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1、(10)授权公告号 CN 102181448 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 102181448 B *CN102181448B* (21)申请号 201010580043.3 (22)申请日 2010.12.09 C12N 15/12(2006.01) (73)专利权人 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中 国 - 澳大利亚绵羊育种研究中心 地址 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 沙依巴克区克拉玛依东街 151 号 (72)发明人 刘明军 贺三刚 李文蓉 张雪梅 张宁 (74)专利代理机构 乌鲁木齐新科联专利代理事 务所 ( 有限公司 ) 65107 代理人 欧咏 JP 。
2、特开 2007-99677 A,2007.04.19, 全文 . 高爱琴等.绵羊FGF5基因SNP的生物信息学 分析 . 遗传育种 .2008, 第 44 卷 ( 第 5 期 ), 第 5-7 页 . 张宁等.绵羊Follistatin 基因表达及其结 构域的功能分析 .生物工程学报 .2010, 第 26 卷 ( 第 8 期 ), 第 1050-1056 页 . 高爱琴等 . 不同绵羊品种 FGF5 基因的多态 性分析 .畜牧兽医学报 .2006, 第 37 卷 ( 第 4 期 ), 第 326-330 页 . 高爱琴等 . 山羊 FGF5 基因 cDNA 分子克隆 及序列分析 .内蒙古大学。
3、学报 .2006, 第 37 卷 ( 第 2 期 ), 第 180-184 页 . (54) 发明名称 绵羊 FGF5 基因的克隆和慢病毒表达载体的 构建 (57) 摘要 本发明的绵羊 FGF5 基因的克隆和慢病毒表 达载体的构建， 确定绵羊 Noggin 基因编码区的全 序列 ； 将目的基因定向克隆于 pLEX 慢病毒表达载 体中， 获得 FGF5 和 FGF5S 基因慢病毒载体， 生产 重组病毒， 感染 293T 细胞， 验证重组蛋白的表达 ； 其中扩增外显子 1 的引物 ； 扩增 5-RACE 引物 ； 扩 增外显子 3 的引物 ； 扩增 3-RACE 的引物 ； 以外显 子3测序结果设。
4、计3-RACE引物 ： 其中以5-RACE和 3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物 ： 扩增 FGF5的全长cDNA序列， 测序确定FGF5和FGF5S的 全长序列 ； 克隆与测序 ： 将绵羊 FGF5 基因的扩增 产物进行回收纯化后， 利用 T4DNA 连接酶将其与 连接PMD-18T载体， 转化E.coli DH5 ； 利用氨苄 青霉素平板筛选， 并以 PCR 法和限制性酶切法鉴 定， 阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 武雪梅 权利要求书 2 页 说明书 9 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权。
5、局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 9 页 序列表 4 页 附图 1 页 1/2 页 2 1. 一种绵羊 FGF5 基因的慢病毒表达载体的构建方法， 其特征在于 ： 1) 确定绵羊 FGF5 基因编码区的全序列 ； 2) 将目的基因定向克隆于 pLEX 慢病毒表达载体中， 获得 FGF5 和 FGF5S 基因慢病毒载 体， 生产重组病毒， 感染 293T 细胞， 验证重组蛋白的表达 ； 其中扩增 FGF5 基因外显子 1 的引物 ： 上游引物 TTCCCCGAGGCTATGTCCAC， 下游引物 ATCCATTGACTTTGCCATCCG ； 其 中 扩 增 5-RACE 引 物。
6、 ： 以 外 显 子 1 测 序 结 果 设 计 5-RACE 引 物 ： 上 游 引 物 为 CLONTECH 的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 试 剂 盒 自 带，下 游 引 物 GSP1 ： CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC， NGSP1 ： GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT ； 其 中 扩 增 外 显 子 3 的 引 物 ： 上 游 引 物 CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下 游 引 物 CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT ； 其中扩增3-RACE的引物， 以外显子3测序结果设计3-RACE引物 ： 上游。
