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1、(10)申请公布号 CN 102433325 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102433325 A *CN102433325A* (21)申请号 201210014004.6 (22)申请日 2012.01.17 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 王幼平 蒋金金 王娟 杜坤 邵彦林 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 一种油菜种子 RNA 提取的方法 (57) 摘要 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一 种适于油菜种。
2、子的 RNA 提取方法， 该方法将热硼 酸盐提取缓冲液预热至 65 ； 再将油菜籽液氮速 冻研磨成粉后加入预热的上述提取缓冲液， 继续 研磨成匀浆 ； 孵育后用氯化钾沉淀蛋白， 再经离 心、 除杂等步骤得到总 RNA。本方法所提取油菜 籽总 RNA 质量完好、 没有明显降解现象， OD260/ OD280 和 OD260/OD230 均在 2.0 左右， 样品中没有 其它杂质如蛋白、 盐离子的污染， 产物获得率大于 40g/100mg， 符合 cDNA 文库构建的要求。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图。
3、 1 页 CN 102433329 A1/1 页 2 1. 一种油菜种子 RNA 的提取方法， 其特征在于包括下述步骤 ： 1） 将热硼酸盐提取缓冲液预热至 65； 所述热硼酸盐提取缓冲液成分为 ： 0.2M 十水合 硼酸钠， 30mM 乙二醇 - 双 -(2- 氨基乙醚 ) 四乙酸， 1%（w/v） 十二烷基硫酸钠， 1%（w/v） 脱 氧胆酸钠， 10mM 二硫苏糖醇 ,1%（v/v） 酞菁氧钒 ,2%（w/v） 聚乙烯吡咯烷酮 ； 2） 100 mg 油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入 1ml 预热的上述提取缓冲液， 继续研磨成匀 浆 ； 3） 将匀浆转至 1.5ml 离心管中， 42恒温摇床。
4、孵育 1.5h; 4) 向上述匀浆中加入 2M 氯化钾至终浓度 160mM 以沉淀蛋白， 5000rpm， 20min， 4离 心 ； 5） 转移上清至新的离心管后， 加入 8M 氯化锂至终浓度 2M， 冰浴过夜 ； 6） 次日， 10000rpm， 20min， 4离心， 弃上清， 沉淀用预冷的 2M 氯化锂洗涤， 10000rpm， 15min， 4离心， 弃上清 ； 7） 重复上述洗涤步骤 2-3 次 ； 8） 沉淀溶解于 250l 1TE 缓冲液， 10000rpm， 15min， 4离心以去除不溶杂质 ； 9） 转移上清至新管中， 加入 1/10 体积的 2M 醋酸钾， pH5.5，。
5、 冰浴 15min 后 10000rpm， 15min， 4离心 ； 10） 转移上清至新管， 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠， pH6.0 ； 2.5 倍体积的冰酒精、 2l 肝糖， -80静置 1-2h; 11) 13000rpm， 15min， 4离心， 沉淀用 70% 酒精洗涤后， 溶解于适量无 RNase 水 中， -80保存备用。 权 利 要 求 书 CN 102433325 A CN 102433329 A1/3 页 3 一种油菜种子 RNA 提取的方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种适于油菜种子的 RNA 提取方法， 利 用热硼酸盐法提取高。
6、质量、 高纯度的油菜籽总 RNA， 以满足新一代测序文库构建、 种子发育 相关基因的克隆、 表达分析及验证对 RNA 质量的要求。 背景技术 0002 油菜种子中蛋白质、 油脂、 纤维含量较高， 特别在成熟种子中更为严重， 而 RNA 含 量相对较低。此外种皮中富含色素、 单宁、 多酚等代谢产物， 这些物质的存在严重影响 RNA 提取的获得率， 而且会直接干扰随后的文库构建、 反转录等实验。因此如何提取完整性好、 纯度高的 RNA 是研究油菜种子发育、 油脂代谢调控相关基因克隆、 表达验证等实验的前提。 目前已有大量商品化的试剂盒应用于植物总 RNA 的提取， 如 Invitrogen 和 F。
