《一种KITLG基因检测特异性引物和液相芯片.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种KITLG基因检测特异性引物和液相芯片.pdf（45页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102181573 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181573 A *CN102181573A* (21)申请号 201110153879.X (22)申请日 2011.06.09 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州益善生物技术有限公司 地址 510663 广东省广州市广州科学城揽月 路 80 号广州科技创新基地 B、 C 区五层 (72)发明人 许嘉森 郭靖 邹凤文 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 万志香 曾旻辉 (54) 发明名。
2、称 一种 KITLG 基因检测特异性引物和液相芯片 (57) 摘要 本发明公开了一种 KITLG 基因 SNP 检测特异 性引物和液相芯片， 主要包括有 ： 每种由 5端的 tag 序列和 3端针对目的基因突变位点的特异 性引物组成的 ASPE 引物， 所述特异性引物序列选 自 ： SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、 SEQ ID NO.21 及SEQ ID NO.22、 SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、 SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、 SEQ ID NO.27及 SEQ ID NO.28、 SEQ IDNO.29及SEQ ID NO。
3、.30、 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32、 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34、 SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36中的一 对以上 ； 有anti-tag序列包被的微球 ； 扩增引物。 本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序 法的吻合率高达 100， 实现多态性位点的野生 型和突变型并行检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 20 页 CN 102181576 A1/2 页 2 1. 一种 KITLG 基因多态性检测液相芯片， 其特征。
4、是， 包括有 ： (A). 针对每种多态性位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每种 ASPE 引物由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述特异性引物序 列选自 ： 针对 C74T 的 SEQ ID NO.19 及 SEQ ID NO.20、 针对 A123G 的 SEQ ID NO.21 及 SEQ IDNO.22、 针对 A181G 的 SEQ ID NO.23 及 SEQ ID NO.24、 针对 A89G 的 SEQ ID NO.25 及 SEQ IDNO.26、 针对 G96A 的 SEQ ID NO.27 及 SEQ ID 。
5、NO.28、 针对 A106G 的 SEQ ID NO.29 及 SEQ IDNO.30、 针对T161G的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、 针对A151G的SEQ ID NO.33及SEQ IDNO.34、 针对 G122T 的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 中的一对以上 ； 所述 tag 序列选自 SEQ IDNO.1 SEQ ID NO.18 ； (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.37SEQ ID NO。
6、.54中的序 列， 且所述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C). 用于扩增出需要检测的、 具有相应多态性位点的目标序列的引物。 2. 根据权利要求 1 所述的 KITLG 基因多态性检测液相芯片， 其特征是， 所述扩增引物 选自 ： 针对 C74T 的 SEQ ID NO.55 及 SEQ ID NO.56、 针对 A123G 的 SEQ ID NO.57 及 SEQ ID NO.58、 针对A181G的SEQ ID NO.59及SEQ ID NO.60、 针对A89G的SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62、 针对G96A的SEQ。
7、 ID NO.63及SEQ ID NO.64、 针对A106G的SEQ ID NO.65及SEQ ID NO.66、 针对 T161G 的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68、 针对 A151G 的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70、 针对 G122T 的 SEQ ID NO.71 及 SEQ ID NO.72 中的一对以上。 3. 根据权利要求 1 所述的 KITLG 基因多态性检测液相芯片， 其特征是， 所述 ASPE 引物 为 ： 由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19组成的序列及SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的。
8、序 列、 由 SEQID NO.3 和 SEQ ID NO.21 组成的序列及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.22 组成的 序列、 由 SEQ IDNO.5 和 SEQ ID NO.23 组成的序列及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.24 组成 的序列、 由 SEQ IDNO.7 和 SEQ ID NO.25 组成的序列及由 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.26 组 成的序列、 由SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28 组成的序列、 由 SEQ IDNO.11 和 SE。