7、引物为CLONTECH 的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒自带， GSP2 ： CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC， NGSP2 ： GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC ； 其 中 以 5-RACE 和 3-RACE 测 序 结 果 设 计 扩 增 FGF5 全 长 的 引 物 ： 上 游 引 物 ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT，下 游 引 物 GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT GGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT ； 扩增 FGF5 的全长 cD。
8、NA 序列， 测序确定 FGF5 和 FGF5S 的全 长序列 ； 所述测序为 ： 将绵羊 FGF5 基因的扩增产物进行回收纯化后， 利用 T4 DNA 连接酶 将其与 PMD-18T 载体连接， 转化 E.coli DH5 ； 利用氨苄青霉素平板筛选， 并以 PCR 法和 限制性酶切法鉴定， 阳性克隆测序由上海生物工程公司完成， 测序鉴定后的质粒命名为 PMD-18T-FGF5 和 PMD-18T-FGF5S ； 其中构建表达载体及慢病毒的生产、 感染 293T 细胞、 验证重组 FGF5/FGF5S 表达为 ： a. 分别以 PMD-18T-FGF5、 PMD-18T-FGF5S 为模板，。
9、 利用特异性引物 F1， F2 和 FS1， FS2 进行 PCR 反应， F1 ： ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT， F2 ： GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGA CGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT， FS1 与 F1 相同， FS2 ： GGCCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGAC GTCGTATGGGTATCTGTAAATTTGGCTTAAC， 其反应体系为 ： 1uLPMD-18T-FGF5 或 PMD-18T-FGF5S， 2.5uL 10PCR buffer， 2uL 2.5mM dNTP， 。
10、10mM 上下游引物各 1uL， 1uLDMSO， 1U 宝生物 Pfu Taq酶， 用ddH2O调整至25uL ； PCR反应条件为 ： 944min， 9430s， 6430s， 721min， 35 个循环， 72 10min ； 取反应液 5uL 经琼脂糖凝胶电泳检测确认 ； 将绵羊 FGF5 基因的扩增 产物及pLex慢病毒载体同时进行Not I/Xho I双酶切， 分别回收纯化后的PCR产物和pLEX 载体， 利用 T4DNA 连接酶连接酶切后的 PCR 产物和 pLEX 载体， 转化 E.coli DH5 ； 利用氨 苄青霉素进行平板筛选， 并以PCR法和限制性酶切法鉴定测序， 。
11、新载体命名为pLEX-FGF5和 pLEX-FGF5S ； b.293T 细胞培养 ： 条件 37， 5的 CO2， 培养基采用 DMEM+10的胎牛血清， 在 10cm 细 胞培养皿中铺 2-2.5106个 293T 细胞， 第 2 天细胞在完全培养液中汇合度达到 70-80 ； c.Lipectamine 2000 脂质体转染 ： 加入 1.5ml 预热的 Opti-MEM 培养基后， 按下列比 例加入转染载体 pLEX-FGF5 或 pLEX-FGF5S 12ug、 包装质粒 pSPAX2 9ug、 包膜质粒 pMD2G 3.5ug、 轻轻混匀， 同时将 50ul 的脂质体加入到 1.5。
