技术领域
本发明涉及畜牧业技术领域，具体地说是一种筛查牛退化性轴突病携带者 的方法及其试剂盒。
背景技术
退化性轴突病(Degenerative axonopathy)是牛的一种常染色体单基因控制 的隐性遗传病。通过全基因组关联分析和单倍体型图最终确定是由位于牛16号 染色体上的线粒体融合素2(MFN2)基因的一个点突变引起的(C， Reichart U，Seuberlich T，et al.An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene (MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle.PLoS One，2011，6(4)：e18931)。等对44头患有退化性轴突病牛的DNA测 序分析，结果都发现有一个共同的同义突变位点，SNP c.2229C＞T，它位于MFN2 基因第18个外显子内。c.2229C＞T突变影响了一个CpG二核苷酸，在哺乳动物 中此位点有相当高的突变频率。c.2229C＞T突变位点位于一个潜在的外显子剪 接增强子(ESE)基序内。T的突变消除了剪接因子ASF/SF-2一个潜在的结合 位点，同时，增强了与辅助因子剪接蛋白SC35结合的能力。c.2229C＞T突变影 响MFN2基因转录的剪接，除了产生野生型转录本外，又产生了一个保留第18 个内含子的新转录本。新转录本的第18个内含子前端提前引入了终止密码子， 导致新转录本相对于野生型转录本缺少最后22个密码子的开放阅读框，表达的 MFN2蛋白相对于野生型转录本缺少一个C末端。
患有退化性轴突病的牛在1～1.5月龄时，四肢开始显示出不断加重的运动 失调，而且后肢行动不稳键比前肢表现得更为突出。随着这些症状的加重，最 终导致牛呈躺或斜靠体态。神经病理学发现受影响牛明显表现出两侧对称的轴 突退化，使得背侧脊髓小脑束和薄束的轴突密度降低(Syring C，C. Oevermann A，Pfister P，Henke D，et al.Degenerative axonopathy in a Tyrolean Grey calf.J Vet Intern Med，2010，24：1519-1523)。许多患病的牛在8～10月龄被 淘汰，给养牛业生产带来了巨大的经济损失。
经系谱记录分析发现，这个突变位点最终可以追溯到1972年以前。üller等经研究发现，该病是由MFN2基因第20个外显子的一个碱基突变引起的 (C，Reichart U，Seuberlich T，et al.An unusual splice defect in the mitofusin 2 gene(MFN2)is associated with degenerative axonopathy in Tyrolean Grey cattle.PLoS One，2011，6(4)：e18931)。MFN2基因编码线粒体融合素2蛋 白，属于一种线粒体膜蛋白。野生型的MFN2编码757个氨基酸，它是锚定横跨 在线粒体膜外的一种蛋白，蛋白的绝大部分位于细胞质内，包括N末端和C末 端。该蛋白可以形成同源和异源二聚体。线粒体是一个非常有活力的细胞器， 能够持续的融合和裂变。而MFN2介导的二聚化是线粒体的圈合和融合过程中 一个必不可少的步骤。此外，MFN2也存在于内质网，并且在线粒体和内质网 膜圈合过程中也是必需的。有报道认为，人的轴突神经病进行性神经性腓骨肌 萎缩2A2【Charcot-Marie-Tooth disease-2A2(CMT2A2)】是由于MFN2基因突 变引起的(Verhoeven K，Claeys KG，Züchner S，et al.MFN2 mutation distribution and genotype/phenotype correlation in Charcot-Marie-Tooth type 2.Brain， 2006，129：2093-2102；Calvo J，Funalot B，Ouvrier RA，Lazaro L，Toutain A，et al. Genotype-phenotype correlations in Charcot-Marie-Tooth disease type 2 caused by mitofusin 2 mutations.Arch Neurol，2009，66：1511-1516)。在具有轴突神经病进 行性神经性腓骨肌萎缩2A2的病人中，已报道大约有60种由于MFN2突变可引 起蛋白质改变，病人表现轴突退化的特征，进而影响到了具有长轴突的外周神 经元。在小鼠模型中，MFN2突变引起运动神经严重的轴突退化和损害线粒体 的融合，进而导致神经元突起中线粒体分布不均匀。然而，线粒体的融合怎样 影响神经元融合和轴突生存的机理仍然是不清楚的。一种假说是线粒体融合缺 陷导致了线粒体DNA在细胞器间分布不规律进而导致了线粒体DNA损失和氧 化磷酸化的破坏。损伤的线粒体变得形状不规则并且出现运动失调，从而导致 了轴突内线粒体积聚。
