相同， 区别在液体 TTE 培养基分装 之前， 向厌氧管中加入Gelrite Gellum Gum至终浓度为0.81.2wt， 其它步骤同液体 TTE 培养基的配制。 0054 在另一个方面， 本发明提供了一种转化腾冲嗜。
47、热厌氧杆菌 T.tengcongensis MB4 的方法， 该方法包括以下步骤 ： 0055 1) 菌种活化 ： 将保存于 -70的 T.tengcongensis MB4 菌体悬液于 60厌氧滚管 培养 60 72h ； 挑取较大的菌落接入液体 TTE 培养基中， 于 75培养至 OD600为 0.8 1.2。 0056 2) 菌体培养 ： 在液体 TTE 培养基中以所述液体 TTE 培养基体积的 1 2接种步 骤 1) 中活化的密度为 106细胞 /ml 的 T.tengcongensis MB4， 并在 75下培养 12 18h 至 菌体密度为 1 2108细胞 /ml ； 0057 。
48、3) 菌体转化 ： 用本发明的质粒对步骤 2) 中得到的培养物使用电击转化法或自然 感受态法进行转化获得转化子 ； 0058 4) 转化子筛选 ： 将步骤 3) 中得到的转化子在 400 600g/ml， 优选 400g/ml 含具有热稳定性的抗生素的固体 TTE 培养基在 55 60， 优选 60下温育 60 72h 进行 转化子筛选， 在所述固体TTE培养基上生长的为T.tengcongensis MB4转化子， 其中所述具 有热稳定性的抗生素与步骤 3) 中使用的质粒所包含的抗生素抗性基因相对应， 例如当质 粒中含有卡那霉素氨基糖苷磷酸转移酶基因 kanR时， 则使用卡那霉素。 0059。
49、 在本发明的转化方法中， T.tengcongensis MB4 菌种活化的方法是本领域中公知 的， 例如可以采用以下的具体步骤 ： 将以 20甘油保存于 -70的菌体悬液用无菌水稀释 104倍后， 取 100L 稀释液加入含有 7ml 融化后固体 TTE 培养基的亨盖特厌氧管中并混匀 后， 亨盖特厌氧管中培养， 于 60培养 60 72h。挑取较大的菌落接入液体 TTE 培养基中， 于 75培养至 OD600为 0.8 1.2。 0060 在本发明的转化方法的一个优选实施方案中， 当使用电击转化法时， 使用的电击 电压为 1.8 3.0kv， 优选 1.8kv ； 电击时间为 ： 4 6ms。在本发明中， 从下面的实施例 5 中 说 明 书 CN 102477442 B 9 7/10 页 10 可以看出， 在较低的电击电压 ( 如 1.8kv) 的转化子数明显多于较高电压时的转化子数， 即 转化效率与电击电压成负相关性。因此， 优选 1.8kv 的电压来进行转化。 0061 在本发明的转化方法的另一个优选实施方案中， 当使用自然感受态法时无需厌 氧。