9、Q ID NO.29 组成的序列及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.30 组成的序列、 由 SEQ IDNO.13 和 SEQ ID NO.31 组成的序列及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.32 组成的序列、 由 SEQ IDNO.15 和 SEQ ID NO.33 组成的序列及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ ID NO.34 组成的序列、 和 / 或由 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.35 组成的序列及由 SEQ ID NO.18 和 SEQ ID NO.36 组成的序列。 4. 根据权利要求 1 所述的 KITLG 基因。
10、多态性检测液相芯片， 其特征是， (A). 所述 ASPE 引物为 ： 由 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.19 组成的序列及 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.20 组成的序列、 由 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.21 组成的序列及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.22 组成的序列、 由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.23 组成的序列及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.24 组成的序列、 由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.25 组成的序列及由 SEQ ID NO.8和SEQ。
11、 ID NO.26组成的序列、 由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27组成的序列及 由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28组成的序列、 由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序 列及由 SEQ IDNO.12 和 SEQ ID NO.30 组成的序列、 由 SEQ ID NO.13 和 SEQ ID NO.31 组成 的序列及由 SEQ IDNO.14 和 SEQ ID NO.32 组成的序列、 由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.33 权 利 要 求 书 CN 102181573 A CN 102181576 A2/2 页 3 。
12、组成的序列及由 SEQ IDNO.16 和 SEQ ID NO.34 组成的序列、 和由 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.35 组成的序列及由 SEQID NO.18 和 SEQ ID NO.36 组成的序列 ； (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.37SEQ ID NO.54中的序 列， 且所述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C). 所述扩增引物为 ： 针对 C74T 的 SEQ ID 。
13、NO.55 及 SEQ ID NO.56、 针对 A123G 的 SEQID NO.57及SEQ ID NO.58、 针对A181G的SEQ ID NO.59及SEQ ID NO.60、 针对A89G的 SEQ IDNO.61及SEQ ID NO.62、 针对G96A的SEQ ID NO.63及SEQ ID NO.64、 针对A106G的 SEQ IDNO.65 及 SEQ ID NO.66、 针对 T161G 的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68、 针对 A151G 的 SEQ IDNO.69 及 SEQ ID NO.70 和针对 G122T 的 SEQ ID NO.7。
14、1 及 SEQ ID NO.72。 5.根据权利要求1-4任一项所述的KITLG基因多态性检测液相芯片， 其特征是， 所述间 隔臂序列为 5-10 个 T。 6. 一种用于 KITLG 基因多态性检测的特异性引物， 其特征是， 所述特异性引物选自 ： 针 对C74T的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、 针对A123G的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、 针 对A181G的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、 针对A89G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、 针 对G96A的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、。
15、 针对A106G的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、 针 对T161G的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、 针对A151G的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、 针对 G122T 的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 中的一对以上。 权 利 要 求 书 CN 102181573 A CN 102181576 A1/22 页 4 一种 KITLG 基因检测特异性引物和液相芯片 技术领域 0001 本发明屈于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体的是涉及一种 KITLG 基 因检测特异性引物和液相芯片。 背景技术 00。
16、02 KITLG(the KIT ligand gene) 是位于 12p22 的 KIT 配体基因。KITLG 突变是一个 获得功能性突变， 能增加色素细胞黑色素的数量， 即 KITLG 基因突变引起家族性进行性色 素过度沉着症。 0003 目前， 对 KITLG 基因多态性进行检测、 分析的报道不多， 其研究的方法主要是直接 测序法和 PCR-RFLP 分析法。PCR-RFLP 法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的 改变， 如位点丢失或产生新位点， 通过 PCR 扩增某一特定片段， 再用限制性内切酶酶切扩增 产物， 电泳观察片段的大小， 这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变， 可。
