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1、(10)申请公布号 CN 102433290 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102433290 A *CN102433290A* (21)申请号 201210012037.7 (22)申请日 2012.01.16 CCTCC NO ： M 2011465 2011.12.12 C12N 1/20(2006.01) C12P 13/10(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品科学与技术国家 重点实验室 (72)发明人 张涛 江波 王莹 缪铭 沐万孟 (74)专。
2、利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜 氨酸的方法 (57) 摘要 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合 成瓜氨酸的方法， 属于食品生物技术领域。本 发明涉及一株从土壤中筛选而来的粪肠球菌 （Enterococcusfaecalis） SK23.001， 已保藏于中 国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCCNO ： M2011465， 以此菌为发酵菌株， 以精氨酸为诱导 物、 以葡萄糖为碳源、 酵母膏和蛋白胨为氮源等组 成发酵培养基， 发酵生产瓜氨酸， 或通过发酵获得 具有精氨酸脱亚氨酶酶活的静息。
3、细胞菌体并添加 到 5%-20% 精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸， 经检测 可知， 转化率可达80%以上。 本发明方法生产的瓜 氨酸安全可靠， 是一种很有市场潜力的功能性产 品， 被广泛的应用于食品、 化妆品、 医药等行业。 本 发明能高效地生产瓜氨酸， 适于进行大规模生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102433294 A1/1 页 2 1.一株产瓜氨酸的菌株， 其分类命名为粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） SK23.001， 已保藏于中国典型培养物保。
4、藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011465。 2. 一种用权利要求 1 所述 CCTCC NO ： M 2011465 菌株生物合成瓜氨酸的方法， 其特征 在于， 以 CCTCC NO ： M 2011465 为出发菌株， 通过发酵生产瓜氨酸或通过发酵获得具有精氨 酸脱亚氨酶活的静息细胞， 然后作用于精氨酸转化合成瓜氨酸， 步骤如下 ： （1） 种子培养 种子培养基 ： L-Arg 1-20g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 葡萄糖 5-100g/L， 无机 氮源 1.0-10.0g/L， 调 pH4.0-7.5， 去离子水配制 ； 种子培养条件 。
5、： CCTCC NO ： M 2011465 菌株于 30-37、 100-300rpm 的振荡速度下在种 子培养基中培养 5-30h 活化该菌株 ； （2） 发酵培养 发酵培养基 ： L-Arg 1-100g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 葡萄糖 5-100g/L， 无 机氮源 1.0-10.0g/L， 调 pH4.0-7.5， 去离子水配制 ； 发酵条件 ： 接种量 1%-10%， 30-37、 转速 180-500rpm 的条件下在发酵培养基中发酵 5-72h， 获得具有酶活的发酵液及湿菌体 ； （3） 发酵后处理 发酵液经冷冻离心后收集上清液获得含瓜氨酸的发。
6、酵液及含精氨酸脱亚氨酶湿菌体， 菌体用 0.1% 的生理盐水和 pH6.0 的 0.1mol/L 醋酸盐缓冲液清洗菌体， 得静息细胞用于进 行全细胞转化反应， 经检测转化率在 80% 以上 ； （4）静息细胞将精氨酸转化生产瓜氨酸 ： 底物精氨酸浓度 10-200g/L， 静息细胞量 0.1-10g/L， 在 pH4.0-8.0、 转化反应温度为 30-70、 转化反应时间 1-60h 的条件下转化制 得瓜氨酸 ； （5） 瓜氨酸的分离纯化 将发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂 D001， 进行瓜氨酸分 离纯化。 权 利 要 求 书 CN 102433290 A CN 10。
