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1、(10)申请公布号 CN 102226195 A (43)申请公布日 2011.10.26 CN 102226195 A *CN102226195A* (21)申请号 201110122362.4 (22)申请日 2011.05.12 C12N 15/40(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (71)申请人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路 1 号 (72)发明人 胡新喜 熊兴耀 李炎林 何长征 宋勇 刘明月 秦玉芝 黄科 (74)专利代理机构 长沙市融智专利事务所 43114 代理人 袁靖 (54) 发明名。
2、称 一种克隆类病毒全基因序列的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种克隆类病毒全基因序列的 方法， 包括以下步骤 ： 1) 类病毒基因组 RNA 的获 得 ； 2) 以步骤 1) 得到的类病毒基因组 RNA 为模 板， 通过反转录， 得到引物之间的目标序列与至少 一个类病毒全基因组序列长度的 cDNA ； 3) 以步 骤 2) 得到的 cDNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 回收、 纯化 PCR 产物， 克隆、 测序 ； 4) 通过比对、 分析序 列获得类病毒全长基因序列。本发明是一种高准 确率、 一次完成类病毒全基因序列克隆的方法， 且能用一对引物克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiv。
3、iroid) 中的大部分类病毒种的全基因序 列， 为克隆类病毒全基因序列提供了新的途径。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 102226202 A1/1 页 2 1. 一种克隆类病毒全基因序列的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 类病毒基因组 RNA 的获得 ； 2) 以步骤 1) 得到的类病毒基因组 RNA 为模板， 通过反转录， 得到引物之间的目标序列 加上至少一个类病毒全基因组序列长度的 cDNA ； 3) 以步骤 2) 得到的 cDNA 为模板， 进行 P。
4、CR 扩增， 回收、 纯化 PCR 产物， 克隆、 测序 ； 4) 通过比对、 分析序列获得类病毒全长基因序列。 2. 一种克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒全基因序列的方法， 其特征在于， 包括以 下具体步骤 ： (1) 选择感染马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的植物植株顶部的幼嫩叶片， SDS-LiCL 方法提取植物总 RNA 和类病毒 RNA ； (2) 以反向引物 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 作为 RT 引物， 以步骤 (1) 提取的基 因组 RNA 为模板， 反转录获得 cDNA 产物 ； (3)PCR 扩增与片段回收 以 5 -ATTAATCCCCGGGGA。
5、AACCTGGAG-3 为正向引物， 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 为反向引物， 以步骤 (2) 得到的 cDNA 为模板， 进行 PCR 扩增 ； (4) 纯化 PCR 产物克隆， 测序， 通过比对、 分析序列获得类病毒全长基因序列。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 所述的 RT 反应体系 ： 5RT buffer ： 2l， 0.1M 的 DTT ： 1l， 100g/L 的 RT 反向引物 ： 0.5l， 5mM 的 dNTPs ： 2l， RNasin 酶 ： 10U， M-MLV RT 酶 ： 100U， 超纯水补至 7.。
6、5l ； 反应程序 ： 0.2g/l 的 RNA 2.5l 65变性 8min， 冰浴 3min， 加 7.5l 的 RT 反应 体系， 42水浴至少 1h， 95温浴 2min 终止反应， 获得 cDNA 产物。 4. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (3) 所述的 PCR 反应体系 ： 不含 Mg2+的 10buffer ： 2.5l， 100g/L 的正、 反向 引物各 0.5l， 5mM 的 dNTPs ： 1l， 25mM 的 MgCl2： 1.5l， Taq 酶 1U， cDNA 2l， 超纯水补 至 25l ； PCR 扩增程序 ： 92 5 分钟预变性后， 。