17、直接判断基因 型， 但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。 此外， 以上方法都存在着检测通 量的局限性， 每次只能检测一种突变类型， 不能满足实际应用的需要。 0004 本发明目标检测的 KITLG 基因突变位点， 如表所示 ： 0005 序号 KITLG 位点突变的内容 简写 1 SEQ ID NO.73 的第 74 位核苷酸， 发生 C T 突变 C74T 2 SEQ ID NO.74 的第 123 位核苷酸， 发生 A G 突变 A123G 3 SEQ ID NO.75 的第 181 位核苷酸， 发生 A G 突变 A181G 4 SEQ ID NO.76 的第 89 位核苷酸。
18、， 发生 A G 突变 A89G 5 SEQ ID NO.77 的第 96 位核苷酸， 发生 G A 突变 G96A 6 SEQ ID NO.78 的第 106 位核苷酸， 发生 A G 突变 A106G 7 SEQ ID NO.79 的第 161 位核苷酸， 发生 T G 突变 T161G 8 SEQ ID NO.80 的第 151 位核苷酸， 发生 A G 突变 A151G 9 SEQ ID NO.81 的第 122 位核苷酸， 发生 G T 突变 G122T 发明内容 0006 本发明的目的之一是提供 KITLG 基因多态性检测液相芯片， 该液相芯片可用于检 测KITLG基因九种常见基因。
19、型C74T、 A123G、 A181G、 A89G、 G96A、 A106G、 T161G、 A151G和G122T 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A2/22 页 5 的野生型和突变型。 0007 一种 KITLG 基因多态性检测液相芯片， 包括有 ： 0008 (A). 针对每种多态性位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每种 ASPE 引 物由5 端的tag序列和3 端针对目的基因突变位点的特异性引物组成， 所述特异性引物序 列选自 ： 针对 C74T 的 SEQ ID NO.19 及 SEQ ID NO.20、 针对 A123G 的 S。
20、EQ ID NO.21 及 SEQ ID NO.22、 针对A181G的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、 针对A89G的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、 针对G96A的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、 针对A106G的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、 针对 T161G 的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32、 针对 A151G 的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34、 针对 G122T 的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 中的一对以上 ； 所述 tag。
21、 序列 选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.18 ； 0009 (B). 有 anti-tag 序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述 anti-tag 序列与 微球连接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.37 SEQ ID NO.54 中的序列， 且所述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； 0010 (C). 用于扩增出需要检测的、 具有相应多态性位点的目标序列的引物。 0011 优选地， 所述扩增引物选自 ： 针对 C74T 的 SEQ ID NO.55 及 SEQ ID NO.56、。
22、 针对 A123G的SEQ ID NO.57及SEQ ID NO.58、 针对A181G的SEQ ID NO.59及SEQ ID NO.60、 针对 A89G的SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62、 针对G96A的SEQ ID NO.63及SEQ ID NO.64、 针对 A106G的SEQ ID NO.65及SEQ ID NO.66、 针对T161G的SEQ ID NO.67及SEQ ID NO.68、 针 对 A151G 的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70、 针对 G122T 的 SEQ ID NO.71 及 SEQ ID NO.72 中的一对以上。 。
23、0012 优选地， 所述 ASPE 引物为 ： 针对 C74T 的由 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.19 组成的 序列及SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20组成的序列、 针对A123G的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21 组成的序列及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.22 组成的序列、 针对 A181G 的由 SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.23组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24组成的序列、 针对A89G 的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.25 组成的序列及由 SEQ ID。