12、mlopti-MEM 培养基， 室温放置 5min 后， 将上述稀释好的 DNA 与脂质体混合， 置于室温孵育 20 分钟 ； 在此期间， 用 Opti-MEM 培养基 权 利 要 求 书 CN 102181448 B 2 2/2 页 3 清洗待转染细胞一次， 将脂质体和 DNA 复合物加入细胞 ； 将细胞培养板放回 37培养箱中 孵育 ； 2-4 小时后， 移去脂质体和 DNA 复合物， 在每个培养皿中加入 10ml 新鲜的培养液， 重 新将细胞培养板放回 37培养箱中培养 ； 48h 后收集病毒 ； 在 6 孔板中铺 5-6105个 293T 细胞 ； 第 2 天完全培养液汇合度达到 50。
13、-70， 第 2 天加入 500ul 收集病毒， 500ul 完全培养 基， 1ul 终浓度达到 10ug/ml 的 polybrene， 将细胞置于 32孵育 14-16h 后， 更换为完全培 养基， 将细胞置于37继续培养48h后， 收集细胞进行western blot检测FGF5和FGF5S表 达。 权 利 要 求 书 CN 102181448 B 3 1/9 页 4 绵羊 FGF5 基因的克隆和慢病毒表达载体的构建 技术领域 0001 本发明涉及绵羊 FGF5( 成纤维细胞生长因子 5) 基因编码区 (CDS) 的全长 cDNA 序 列克隆。 背景技术 0002 FGF5 是对毛囊生长。
14、周期具有重要调控作用的调控因子， 1994 年 Hebert【1】利用胚 胎干细胞基因敲除技术， 首次在国际著名的 Cell 杂志上报到了 FGF5 基因敲除的纯合子小 鼠被毛长度比杂合子长 50， 其原因是由于毛囊生长 VI 期延长， 同时证明了 go 基因就是 FGF5 突变的等位基因。FGF5 主要在毛囊外根鞘表达。早期的研究证明引起安哥拉鼠被毛 变长的原因是由于突变鼠的毛囊生长期延长。Zhan(1988)【2】在人的肿瘤细胞中发现了第 五种成纤维细胞生长因子， 并将其命名为 FGF5， 存在两种变位剪接体， 分别编码 122、 267 个 氨基酸残基。属于 FGF 家族之一， FGF 。
15、家族包含 23 个成员， 其共同的特征是含有两个大的 内含子， 两个内含子将功能区分为三个外显子， 多数 FGFs 的 N 末端具有信号肽。 0003 Suzuki3用 RT-PCR 方法检测到大鼠的皮肤中存在 FGF5 两种变位剪接体， FGF5 全 长 mRNA 包含 3 个外显子， 其变位剪接体 FGF5S 是由于缺失第 2 个外显子后， 改变阅读框， 提 前遇到终止密码子而产生， FGF5 和 FGF5S 均能于 FGF 受体 1 和 2 结合。全长的 FGF5 强烈的 抑制生长期的毛乳头细胞刺激外根鞘细胞的增殖， 引发毛囊进入休止期， 而 FGF5S 与 FGF5 竞争性的结合 FG。
16、F 受体， 拮抗 FGF5 的功能。国内高爱琴 4 等人利用 RT-PCR 检测了不同发 育阶段绒山羊皮肤中的FGF5表达情况， 发现仅有FGF5全长的mRNA表达， 没有发现FGF5S。 0004 2006年Housley等 5 通过狗常染色体隐性遗传分离试验， 推测狗的长毛性状可能 是由于 FGF5 基因的错义突变引起。2007 年 James 等 6 利用全基因组扫描结合候选基因的 方法， 发现了 FGF5 基因四个突变位点与猫的被毛长度相关。同时另外一个研究小组也发现 了 FGF5 基因与猫的被毛长度相关的突变 7。2009 年 Cadieu 等利用全基因组扫描的方法 进一步证明了 F。
17、GF5 基因突变与狗的毛长相关 【8】 。国内高爱琴等对该基因在绵羊群体中的 多态性进行了检测， 但是未进行与羊毛长度的关联分析 9。刘海英等在绒山羊群体中检测 了该基因的多态性， 发现该基因多态性与绒纤维的伸直长度和含绒量相关 10。 李春笑【11】 等 发现了该基因的两个突变位点对兔毛产量有显著影响。目前对 FGF5 影响毛长的研究主要 集中在小鼠上， 在毛和狗上也有比较深入的研究， 但是在更能体现毛纤维长度价值的绵羊， 绒山羊上， 国外鲜有研究报道， 虽然国内学者分析了绵羊 FGF5 的多态性， 但是 没有做相关 性分析。如 ： 不同发育阶段绒山羊皮肤中 FGF5 基因 mRNA 表达 。
18、RT-PCR 检测 . 高爱琴等华 北农学报， 2008， 23(1) ： 36-37 ； 不同绵羊品种 FGF5 基因的多态性分析 . 高爱琴， 李宁， 赵兴 波， 李金泉 . 畜牧兽医学报， 2006， 37(4)326-330 ； FGF5 基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影 响 . 刘海英， 杨桂芹， 张微， 朱晓萍， 贾志海 . 遗传 2009， 31(2)175-179 ； 兔成纤维细胞生长 因子5(FGF5)基因SNP及其与产毛量的相关分析.李春笑等遗传， 2008， 30(7)893-899的报 道等。 0005 国内外目前由于缺乏绵羊 FGF5 的序列， 还没有发现绵羊 FGF5。