7、30 个 PCR 循环参数为 ： 95 30 秒， 56 5 个循环 30 秒， 54 5 个循环 30 秒， 52 10 个循环 30 秒， 50 10 个循环 30 秒， 72 60 秒， 最后 72 10 分钟。 5. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (4)PCR 扩增产物用 0.8琼脂糖凝胶电泳， 挑取 560bp 附近的条带， 试剂盒回收、 纯化 PCR 产物。 6. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒 包括 ： PSTVd、 TCDVd、 CEVd、 TPMVd、 MPVd、 CSVd、 TASVd 或 IrVd。 。
8、7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述的马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒 为 PSTVd。 权 利 要 求 书 CN 102226195 A CN 102226202 A1/4 页 3 一种克隆类病毒全基因序列的方法 技术领域 0001 本发明属于类病毒的基因工程领域， 涉及一种克隆植物类病毒全基因序列的方 法， 特别是涉及克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 全基因序列的方法。 背景技术 0002 类病毒 (viroid) 是迄今为止发现的最小病原物， 是一类单链共价闭合环状的裸 露 RNA 分子， 由 246 400 个核苷酸组成， 是目前已知的最小的能够自。
9、我复制的遗传单位， 不编码任何蛋白质， 因此是一类不同于病毒的低分子致病因子， 危害高等植物可造成严重 经济损失。目前发现的类病毒有 30 种， 其中有 26 种属中央保守区、 无核酶活性的马铃薯 纺锤块茎类病毒科 (Pospiviroidae) 和 4 种属无中央保守区、 有核酶活性的鳄梨日斑类 病毒科 (Avsunviroidae)。马铃薯纺锤块茎类病毒科 (Pospiviroidae) 可分为 ： 马铃薯 纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid)、 苹果锈果类病毒属 (Apscaviroid)、 锦紫苏类病毒属 (Coleviroid)、 椰子死亡类病毒属 (Cocadviroid)。
10、、 啤酒花矮化类病毒属 (Hostuviroid) 等 5 个属， 其中马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 为最大的属， 有 PSTVd、 TCDVd、 CEVd、 TPMVd、 MPVd、 CSVd、 TASVd、 IrVd、 CLVd 等 9 个种 (Flores et al， Annu.Rev.Phytopathol， 2005.43 ： 117-139)。Bostan 等针对马铃薯纺锤块茎类病毒属的保守序列设计了一对引物 能检测其中除 CLVd 外的 8 个种 (Bostan et al， Journal of Virological Methods， 2004， 11。
11、6(2) ： 189-193)， 片段长度因类病毒种不同而不同， 都在 200bp 左右。 0003 目前， 根据类病毒环状RNA的特点和RT-PCR克隆存在引物与模板个别碱基错配造 成获得的全基因序列不准确的特点， 为确保克隆序列的准确性， RT-PCR 克隆类病毒全基因 序列时多根据已知类病毒基因序列的 2 个保守区域设计两对重叠部分序列的正方向引物， 进行两次 RT-PCR 克隆， 获得 2 个全长序列， 相互验证， 去掉引物序列和重复序列， 以获得准 确的全长序列 (Behjatnia et al， Phytopathology， 1996， 86(8) ： 880-886)。因此， 。
12、需要进 行两次 RT-PCR 克隆， 既费时， 又费试剂。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种高准确率、 一次完成类病毒全基因序列克隆的方法， 且能用一对引物克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 中的大部分类病毒种的全 基因序列。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案实现的。 0006 一种克隆类病毒全基因序列的方法， 包括以下步骤 ： 0007 1) 类病毒基因组 RNA 的获得 ； 0008 2) 以步骤 1) 得到的类病毒基因组 RNA 为模板， 通过反转录， 得到引物之间的目标 序列加上至少一个类病毒全基因组序列长度的 cDNA ； 0009 3)以步骤。