牛退化性轴突病是常染色体单基因突变控制的隐性遗传病，所以仅仅通过 系谱分析来判定是否为退化性轴突病携带者是不准确的，而且只是群体上的推 断，对单头牛而言，其可靠性不强。因此，通过分子手段并且结合系谱分析开 发一个简单、快速、可靠性强的检测携带者试剂盒，对于牛分子育种来说具有 重要的实践意义，可以大大减少养牛业的经济损失。
限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，是利用特异设 计的PCR引物扩增目的模板，对PCR扩增片段进行酶切处理，以检测特定位 点碱基突变、插入或缺失等多态性。其基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩 增产物再用特异性内切酶酶切成不同大小片段的DNA，然后进行凝胶电泳检 测。由于不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片 段条带，直接可以从凝胶图上分辨出来。方法简便，分型时间短。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种筛查牛退化性轴突病 携带者的方法及其试剂盒。
本发明的技术方案是按以下方式实现的，该一种筛查牛退化性轴突病携带 者的方法及其试剂盒：
本发明目的一是利用PCR-RFLP技术，解决现有技术的不足，设计一对筛 查牛退化性轴突病携带者的专用引物。筛查退化性轴突病携带者的专用引物对 命名为MFN2F和MFN2R。
本发明目的二是提供一种筛查退化性轴突病携带者的方法。其方法是利用 待测牛的DNA为模板，用发明的专用引物对MFN2F和MFN2R进行PCR扩 增，然后对PCR产物进行回收，用特异性限制性内切酶TspRI进行酶切，对 酶切后的产物进行凝胶检测，根据凝胶结果进行判定。如果酶切后凝胶DNA 样品片段大小为307bp的为正常牛；DNA片段为307bp、225bp和82bp的检 测牛为退化性轴突病携带者；DNA片段为225bp和82bp的检测牛为患有退化 性轴突病牛。
待测牛DNA样品来源丰富且操作简单，可以从牛新鲜或冷冻的血液、精 液、组织样品中提取。
一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法，以待测牛的基因组DNA为模板， 设计上游引物和下游引物对其进行PCR扩增反应，然后回收PCR扩增片段，用 FastDigest限制酶TspRI进行酶切，在酶切反应体系酶切后进行凝胶检测，酶切 后凝胶检测酶切DNA片段为307bp的待测牛为正常牛；酶切后DNA片段为 307bp、225bp和82bp的检测测牛为退化性轴突病携带者；酶切后DNA片段为 225bp和82bp的检测牛为患退化性轴突病牛。
一种筛查牛退化性轴突病携带者所设计的PCR扩增引物，根据NCBI中 MFN2基因序列设计上游引物MFN2F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物MFN2R 序列为：SEQ ID NO.2。
PCR扩增反应采用25μl PCR扩增反应体系为：模板DNA(100ng/μl) 1μl，上游引物MFN2F、下游引物MFN2R各(10μmol/L)0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水(ddH2O)补至25μl。
PCR扩增反应条件为：94℃变性4min；然后94℃变性30s，60℃退火30s， 72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；4℃保存。
酶切反应体系采用15μl TspRI酶切反应体系为：PCR扩增产物5μl；10× FastDigest缓冲液1μl；FastDigest限制酶TspRI 0.5μl；ddH2O 8.5μl，酶切反应 条件为：65℃消化30min。
酶切片段用质量浓度为3.0～4.0％琼脂糖凝胶电泳。