7、2433294 A1/3 页 3 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及能够生产瓜氨酸的一种从土壤中筛出的微生物菌株粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） SK23.001 及其培养发酵生产瓜氨酸及含有精氨酸脱亚氨酶的菌 体， 并将该菌体用于生物制备瓜氨酸的方法， 属于食品生物技术领域。 瓜氨酸广泛应用于食 品、 化妆品、 医药等行业。 背景技术 0002 瓜氨酸具有提高免疫系统功能， 维护关节运动的机能， 平衡正常的血糖水平， 含丰 富的抗氧化剂吸收有害的自由基， 帮助保持胆固醇的正常水平。它也可以使人的血管获得 松弛， 用于增强男。
8、性性功能， 以及治疗性功能障碍。 还可以维护健康的肺功能以及提高脑力 清晰度， 降低压力和克服沮丧情绪， 有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。 随着生物 技术和遗传工程研究的迅速发展， 生物化学制品市场也得到了持续增加， 世界年销售额高 达几十亿美元。因此对很多生物制品如酶类， 疫苗， 抗体等的保存受到越来越多的重视。瓜 氨酸清除羟基的功能得到了很好的利用， 研究表明瓜氨酸对 DNA 和酶具有抗羟基保护。瓜 氨酸作为抗氧化剂， 可以用于化妆品， 保健食品， 食品添加剂以及营养强化剂， 同时还可对 厌氧物质提供保护。 因此， 人们对瓜氨酸越来越重视， 并寄希望于开发出新型的功能食品和 功能药。
9、物。 0003 至今为止， 瓜氨酸的制造方法， 主要有四种。 0004 第一， 是从植物中提取的方法。来自天然， 但提取率和含量低。 0005 第二， 化学有机合成瓜氨酸的方法。该法可能会残留毒性物质， 安全性有待考量， 且生成物分离精制操作复杂。 0006 第三， 利用微生物酶法进行生产。酶法生产瓜氨酸即采用Streptococcus faecalis， Clostridium perfringens， Micrococcus pyogenes， Bacillus pyocyaneus等微 生物生产的精氨酸脱亚氨基， 用该酶由精氨酸生产瓜氨酸。 0007 第四， 发酵法进行生产。 发酵法的优。
10、点是成本低， 产量高， 产物的纯度高， 在产品的 生产过程中没有有毒物质的产生， 给产物后加工提供了方便， 降低了成本， 且适合大规模的 生产。 0008 国外在瓜氨酸方面的研究较多， 尤其是在日本、 美国和欧洲。 在瓜氨酸的制备方法 上， 国外主要采用发酵法和酶法生产， 分离纯化多数使用离子交换等常用的分离方法。 发明内容 0009 本发明的目的 ： 本发明在深入调查和研究了现有技术基础上， 并从土壤中筛出多 株生产瓜氨酸的菌株进行了研究， 最终筛选到一株能高产瓜氨酸的微生物。 0010 其二， 提供该菌株发酵生产或与精氨酸溶液的全细胞转化的方法， 以得到高的转 化率和较纯的瓜氨酸产品。 0。
11、011 再者， 提供一种瓜氨酸分离纯化与精制的方法， 以得到高纯度的瓜氨酸。 说 明 书 CN 102433290 A CN 102433294 A2/3 页 4 0012 本发明的技术方案 ： 本发明提供一种来源于土壤高产瓜氨酸的菌株， 是通过根据 一定法则的菌类学性质、 生物化学性质的分析和 16sRNA 序列的测定而得出其分类命名为 （Enterococcus faecalis） SK23.001。已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011465。 0013 利用该微生物 CCTCC NO ： M 2011465 为出发菌株， 通过发酵生产瓜氨酸或通。
12、过 发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶活的静息细胞， 然后作用于精氨酸转化合成瓜氨酸， 步骤如 下 ： （1） 种子培养 种子培养基 ： L-Arg 1-20g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 葡萄糖 5-100g/L， 无机 氮源 1.0-10.0g/L 以及加或不加少量无机盐等， 调 pH4.0-7.5 ； 种子培养条件 ： 菌株于 30-37、 100-300rpm 的振荡速度下在种子培养基中培养 5-30h 活化该菌株。 0014 （2） 发酵培养 发酵培养基 ： L-Arg 1-100g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 葡萄糖 5-100g。