13、2)得到的cDNA为模板， 进行PCR扩增， 回收、 纯化PCR产物， 克隆、 测序 ； 0010 4) 通过比对、 分析序列获得类病毒全长基因序列。 说 明 书 CN 102226195 A CN 102226202 A2/4 页 4 0011 一种克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒全基因序列的方法， 包括以下步骤 ： 0012 (1) 选择感染马铃薯纺锤块茎类病毒属类病毒的植物植株顶部的幼嫩叶片， SDS-LiCL 方法提取植物总 RNA 和类病毒 RNA ； 0013 (2) 以反向引物 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 作为 RT 引物， 以步骤 (1) 提取 的。
14、基因组 RNA 为模板， 通过反转录获得 cDNA 产物 ； 0014 (3)PCR 扩增与片段回收 0015 以 5 - A T T A A T C C C C G G G G A A A C C T G G A G - 3 为正向引物 ， 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 为反向引物， 以步骤 (2) 得到的 cDNA 为模板， 进行 PCR 扩增 ； 0016 (4) 纯化 PCR 产物克隆， 测序， 通过比对、 分析序列获得类病毒全长基因序列。 0017 步骤 (2) 所述的 RT 反应体系 ： 5RT buffer ： 2l， 0.1M 的 DTT ： 1l，。
15、 100g/L 的 RT 反向引物 ： 0.5l， 5mM 的 dNTPs ： 2l， RNasin 酶 ： 10U， M-MLV RT 酶 ： 100U， 超纯水补 至 7.5l ； 0018 反应程序 ： 0.2g/l 的 RNA 2.5l 65变性 8min， 冰浴 3min， 加 7.5l 的 RT- 反应体系， 42水浴至少 1h， 95温浴 2min 终止反应， 获得 cDNA 产物。 0019 步骤 (3) 所述的 PCR 反应体系 ： 不含 Mg2+的 10buffer ： 2.5l， 100g/L 的正、 反向引物各 0.5l， 5mM 的 dNTPs ： 1l， 25mM 。
16、的 MgCl2： 1.5l， Taq 酶 1U， cDNA 2l， 超纯 水补至 25l ； 0020 PCR 扩增程序 ： 92 5 分钟预变性后， 30 个 PCR 循环参数为 ： 95 30 秒， 56 5 个 循环 30 秒， 54 5 个循环 30 秒， 52 10 个循环 30 秒， 50 10 个循环 30 秒， 72 60 秒， 最 后 72 10 分钟。 0021 步骤(4)PCR扩增产物用0.8琼脂糖凝胶电泳， 挑取560bp附近的条带， 试剂盒回 收、 纯化 PCR 产物。 0022 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是 ： 利用 Bostan 等 (Bost。
17、an et al， Journal of Virological Methods， 2004， 116(2) ： 189-193) 设计的检测马铃薯纺锤块 茎类病毒属类病毒的 RT-PCR 引物作为 PCR 引物。引物序列如下 ： 0023 正向引物， 5 -ATTAATCCCCGGGGAAACCTGGAG-3 0024 反向引物， 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 0025 以反向引物 5 -AGC TTC AGT TGT TTC CAC CGG GT-3 作为 RT 引物。用此引物 进行反转录时， 由于类病毒是长为 246-400bp 的环状 RNA 分子， 只要反。
18、转录的时间足够长， 反转录能绕着环状RNA分子不断进行， 所得到的cDNA长度会超过其类病毒全基因组序列的 长度， 在进行 PCR 时， 会出现多个大小不同的目的片段 ( 即两个引物之间的序列 )， 除最短 的 200bp 左右的目的片段外， 其他片段均包含了 200bp 左右的目的片段和 1 个或多个全长 序列， 回收包含 200bp 左右和 1 个全长序列的目的片段， 通过克隆、 测序、 比对， 为提高准确 率， 去掉两端引物起始部分序列， 再去掉重复序列， 可获得类病毒全基因序列。由于此正反 向引物能与马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 中 8 种类病毒都能很好的配对， 。
19、因此 能用于克隆马铃薯纺锤块茎类病毒属 (Pospiviroid) 中的大部分类病毒的全基因序列。 附图说明 说 明 书 CN 102226195 A CN 102226202 A3/4 页 5 0026 图 1 为 RT-PCR 扩增 PSTVd 产物凝胶电泳结果 0027 M ： DNA ladder ； H ： 健康对照植株 ； 1， 2 为 PSTVd 感染植株材料。 具体实施方式 0028 以下结合实施例旨在进一步说明本发明， 而非限制本发明。 0029 实施例 1 0030 本发明选择马铃薯纺锤状块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid， PSTVd)作 。