19、 的变位剪接体。因 说 明 书 CN 102181448 B 4 2/9 页 5 此本发明利用 RT-PCR 技术结合 5-RACE 和 3-RACE 技术扩增出绵羊 FGF5 基因 cDNA 全长编 码区， 并且确定了其存在变位剪接体 FGF5S， 为进一步研究该基因影响毛囊生长发育的生物 学功能研究奠定基础。 发明内容 0006 本发明的目的在于 ： 确定并获取对绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病毒表达载体的 构建。 0007 本发明的目的是这样实现的 ： 绵羊 FGF5 基因的克隆和慢病毒表达载体的构建， 1) 确定绵羊 FGF5 基因编码区的全序列 ； 2) 将目的基因定向克隆于 pL。
20、EX 慢病毒表达载体中， 获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体， 生产重组病毒， 感染293T细胞， 验证重组蛋白的表达 ； 0008 其 中 扩 增 外 显 子 1 的 引 物 ： 上 游 引 物 TTCCCCGAGGCTATGTCCAC， 下 游 引 物 ATCCATTGACTTTGCCATCCG ； 0009 其中扩增 5-RACE 引物 ： 以外显子 1 测序结果设计 5-RACE 引物 ： 上游引物 (CLONTECH， SMART RACE cDNA Amplofication Kit， 试 剂 盒 自 带 )， 下 游 引 物 GSPl ： CTGCTCTGCTCCAAGCCG。
21、CTTC， NGSP1 ： GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT ； 0010 其 中 扩 增 外 显 子 3 的 引 物 ： 上 游 引 物 CAGATGACTGCAAGTTCAGG， 下 游 引 物 CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT ； 0011 其 中 扩 增 3-RACE 的 引 物，以 外 显 子 3 测 序 结 果 设 计 3-RACE 引 物 ： 上 游 引 物 (CLONTECH， SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试 剂 盒 自 带 )GSP2 ： CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC， NGSP2 ： GAAG。
22、TCCTAACACGGTGAAATAC ； 0012 其中以 5-RACE 和 3-RACE 测序结果设计扩增 FGF5 全长的引物 ： 上游引物 ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT， 下游引物 GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAACCAAAGCGAAACTTGAGT ； 扩增 FGF5 的全长 cDNA 序列， 测序确定 FGF5 和 FGF5S 的全长序 列 ； 3) 克隆与测序 ： 将绵羊 FGF5 基因的扩增产物进行回收纯化后， 利用 T4DNA 连接酶将其 与连接PMD-18T 载体， 转化E.coli DH5。
23、 ； 利用氨苄青霉素平板筛选， 并以PCR法和限制性 酶切法鉴定， 阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。 0013 所述基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建， 扩增外显子 1， 3 及 FGF5 全长 PCR 反 应体系(25L) ： 10buffer 2.5L， 引物(10pmol/L)各0.5L， dNTP(10mmol/L)2L， DNA 聚合酶 (2.5U/L)0.4L， DNA 模板 1L， ddH2O 补至 25L。RACE 的反应程序参考试 剂盒的说明书。 0014 所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建， PCR反应程序 ： 预变性955min ； 变性 95 30sec ； 外显。
24、子 1 和 3 的退火温度为 56， FGF5 全长的为 60， 退火时间均为 30sec ； 72 30sec( 外显子 1 和 3)， 1min(FGF5 全长 )35 个循环 ； 72 10min。 0015 所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建， 构建表达载体及慢病毒的生产， 感染 293T 细胞， 验证重组 FGF5/FGF5S 表达 ： 0016 a、 以 PMD-18T-FGF5， PMD-18T-FGF5S 为模板， 利用特异性引物 F1， F2 和 FS1， FS2 进 行 PCR 反应， 其反应体系为 ： 1uLPMD-18T-FGF5 或 PMD-18T-FGF5S， 2。