13、/L， 无 机氮源 1.0-10.0g/L 以及加或不加少量无机盐等， 调 pH4.0-7.5 ； 发酵条件 ： 接种量 1%-10%， 30-37、 转速 180-500r/m 的条件下在发酵培养基中发酵 5-72h， 获得获得具有酶活的发酵液及湿菌体。 0015 （3） 发酵后处理 发酵液经冷冻离心后收集上清液含瓜氨酸的发酵液及具有精氨酸脱亚氨酶活的湿菌 体， 并用 0.1% 的生理盐水和 pH6.0 的 0.1mol/L 醋酸盐缓冲液清洗菌体， 得静息细胞用于进 行全细胞转化反应， 经检测转化率在 80% 以上。 0016 （4） 静息细胞将精氨酸转化生产瓜氨酸 ： 底物精氨酸浓度 10。
14、-200g/L， 静息细胞量 0.1-10g/L， 在 pH4.0-8.0、 转化反应温度为 30-70、 转化反应时间 1-60h 的条件下转化制 得瓜氨酸 ； （5） 瓜氨酸的分离纯化 将发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂 D001， 进行瓜氨酸分 离纯化。 0017 本 发 明 的 有 益 效 果 ： 本 发 明 涉 及 一 株 从 土 壤 中 筛 选 而 来 的 粪 肠 球 菌 （Enterococcus faecalis） SK23.001， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011465， 以此菌为出发酵菌株， 以精氨酸为。
15、诱导物、 以葡萄糖为碳源、 酵母膏 和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基， 发酵生产瓜氨酸， 或通过发酵获得具有精氨酸脱亚酶 酶活的静息细胞菌体并添加到 5%-20% 精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸， 经检测可知， 转化率 可达 80% 以上。本发明方法生产的瓜氨酸安全可靠， 是一种很有市场潜力的功能性产品， 被 广泛的应用于食品、 化妆品、 医药等行业。本发明能高效地生产瓜氨酸， 适于进行大规模生 产。 0018 生物材料样品保藏 ： 一株产瓜氨酸的菌株， 其分类命名为粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） SK23.001， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称 CCTCC， 地。
16、址 ： 中国武汉武汉 大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011465， 保藏日期 2011 年 12 月 12 日。 说 明 书 CN 102433290 A CN 102433294 A3/3 页 5 具体实施方式 0019 以下是 （Enterococcus faecalis） SK23.001 进行发酵生产瓜氨酸的实施例， 但本 发明的技术范围并不限于所列出的几个实例， 在不改变其要点的前提下， 可做各种改变进 行实施。另外， 本发明的技术范围延及均等的范围。 0020 实施例 1 SK23.001 菌株的发酵培养 在含葡萄糖 1%、 精氨酸 1.2%、 酵母膏 0.5%，。
17、 蛋白胨 0.5%， 无机氮源 0.1% 以及含或不含 少量无机盐， 调 pH6.0 的培养基中， 37， 190 rpm 的条件下培养 SK23.001 22h， 冷冻离心， 制得具有精氨酸酶活的静息细胞。 0021 实施例 2 转化反应 使用实施例 1 所得菌体按 1g/L 添加到含精氨酸质量浓度为 50g/L 的 100mM 醋酸缓冲 液 （HAc-NaAc、 pH6.0） 中， 在 37下进行转化反应， 合成瓜氨酸。 0022 实施例 3 瓜氨酸产量的测定 将实施例 3 中进行的反应液经灭酶 （TCA 沉淀） 、 稀释， 通过安捷伦液相色谱仪， 分别对 精氨酸、 瓜氨酸进行定量。 分析条件如下 ： 仪器型号 ： Agillent 1100， 色谱柱 ：（250*4.6） mm 5m ODS HYPERSIL， 柱温 ： 40。 0023 实施例 4 新型瓜氨酸产生菌的鉴定 将新型瓜氨酸生产菌送往中国典型培养物保藏中心测定该菌的形态特征、 生理生化特 性以及 16SrRNA 基因序列分析， 鉴定为 （Enterococcus faecalis） SK23-001。 0024 实施例 5 瓜氨酸的分离纯化 将转化所得的反应液经脱色后， 利用强酸性阳离子交换树脂 D001， 用不同浓度的氨水 进行洗脱， 得到纯化的瓜氨酸。 说 明 书 CN 102433290 A 。