7、ermentas 等知 名分子试剂公司的试剂盒， 其 RNA 提取质量完好， 但价格相对昂贵 ； Takara 的 RNA 提取试剂 盒价格适中， 但提取的 RNA 蛋白和盐离子含量均较高， 这些杂质的存在会影响文库构建的 效率， 很可能导致文库构建的失败， 仅能用于反转录等实验， 达不到文库构建的要求。不少 研究者进行了油菜籽 RNA 提取方法的探讨， 提出了 CTAB 法、 SDS 法等等， 所提取的 RNA 可成 功用于反转录等， 但是否可以应用于 cDNA 文库构建尚未有报道。 发明内容 0003 为了解决现有技术存在的问题， 本发明提供了一种新的方法， 通过热硼酸盐法提 取油菜籽总 。
8、RNA， 减少蛋白和盐离子污染， 避免其干扰 cDNA 文库的构建。 0004 本发明所述油菜种子 RNA 提取方法如下 ： 1） 将热硼酸盐提取缓冲液 0.2M 十水合硼酸钠， 30mM 乙二醇 - 双 -(2- 氨基乙醚 ) 四 乙酸 （EGTA） ， 1%（w/v）十二烷基硫酸钠 （SDS） ， 1%（w/v）脱氧胆酸钠， 10 mM 二硫苏糖醇 （DTT） ,1%（v/v） 酞菁氧钒 （IGEPAL CA-630） ,2%（w/v） 聚乙烯吡咯烷酮 （PVP-40） 预热至 65 ； 2） 100 mg 油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入 1ml 预热的提取缓冲液， 继续研磨成匀浆 ； 3）。
9、 将匀浆转至 1.5ml 离心管中， 42恒温摇床孵育 1.5h; 4) 向上述匀浆中加入 2M 氯化钾至终浓度 160mM 以沉淀蛋白， 5000rpm， 20min， 4离 心 ； 5） 转移上清至新的离心管后， 加入 8M 氯化锂 （LiCl） 至终浓度 2M， 冰浴过夜 ； 6）次日， 10000rpm， 20min， 4离心， 弃上清， 沉淀用预冷的 2M LiCl 洗涤， 10000rpm， 15min， 4离心， 弃上清 ； 7） 重复上述洗涤步骤 2-3 次 ； 8） 沉淀溶解于250l 1TE缓冲液 （10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA,pH， 8.0） ， 。
10、10000rpm， 15min， 4离心以去除不溶杂质 ； 9）转移上清至新管中， 加入 1/10 体积的 2M 醋酸钾 （Kac） （pH， 5.5） ， 冰浴 15min 后 说 明 书 CN 102433325 A CN 102433329 A2/3 页 4 10000rpm， 15min， 4离心 ； 10） 转移上清至新管， 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠 （NaAc） （pH， 6.0） 、 2.5 倍体积的冰 酒精、 2l 肝糖， -80静置 1-2h; 11) 13000rpm， 15min， 4离心， 沉淀用 70% 酒精洗涤后， 溶解于适量无 RNase 水 中， -。
11、80保存备用。 0005 本方法所提取油菜籽总RNA质量完好、 没有明显降解现象， OD260/OD280和OD260/ OD230 均在 2.0 左右， 样品中没有其它杂质如蛋白、 盐离子的污染， 产物获得率大于 40 g/100mg， 符合 cDNA 文库构建的要求。 附图说明 0006 图 1 ： 不同 RNA 提取方法的比较 A: 氯化锂 - 酚方法 ; B: Takara 公司提供试剂盒 ; C: 本发明热硼酸方法 ; D: Invitrogen 提供的试剂盒 ; M: marker DL2000。 0007 具体实施方式 ： 将同一批次的油菜籽用 4 种不同方法提取 RNA, 提取。
12、产物于 1% 琼脂糖凝胶上 60 伏 （V） 电泳 40 分钟， 结果如图 1 和表 1 所示。 0008 图 1 中 A1、 A2 为氯化锂 - 酚法提取的 RNA。提取方法是 ： 100g 油菜籽于液氮中研 磨成粉后转至含适量提取缓冲液 8M LiCl， 2%（w/v） - 巯基乙醇 的离心管中， 混匀后 4放置过夜， 次日 13000rpm 4离心 3 分钟， 沉淀用 70% （v/v） 酒精洗后晾干， 然后将沉淀 溶解于1ml溶解缓冲液0.5%(w/w)SDS,100mM NaCl, 25mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH7.6, 2%(w/w)- 巯基乙醇 中， 用。