25、.5uL 10PCR buffer， 2uL dNTP( 各 2.5mM)， 上下游引物 (10mM) 各 1uL， 1uLDMSO， 1UTaq 酶 ( 宝生物， Pfu)， 用 ddH2O 调整至 25uL ； PCR 反应条件为 ： 94 4min， 94 30s， 64 30s， 72 1min， 35 个循 说 明 书 CN 102181448 B 5 3/9 页 6 环， 72 10min ； 取反应液 5uL 经琼脂糖凝胶电泳检测确认 ； 将绵羊 FGF5 基因的扩增产物 及 pLex 慢病毒载体同时进行 Not I/Xho I 双酶切， 分别回收纯化后的 PCR 产物和 pLE。
26、X 载 体， 利用 T4DNA 连接酶连接酶切后的 PCR 产物和 pLEX 载体， 转化 E.coli DH5 ； 利用氨苄 青霉素进行平板筛选， 并以 PCR 法和限制性酶切法鉴定测序， 新载体命名为 pLEX-FGF5 和 pLEX-FGF5S ； 0017 b、 293T 细胞培养 ： 条件 37， 5的 CO2， 培养基采用 DMEM+10的胎牛血清， 每 10cm 细胞培养皿中铺 2-2.5106个 293T 细胞， 第 2 天细胞在完全培养液中汇合度达到 70-80 ； 0018 c、 Lipectamine 2000 脂质体转染 ： 加入 1.5ml 预热的 Opti-MEM 。
27、培养基后， 按下 列比例加入转染载体 (pLEX-FGF5， pLEX-FGF5S)12ug、 包装质粒 (pSPAX2)9ug、 包膜质粒 (pMD2G)3.5ug、 轻轻混匀， 同时将 50ul 的脂质体加入到 1.5mlopti-MEM 培养基， 室温放置 5min后， 将上述稀释好的DNA与脂质体混合， 置于室温孵育20分钟 ； 在此期间， 用Opti-MEM 培养基清洗待转染细胞一次， 将脂质体和 DNA 复合物加入细胞 ； 将细胞培养板放回 37培 养箱中孵育 ； 2-4 小时后， 移去脂质体和 DNA 复合物， 在每个培养皿中加入 10ml 新鲜的培养 液， 重新将细胞培养板放回。
28、37培养箱中培养 ； 48h后收集病毒 ； 在6孔板中铺5-6105个 293T 细胞 ； 第 2 天完全培养液汇合度达到 50-70， 第 2 天加入 500ul 收集病 毒， 500ul 完 全培养基， 1ul polybrene( 终浓度达到 10ug/ml)， 将细胞置于 32孵育 14-16h 后， 更换为 完全培养基， 将细胞置于 37继续培养 48h 后， 收集细胞进行 western blot 检测 FGF5 和 FGF5S 表达。 0019 所述基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建， 选用的试剂盒、 药剂均为市售产品。 0020 本发明是通过比较小鼠与人 FGF5 的同源性， 。
29、根据保守序列设计扩增 FGF5 部分外 显子 1 和 3 的引物， 对部分外显子 1 和 3 进行测序， 根据外显子 1 和 3 的测序结果设计出 5-RACE 和 3-RACE 引物， 利用 RACE 技术扩增出绵羊 FGF5 基因的 5-UTR 和 3 -UTR 序列 ； 并以上序列设计扩增 FGF5 全长编码区的引物序列， ( 从绵羊皮肤组织 ) 扩增 FGF5 的全长 cDNA 序列， 获得了 FGF5 的变位剪接体， 并测序验证 FGF5 和 FGF5S 的全长序列， 进一步构建 FGF5， FGF5S 慢病毒表达载体， 为研究该基因影响毛囊生长发育的生物学功能研究奠定基 础， 彰显。
30、技术进步。 附图说明 0021 本发明对照附图作进一步说明。 0022 附图 1 为 5-RACE 的扩增结果 ； 0023 如图所示 ： 1， 2 为样品， M 为 150bp 的 marker。 0024 附图 2 为 3-RACE 的扩增结果 ； 0025 如图所示 ： 1， 2 为样品， M 为 150bp 的 marker。 0026 附图 3 为 FGF5 编码区的扩增结果 ； 0027 如图所示 ： FGF5扩增产物2.5凝胶电泳， 其中1， 2， 3， 4为扩增的样品， M为150bp 的 marker。 0028 附图 4 为 FGF5and FGF5s 病毒感染 293T 。