20、为研究对象， 采用该方法一次性完成其全长基因组序列的克隆测序， 其步骤如下 ： 0031 (1) 选择感染 PSTVd 的马铃薯植株顶部的幼嫩叶片， SDS-LiCL 方法提取总 RNA( 包 括植物总 RNA 和类病毒 RNA) ； 0032 (2) 以反向引物 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 作为 RT 引物， 以提取的总 RNA 为模板， 进行反转录。 0033 反应体系， 7.5l RT-mix ： 5RT buffer 2l， 0.1M DTT 1l， RT引物(100g/ L)0.5l， dNTPs(5mM)2l， RNasin 酶 10U， M-MLV 。
21、RT 酶 100U， 超纯水补至所需体积。 0034 反应程序， 2.5l RNA(0.5g)65变性 8min， 冰浴 3min， 加 7.5lRT-mix， 42 水浴 1h， 95温浴 2min 终止反应， 获得 cDNA 产物。 0035 (3)PCR 扩增与片段回收 0036 以 5 - A T T A A T C C C C G G G G A A A C C T G G A G - 3 为正向引物 ， 5 -AGCTTCAGTTGTTTCCACCGGGT-3 为反向引物， cDNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 扩增产物用 0.8琼脂糖凝胶电泳， 挑取 560bp 左右的条带，。
22、 试剂盒回收、 纯化 PCR 产物 ( 图 1)。 0037 25l PCR 反应体系 ： 10buffer( 不含 Mg2+)2.5l， 正、 反向引物 (100g/L) 各 0.5l， dNTPs(5mM)1l， MgCl2(25mM)1.5l， Taq 酶 1U， cDNA 2l， 超纯水补至所需体积。 0038 PCR扩增程序 ： 925分钟预变性后， 30个PCR循环参数为 ： 9530秒， 56-5030 秒(565个循环， 545个循环， 5210个循环， 5010个循环)， 7260秒， 最后7210 分钟。 0039 (3) 用 Qiagen 克隆试剂盒将纯化的 560bp 。
23、左右的 PCR 产物克隆、 测序。测序结果 如下 ： 0040 CGAACTGGCAAAAAAGGACGGTGGGGAGTGCCCAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCAC CCTTCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTCGGCT ACT 说 明 书 CN 102226195 A CN 102226202 A4/4 页 6 0041 全长序列为 558bp， 两端斜体标注的序列为引物序列， 斜体下划双线为正向引物序 列， 斜体下划虚线为反向引物序列， 正体下划双。
24、线为正向引物同源序列， 正体下划虚线为反 向引物同源序列， 整个序列比PSTVd全长序列重复了一个199bp的序列(1bp-199bp， 包含了 正向引物序列， 正向引物前四个碱基 ATTA 与 PSTVd 不配对 )。为减少 RT 和 PCR 引物与模板 个别碱基错配造成获得的全基因序列不准确的可能性， 去除两端的引物和重复序列， 取字 符底纹 ( 描灰 ) 标记的序列， 全长为 359bp， 为 PSTVd 基因组全长序列。 0042 0043 由于类病毒为环状RNA， 通过Blast比对将其序列转换为与GenBank中类病毒序列 类似的序列。 0044 CGGAAGTTAACTCGTGG。
25、TTCCTGTGGTTCACACCTGACCTCCTGAGCAGAAAAGAAAAAA GAAGGCGGCTCGGAGGAGCGCTTCAGGGCGAACTGGCA AAAAAGGACGGTGGGGAGTGCCCAGCGGCCGACAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAGGGTTTTCACCCT TCCTTTCTTCGGGTGTCCTTCCTCGCGCCCGCAGGACCACCCCTCGCCCCCTTTGCGCTGTCGCTTC- GGCTACTCCCGAGAACCGCTTTTTCTCTATCTTACTTGCTTCG GGGCGAGGGTGTTAATCCCTTGGAACCGCAGTTGGTTCCT 说 明 书 CN 102226195 A CN 102226202 A1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 102226195 A CN 102226202 A2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 102226195 A CN 102226202 A1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102226195 A 。