13、饱和酚、 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 (25:24:1)、 氯仿 ： 异戊醇 (24:1) 各 抽提 1 次， 向最后的上层水相中加入 0.1 体积的 3M NaAc 和 1.5 体积的乙醇， -20静置 0.5 小时后 13000rpm 4离心 10 分钟， 沉淀用 70%（v/v） 酒精洗后晾干， 最后溶解于适量 RNase-free 水中。 0009 B1、 B2 为 Takara RNAiso Plus 提取的 RNA( 方法详见 Takara Code: D9108A)。 0010 C1、 C2 为本发明所用的热硼酸法提取产物， 具体操作是 1） 将热硼酸盐提取缓冲液 0.2M 十水合。
14、硼酸钠， 30mM 乙二醇 - 双 -(2- 氨基乙醚 ) 四 乙酸 （EGTA） ， 1%（w/v）十二烷基硫酸钠 （SDS） ， 1%（w/v）脱氧胆酸钠， 10 mM 二硫苏糖醇 （DTT） ,1%（v/v） 酞菁氧钒 （IGEPAL CA-630） ,2%（w/v） 聚乙烯吡咯烷酮 （PVP-40） 预热至 65 ； 本发明中 w/v 是指 g/mL; 2） 100 mg 油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入 1ml 预热的提取缓冲液， 继续研磨成匀浆 ； 3） 将匀浆转至 1.5ml 离心管中， 42恒温摇床孵育 1.5h; 4) 向上述匀浆中加入 2M 氯化钾至终浓度 160mM 以沉淀蛋。
15、白， 5000rpm， 20min， 4离 心 ； 5） 转移上清至新的离心管后， 加入 8M 氯化锂 （LiCl） 至终浓度 2M， 冰浴过夜 ； 说 明 书 CN 102433325 A CN 102433329 A3/3 页 5 6）次日， 10000rpm， 20min， 4离心， 弃上清， 沉淀用预冷的 2M LiCl 洗涤， 10000rpm， 15min， 4离心， 弃上清 ； 7） 重复上述洗涤步骤 2-3 次 ； 8） 沉淀溶解于250l 1TE缓冲液 （10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA,pH， 8.0） ， 10000rpm， 15min， 4离心以去除不。
16、溶杂质 ； 9）转移上清至新管中， 加入 1/10 体积的 2M 醋酸钾 （Kac） （pH， 5.5） ， 冰浴 15min 后 10000rpm， 15min， 4离心 ； 10） 转移上清至新管， 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠 （NaAc） （pH， 6.0） 、 2.5 倍体积的冰 酒精、 2l 肝糖， -80静置 1-2h; 11) 13000rpm， 15min， 4离心， 沉淀用 70% 酒精洗涤后， 溶解于适量无 RNase 水 中， -80保存备用。 0011 D1、 D2为Invitrogen公司RNA Reagent提取的RNA(方法详见Invitrogen Ca。
17、talog Number: 15596-026)。 0012 表 1 ： 不同 RNA 提取方法的纯度和得率 方法A260nm/A230nmA260nm/A280nm产量 (g/100mg) 氯化锂 - 酚方法1.5830.131.7520.1033.72.7 Takara 公司提供试剂盒1.0410.101.7120.1235.83.5 本发明热硼酸方法2.0820.112.0100.1543.94.8 Invitrogen 提供试剂盒1.9000.131.9400.1344.63.1 结合图 1 和表 1 可见氯化锂 - 酚方法提取法具有严重的 DNA 污染， Takara 公司提供 试剂盒提取产物中蛋白及盐离子污染均较为严重。热硼酸盐法和 Invitrogen 提供试剂盒 提取的获得率相当， 均明显高于前两种方法， 但热硼酸盐法提取的油菜籽 RNA 质量稍优于 Invitrogen 提供试剂盒， 完全没有蛋白和盐离子污染， 且价格便宜。 说 明 书 CN 102433325 A CN 102433329 A1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102433325 A 。