31、细胞的 Western Blot 检测结果 ； 0029 如图所示 ： M 为蛋白 marker， 1 为 pLEX 空载体， 2 为 pLEX-FGF5， 3 为 pLEX-FGF5S。 说 明 书 CN 102181448 B 6 4/9 页 7 具体实施方式 0030 本发明对照实施例作进一步说明。 0031 (1) 实验样品采集与总 RNA 提取 0032 采集细毛羊皮肤组织， 装入冻存管中并迅速置于液氮中保存备用。取 100mg 组织 样在液氮中研碎， 然后按照杭州博日 RNA 提取试剂盒说明书进行提取。 0033 (2)RT-PCR 0034 按照反转录酶 M-MLV( 宝生物 )。
32、 的说明书， 对绵羊皮肤组织 RNA 反转录， 反转录体 系参照说明书的体系。 0035 (3) 引物设计 0036 利用 Oligo6.0 设计扩增外显子 1 和 3 的， 克隆至 T 载体上送交上海生物工程公司 测序， 测序结果见序列表 1 和 2 ； 通过外显子 1 和 3 的测序结果设计扩增 5-RACE 和 3-RACE 的引物， 扩增结果见图1和2， 克隆至T载体上送交上海生物工程公司测序， 测序结果见序列 表 3 和 4 ； 根据 5-RACE 和 3-RACE 设计扩增 FGF5 编码区全长的引物， 扩增结果见图 3， 测序 结果见 5 ； 根据测序结果设计克隆 FGF5 至慢。
33、病毒表达载体的引物， 上游引物 F1 ： ATAGCGGCC GCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT(Not I) 下游引物为 F2 ： GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT GGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT(Xho I)， 设计克隆 FGF5S 至慢病毒表达载体的引物， 上游引物 FS1 与 F1 相同， 下游引物 FS2 为 ： GGCCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCTGTAAATT TGGCTTAAC(XhoI)。 0037 (4) 扩增外显子 1， 3 及 FGF5 全长 PCR 反应体系。
34、 (25L) ： 10buffer 2.5L， 引 物 (10pmol/L) 各 0.5L， dNTP(10mmol/L)2L， DNA 聚合酶 (2.5U/L)0.4L， DNA 模 板 1L， ddH2O 补至 25L ； RACE 的反应程序参考试剂盒的说明书。 0038 (5)PCR 反应程序 ： 预变性 95 5min， 变性 95 30sec， 外显子 1 和 3 的退火温度 为 56， FGF5 全长的为 60， 退火时间均为 30sec， 72 30sec( 外显子 1 和 3)， 1min(FGF5 全长 )35 个循环， 72 10min。 0039 (6) 克隆和测序 0。
35、040 将绵羊 FGF5 基因的扩增产物进行回收纯化后， 利用 T4 DNA 连接酶将其与连接 PMD-18T 载体， 转化 E.coli DH5 ； 利用氨苄青霉素平板筛选， 并以 PCR 法和限制性酶切法 鉴定， 阳性克隆测序由上海生物工程公司完成 ； 测序鉴定后的质粒命名为 PMD-18T-FGF5 和 PMD-18T-FGF5S。 0041 (7) 构建慢病毒表达载体 ： 分别以 PMD-18T-FGF5， PMD-18T-FGF5S 为模板， 利 用特异性引物 F1， F2 和 FS1， FS2 进行 PCR 反应， 其反应体系为 ： 1uLPMD-18T-FGF5 或 PMD-18。
36、T-FGF5S， 2.5uL 10PCR buffer， 2uL dNTP( 各 2.5mM)， 上下游引物 (10mM) 各 1uL， 1uL DMSO， 1UTaq 酶 ( 宝生物， Pfu)， 用 ddH2O 调整至 25uL。PCR 反应条件为 ： 94 4min， 9430s， 6430s， 721min， 35个循环， 7210min ； 取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测 确认， 将绵羊 FGF5 基因的扩增产物及 pLex 慢病毒载体同时进行 Not I/Xho I 双酶切， 分别 回收纯化后的 PCR 产物和 pLEX 载体， 利用 T4DNA 连接酶连接酶切后的 PCR 产。