一种筛查牛退化性轴突病携带者的试剂盒，该试剂盒是：上、下游引物 (10μmol/L)；2×Taq PCR MasterMix；10×FastDigest缓冲液；FastDigest限 制酶TspRI；双蒸水(ddH2O)；50bp DNA Ladder Marker中的一种以上数量的 试剂。
25μl PCR反应体系包括：DNA(100ng/μl)1μl，上，下游引物(10μmol/L) 各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，双蒸水(ddH2O)补至25μl。
25μl反应体系的PCR程序：94℃变性4min；然后94℃变性30s，60℃退 火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；4℃保存。
15μl酶切反应体系：PCR扩增产物5μl；10×FastDigest缓冲液1μl； FastDigest限制酶TspRI 0.5μl；ddH2O 8.5μl，酶切反应条件为：65℃消化30min。
本发明目的三是提供一种筛查牛退化性轴突病携带者的试剂盒。
试剂盒包括以下试剂：
其中2×Taq PCR MasterMix(含染料)是由Taq DNA Polymerase(0.05 units/μl)、MgCl2(4mM)、dNTPs(0.4mM)构成。
(1)一对筛查牛退化性轴突病携带者的专用引物： 上下游引物MFN2F和下游引物MFN2R(10μmol/L)；
(2)2×Taq PCR MasterMix；
(3)1U/μL FastDigest TspRI；
(4)10×FastDigest缓冲液；
(5)ddH2O；
(6)10％SDS(十二烷基磺酸钠)；
(6)50bp DNA Ladder Marker。
本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
本发明提供了筛查牛退化性轴突病携带者所用的一对专用引物及方法。本 发明是根据退化性轴突病患病牛MFN2基因(NCBI参考序列NC_007314.3) g.24029C＞T突变，产生了TspRI限制性酶切位点的原理，从而建立起筛查牛退 化性轴突病携带者的PCR-RFLP方法。通过分析后设计针对含有突变位点的引 物，特异性扩增出307bp的牛MFN2基因含有上述位点的片段(扩增片段中只 含有突变位点处的一个TspRI酶切位点)，再经限制性内切酶TspRI酶切后，凝 胶电泳后产生307bp的DNA条带为正常牛；DNA片段为307bp、225bp和82bp 的检测牛为退化性轴突病携带者；DNA片段为225bp和82bp的检测牛为退化性 轴突病牛。
本发明筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、可靠性高。同时根据筛查方 法开发出相应地检测试剂盒，使操作更加简单化、快速、灵敏、可靠性强，一 般生产中常规实验室都有条件完成，这一发明可以早期淘汰退化性轴突病携带 牛，可以大大减少养牛业的损失，在牛的分子育种中应用前景广阔，能够产生 可观的经济效益和良好的社会效益。
附图说明
附图1是本发明的PCR产物扩增的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；
附图2是本发明的MFN2基因分型的3％琼脂糖凝胶电泳图；图中Maker 1： 空白对照；Maker 2：正常牛；Maker 3：携带牛；Maker 4：患病牛。
附图3是本发明的实施例二的正常牛MFN2基因测序图；
附图4是本发明的实施例二的携带牛MFN2基因测序图；
附图5是本发明的实施例二的患病牛MFN2基因测序图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试 剂盒作以下详细说明。
实施例1
1.采用酚-氯仿抽提法从牛血液中提取基因组DNA，包括荷斯坦奶牛 DNA80头，鲁西黄牛63头，瑞士褐牛18头。设计特异性引物用于扩增牛MFN2 基因片段，所用的引物序列为：
上游引物MFN2F序列为：SEQ ID NO.1：
5′-AAGCCCGAGTTTATTTCC-3′
下游引物MFN2R序列为：SEQ ID NO.2：
5′-GCACTGTCCTCCCCACA-3′
2.根据上述检测牛退化性轴突病携带者的试剂盒，利用以下步骤扩增牛 MFN2基因片段，扩增的片段用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图1所示。