24、 NO.8 和 SEQ ID NO.26 组成的 序列、 针对 G96A 的由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID NO.27 组成的序列及由 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.28组成的序列、 针对A106G的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30组成的序列、 针对T161G的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.31组 成的序列及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.32 组成的序列、 针对 A151G 的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.33 。
25、组成的序列及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ ID NO.34 组成的序列、 和 / 或针对 G122T 的由 SEQ ID NO.17 和 SEQ IDNO.35 组成的序列及由 SEQ ID NO.18 和 SEQ ID NO.36 组成的序列。 0013 本发明的主要优点在于 ： 0014 1. 本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达 100。且检 测所需要的时间远远低于常用的测序技术， 特别符合实际应用需要。 。所制备的 KITLG 基因 多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比， 并且所设计的探针以及anti-tag序列之 间基本上不存在交叉反应， tag。
26、标签序列、 anti-tag标签序列的取以及tag标签序列与具体 ASPE 引物的结合， 能够避免交叉反应， 实现多个 SNP 位点的并行检测。 0015 2. 通过本发明的发明人的长期积累的设计经验和大量实验的操作， 从众多的特异 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A3/22 页 6 性引物中选取了最优的组合。本发明设计的 ASPE 引物特异性引物能够灵敏特异地识别目 标检测的突变位点， 准确区分各种型别的基因型 ； 在同一个反应体系中， 不同的特异性引物 之间、 特异性引物与非目标检测的 PCR 扩增产物之间基本上不存在交叉反应， 检测特异性 好， 交叉反。
27、应率低于 3 ； 除了能够检测单个位点突变情况， 也能够同时并行检测多个突变 位点的多态性情况， 检测效果一致。 0016 3. 本发明的检测方法步骤简单， 九种多态性位点检测可通过一步多重 PCR 即可完 成九个含有 SNP 位点的目标序列的扩增， 避免了反复多次 PCR 等复杂操作过程中存在的诸 多不确定因素， 因而可大大提高检测准确率， 体现了精确的同时定性、 定量分析特征。 0017 4. 本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高， 检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进， 使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很 强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高， 。
28、从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比 增强， 检测结果更加准确可靠。 0018 5. 本发明中的 KITLG 基因突变检测液相芯片为多个位点多种基因型的并行检测 提供了一种不同构思的技术方案， 并产生了显著的技术效果。 同时， 由于高通量高特异性等 技术特征， 更加符合实际应用的需求。本发明的液相芯片技术将代表着生物靶标检测的技 术发展趋势。 具体实施方式 0019 实施例 1KITLG 基因多态性检测液相芯片， 主要包括有 ： 0020 一、 ASPE 引物 0021 针对 KITLG 基因九种常见基因型 C74T、 A123G、 A181G、 A89G、 G96A、 A106G、 。
29、T161G、 A151G 和 G122T 的野生型和突变型， 分别设计特异性引物序列。ASPE 引物由 “Tag 序列 + 特 异性引物序列” 组成。ASPE 引物序列如下表所示 ： 0022 表 1KITLG 基因的 ASPE 引物序列 (Tag 序列 + 特异性引物序列 ) 0023 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A4/22 页 7 0024 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A5/22 页 8 0025 每条ASPE引物包括两个部分， 5 端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列， 3 端为突变型或。
30、野生型特异的引物片段 ( 如上述表 1 所示 )。所有 ASPE 引物由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。 0026 二、 anti-tag 序列包被的微球 0027 根据所设计的 ASPE 特异性引物片段， 选择 tag 序列， 最大限度地减少各微球的 anti-tag 序列之间以及 tag 与 ASPE 特异性引物片段可能形成的二级结构， 选择的 18 种微 球编号与微球上相应的 anti-tag 序列如表 2 所示 ： 0028 表 2 微球编号与微球上相应的 anti-tag。
31、 序列 0029 0030 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A6/22 页 9 0031 选择的 18 种微球购自美国 Luminex 公司， 将 anti-tag 序列包被与微球上。 anti-tag 序列与微球之间连接有 5-10 个 T 的间隔臂序列， 即在每个 anti-tag 序列前加 上一段 5-10 个 T 的间隔臂序列， anti-tag 序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。将合成的 anti-tag 序列用灭菌 ddH2O 配成 100nmol/ml 的贮存液。所述间隔臂为用 于将 anti-tag 与微球表面间隔开来或是将 an。
32、ti-tag 置于亲水性环境中的序列。通过在 anti-tag 序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的 效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚 dT， 即 poly(dT)， 寡聚四聚乙二 醇以及 (CH2)n 间隔臂 (n 3)， 如 (CH2)12、 (CH2)18 等。另外， 如果存在 poly(dA) 干扰， 还可以用 poly(TTG) 作为间隔臂。本发明间隔臂优选为 5-10 个 T， 微球包被的过程如下 ： 0032 分别取 5106个上述编号的羧基化的微球 ( 购自 Luminex 公司 ) 悬浮于 50ul 0.1mol/L 的。