37、物和 pLEX 载 体， 转化 E.coli DH5 ； 利用氨苄青霉素进行平板筛选， 并以 PCR 法和限制性酶切法鉴定， 经过测序验证后， 新载体命名为 pLEX-FGF5 和 pLEX-FGF5S ； 说 明 书 CN 102181448 B 7 5/9 页 8 0042 其 293T 细胞培养 ： 条件 37， 5的 CO2， 培养基采用 DMEM+10的胎牛血清， 10cm 细胞培养皿中铺 2-2.5106 个 293T 细胞， 保证第 2 天细胞在完全培养液中汇合度达到 70-80 ； 0043 其 Lipectamine 2000 脂质体转染 ： 加入 1.5ml 预热的 Opt。
38、i-MEM 培养基后， 按下 列比例加入转染载体 (pLEX-FGF5， pLEX-FGF5S)12ug、 包装质粒 (pSPAX2)9ug、 包膜质粒 (pMD2G)3.5ug、 轻轻混匀， 同时将 50ul 的脂质体加入到 1.5mlopt i-MEM 培养基， 室温放置 5min 后， 将上述稀释好的 DNA 与脂质体混合， 混合物置于室温孵育 20 分钟 ； 在此期间， 用 Opti-MEM 培养基清洗待转染细胞一次， 将脂质体和 DNA 复合物加入细胞， 将细胞培养板放 回 37培养箱中孵育， 2-4 小时后， 移去脂质体和 DNA 复合物， 在每个培养皿中加入 10ml 新 鲜的培。
39、养液， 重新将细胞培养板放回 37培养箱中培养， 48h 后收集病毒 ； 0044 在 6 孔板中铺 5-6105个 293T 细胞， 保证第 2 天在完全培养液汇合度达到 50-70； 第2天加入500ul收集病毒， 500ul完全培养基， 1ulpolybrene(终浓度达到10ug/ ml)， 将细胞置于 32孵育 14-16h 后， 更换新鲜的培养液， 将细胞置于 37继续培养 48h 后， 收集细胞进行 western blot 检测 FGF5 和 FGF5S 表达。 0045 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 .txt 0046 SEQUENCE LISTING 。
40、0047 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国 - 澳大利亚绵羊育种研究 0048 中心 0049 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 0050 无 0051 无 0052 2010-12-09 0053 13 0054 无 0055 1 0056 20 0057 DNA 0058 绵羊 (Ovine) 0059 I 0060 ttccccgagg ctatgtccac 0061 20 0062 2 0063 21 0064 DNA 0065 绵羊 (Ovine) 0066 2 0067 atccattgac tttgccatcc g 0068 21 0069 3 说 明 书 CN 。
41、102181448 B 8 6/9 页 9 0070 22 0071 DNA 0072 绵羊 (Ovine) 0073 3 0074 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 .txt 0075 ctgctctgct ccaagccgct tc 0076 22 0077 4 0078 21 0079 DNA 0080 绵羊 (Ovine) 0081 4 0082 gaagaagagg aagacacggt gct 0083 24 0084 5 0085 20 0086 DNA 0087 绵羊 (Ovine) 0088 5 0089 cagatgactg caagttcagg 0090。
42、 20 0091 6 0092 21 0093 DNA 0094 绵羊 (Ovine) 0095 6 0096 caaagcgaaa cttgagtctg t 0097 21 0098 7 0099 24 0100 DNA 0101 绵羊 (Ovine) 0102 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 .txt 0103 7 0104 caagcaatcg gagcagccag aag 0105 24 0106 8 0107 24 0108 DNA 说 明 书 CN 102181448 B 9 7/9 页 10 0109 绵羊 (Ovine) 0110 8 0111 gaagtc。
43、ctaa cacggtgaaa tac 0112 24 0113 9 0114 32 0115 DNA 0116 绵羊 (Ovine) 0117 9 0118 atagcggccg cggaagcatg agcttgtcct t 0119 32 0120 10 0121 59 0122 DNA 0123 绵羊 (Ovine) 0124 10 0125 ggcctcgagt taagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtaa ccaaagcgaa 0126 acttgagt 59 0127 11 0128 59 0129 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 .txt。