(1)PCR反应体系：DNA(100ng/μl)1μl，上，下游引物(10μmol/L)各 0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水(ddH2O)补至25μl。
(2)PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72 ℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；4℃保存。
(3)扩增产物的电泳检测：5μlPCR扩增产物，加上上样缓冲液1μl。电 泳检测。检测结果为，1个泳道为空白对照，无扩增产物；2-6个泳道为牛DNA 样品检测结果，均扩增出单一的条带，大小为307bp，与预期的片段大小一致。
3.PCR产物的酶切与产物检测
(1)15μl酶切反应体系：PCR扩增产物5μl；10×FastDigest缓冲液1μl； FastDigest限制酶TspRI 0.5μl；ddH2O 8.5μl。65℃，酶切30min。
(2)在酶切产物中加入SDS(十二烷基磺酸钠)，在反应体系中的终浓度 为0.1％，65℃，酶切10min。
(3)凝胶电泳检测：用质量浓度为3％凝胶对酶切后DNA 15μl进行电泳 检测；电压100V；时间50min。
4.基因分型与结果分析：正常个体和携带者个体的基因分型结果如下表所 示。
表1.牛MFN2基因分型结果
凝胶电泳后发现80头荷斯坦牛和63头鲁西黄牛均产生307bp的DNA条 带，表明是正常牛；18头瑞士褐牛中有17头的DNA片段为为307bp，表明为 正常牛；其中有1头牛存在307bp、225bp和82bp三条条带，表明检测牛为退 化性轴突病携带者。正常个体和携带者个体的MFN2基因分型结果如图2所示。
实施例2
1.采用酚-氯仿抽提法从牛血液中提取18头灰牛基因组DNA。设计特异 性引物用于扩增牛MFN2基因片段，所用的引物序列为：
上游引物序列为：SEQ ID NO.1：
5′-AAGCCCGAGTTTATTTCC-3′
下游引物序列为：SEQ ID NO.2：
5′-GCACTGTCCTCCCCACA-3′
2.根据上述检测牛退化性轴突病携带者的试剂盒，利用以下步骤扩增牛 MFN2基因片段，扩增的片段用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如 图1所示。
(1)PCR反应体系：DNA(100ng/μl)1μl，上，下游引物(10μmol/L)各 0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，双蒸水补至25μl。
(2)PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72 ℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；4℃保存。
(3)扩增产物的电泳检测：5μlPCR扩增产物，加上上样缓冲液1μl。电 泳检测。检测结果为，1个泳道为空白对照，无扩增产物；2-6个泳道为牛DNA 样品检测结果，均扩增出单一的条带，大小为307bp，与预期的片段大小一致。
3.PCR产物的酶切与产物检测
(1)15μl酶切反应体系：PCR扩增产物5μl；10×FastDigest缓冲液1μl； FastDigest限制酶TspRI 0.5μl；ddH2O 8.5μl。65℃，酶切30min。
(2)在酶切产物中加入SDS，在反应体系中的终浓度为0.1％，65℃，酶 切10min。
(3)凝胶电泳检测：用质量浓度为3％凝胶对酶切后DNA 15μl进行电泳 检测；电压100V；时间50min。
4.基因分型与结果分析：正常个体和携带者个体的基因分型结果如下表2 所示。
共有13头牛酶切后DNA片段为307bp，为正常牛；1头牛DNA片段为 307bp、225bp和82bp，为退化性轴突病携带者；1头牛DNA片段为225bp和 82bp，表明患有退化性轴突病。
表2.牛MFN2基因分型结果
5.利用扩增的PCR产物直接测序。13头牛的MFN2基因片段测序的峰图 为单峰，且扩增片段的第222位碱基为C，表明MFN2基因型是CC型，为正 常牛(图3)SEQ ID NO.3；MFN2基因扩增片段的第222位碱基测序峰图为套 峰，测序碱基为C SEQ ID NO.4或者T SEQ ID NO.5，表明MFN2基因型是 CT型，为携带牛(图4)；1头牛的MFN2基因片段测序峰图为单峰，且扩增 片段的第222位碱基为T，表明MFN2基因型是TT型，为患病牛(图5)SEQ ID NO.6；基因分型结果与测序结果一致。