44、 0130 DNA 0131 绵羊 (Ovine) 0132 11 0133 ggcctcgagt caagcgttagt ctgggacgtc gtatgggtat ctgtaaattt 0134 ggcttaac 59 0135 12 0136 846 0137 DNA 0138 绵羊 (Ovine) 0139 0140 CDS 0141 (7).(846) 0142 12 0143 ggaagcatga gcttgtcctt cctcctcctc ctcttcctta gccacctgat 0144 cctcagcgcc 60 0145 tgggctcaag gggagaagcg cct。
45、cgcaccc aaagggcagc ccggaccggc 0146 tgccaccgag 120 0147 aggaacccgg gaggcgccag cagccgccgg agcagcagta gcaccgtgtc 说 明 书 CN 102181448 B 10 8/9 页 11 0148 ttcctcttct 180 0149 tcccctgcct cctcctcctc cgcggcttct cggggcggcc caggaagcgg 0150 cttggagcag 240 0151 agcagcttcc agtggagccc ctcggggcgc cggaccggca gcctctac。
46、tg 0152 cagagtgggc 300 0153 atcggtttcc atctgcagat ctacccggat ggcaaagtca atggctccca 0154 cgaagccaat 360 0155 atgttaagt attttggaaat atttgctgtg tctcagggga ttgtaggaat 0156 acgaggagtt 420 0157 ttcagcaaca aatttttagc gatgtcaaaa aaaggaaaac tccatgcaag 0158 tgccaaattt 480 0159 acagatgact gcaagttcag ggagcgattt。
47、 caagaaaaca gctataatac 0160 ctatgcctcc 540 0161 gccatacaca gaactgaaaa gacggggcgg gagtggtacg tggccctgaa 0162 caagagaggg 600 0163 aaggctaaac ggggctgcag cccccgggtt aaacctcagc acgtctctac 0164 ccactttctg 660 0165 绵羊 FGF5 基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 .txt 0166 ccaagattca agcaatcgga gcagccagaa ctttctttca cagttactgt 0。
48、167 tcccgaaaag 720 0168 aaaaaaccac ctaatcccct caagccaaag gttccccttt ccgcacctcg 0169 gagaagtcct 780 0170 aacacggtga aatacagact caagtttcgc tttggttacc catacgacgt 0171 cccagactac 840 0172 gcttaa 0173 846 0174 13 0175 715 0176 DNA 0177 绵羊 (Ovine) 0178 0179 CDS 0180 (7).(384) 0181 13 0182 ggaagcatga gcttg。
49、tcctt cctcctcctc ctcttcctta gccacctgat 0183 cctcagcgcc 60 0184 tgggctcaag gggagaagcg cctcgcaccc aaagggcagc ccggaccgac 0185 tgccaccgag 120 0186 aggaacccgg gaggcgccag cagccgccgg agcagcagta gcaccgtgtc 说 明 书 CN 102181448 B 11 9/9 页 12 0187 ttcctcttct 180 0188 tcccctgcct cctcctcctc cgcggcttct cggggcggcc caggaagcgg 0189 c。