33、 MES 溶液中 (pH4.5)， 加入 10ul 合成的 anti-tag 分子 (100nmol/ml)。配 制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)( 购自 Pierce Chemical 公司 ) 工作液。往微球悬液中加入 2.5ul 的 EDC 工作液， 恒温孵育 30 分钟， 再加 入 2.5ul 的 EDC 工作液， 再恒温孵育 30 分钟。反应结束后， 用 0.02的 Tween-20 洗涤一 次， 再用 0.1的 SDS 液洗涤一次。将洗涤后的包被有 anti-tag 序列的微球重悬于 100u。
34、l 的 Tris-EDTA 溶液 10mmol/LTris(pH8.0)， 1mmol/LEDTA 中， 2-8避光保存。 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A7/22 页 10 0033 三、 扩增出含有突变位点的目标序列的引物 0034 针对 KITLG 基因九种常见基因型 C74T、 A123G、 A181G、 A89G、 G96A、 A106G、 T161G、 A151G 和 G122T， 设计扩增引物对 ( 见表 3)， 分别扩增出九条含有多态性位点的目标序列。 0035 表 3 扩增出具有多态性位点的目标序列的引物 0036 0037 0038 所。
35、有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A8/22 页 11 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。 0039 实施例 2 运用实施例 1 所述 KITLG 基因检测液相芯片对样本的检测 0040 所述各种溶液的配方如下 ： 0041 50mM 的 MES 缓冲液 (pH5.0) 配方 (250ml) ： 0042 0043 2Tm 杂交缓冲液 0044 试剂 来源 终浓度 每 250ml 的用量 1MTris-HCl， pH8.0 SigmaT303。
36、8 0.2M 50ml 5M NaCl Sigma S5150 0.4M 20ml Triton X-100 Sigma T8787 0.16 0.4ml 0045 过滤后贮存于 4。 0046 ExoSAP-IT 试剂盒购自美国 USB 公司。 0047 生物素标记的 dCTP 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 0048 一、 样本的 DNA 提取 ： 0049 参照 分子克隆 关于 DNA 提取的相关方法， 得到待检测的 DNA。 0050 二、 待测样品的 PCR 扩增 0051 设计九对引物， 多重 PCR 一步扩增出分别含有 KITLG 基因九种常见基因型 C74T、 A123。
37、G、 A181G、 A89G、 G96A、 A106G、 T161G、 A151G 和 G122T 的九条目标序列， 产物大小分别 为 299bp、 267bp、 372bp、 309bp、 341bp、 294bp、 396bp、 428bp 和 278bp，引 物 序 列 (SEQ ID NO.55-72) 见上述表 3 所示。 0052 首先配制多重 PCR 引物工作液 ： 分别各取 SEQ ID NO.55-72 的引物贮存液 100ul 于 1.5ml 微量离心管中， 混合均匀即为多重 PCR 引物工作液。多重 PCR 反应体系如下 ： 说 明 书 CN 102181573 A CN。
38、 102181576 A9/22 页 12 0053 0054 PCR扩增程序为 ： 953min ； 9430s， 5630s， 7240s， 30个循环 ； 7210min ； 4保存备用。 0055 三、 PCR 产物的酶切处理 0056 1. 取 7.5ul PCR 反应后的产物， 加入 1ul 10SAP 缓冲液、 1ul SAP 酶和 0.5ul Exo-I 酶 ； 0057 2.37孵育 15min， 80孵育 15min， 灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于 后续的 ASPE 引物延伸反应。 0058 四、 位点特异的引物延伸反应 (ASPE) 0059 利用上述设计的 A。
39、SPE 引物进行引物延伸反应， 在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP， 从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。 0060 首先配制混合的 ASPE 引物工作液 ： 分别取待检测基因相应的野生型和突变型 ASPE 引物贮存液 10ul 于 1.5ml 微量离心管中， 加入 10mmol/L Tris Buffer 补至 200ul， 混 合均匀即为 ASPE 混合引物工作液。ASPE 反应的体系如下 ： 0061 0062 反应程序为 ： 962min ； 9430s， 541min， 722min， 30个循环 ； 4保存备用。 0063 五、 杂交反应 0064 1.根据设计的ASPE引。
40、物， 每组选择18种包被anti-tag的微球(每种微球浓度均 为 2.5105个 /ml) ； 0065 2. 分别取 1ul 每种编号的微球于 1.5ml 的微量离心管中 ； 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A10/22 页 13 0066 3. 微球于 10000g 离心 1-2min ； 0067 4. 弃去上清， 微球重悬于 100ul 的 2Tm 杂交缓冲液中， 涡旋混匀 ； 0068 5. 取 25ul 上述微球悬液于 96 孔滤板相应的孔中， 对照孔加 25ul 的 ddH2O ； 0069 6. 取 5-25ul 的 ASPE 反应液于相应。
41、的孔中， 用 ddH2O 补足至 50ul ； 0070 7. 用锡箔纸包住 96 孔板以避光， 95 60s， 37 15min 孵育杂交 ； 0071 8. 杂交后的微球于 3000g 离心 2-5min ； 0072 9. 去上清， 将微球重悬于 75ul 的 1Tm 杂交缓冲液中 ； 0073 10. 微球于 3000g 离心 2-5min ； 0074 11.将微球重悬于75ul的1Tm杂交缓冲液中， 加入15ul浓度为10ug/ml的链霉 亲和素 - 藻红蛋白 (SA-PE) ； 0075 12.37孵育 15min， 于 Luminex 仪器上检测。 0076 六、 结果检测与数。
42、据分析 0077 反应后产物通过 Luminex 系列分析仪器检测。检测结果如表 4、 表 5 和表 6 所示。 0078 对荧光值 (MFI) 和数据处理有以下要求 ： 0079 1. 每个位点需至少有一个等位基因 MFI 大于 300 而且大于 10PCR 阴性对照 MFI ； 0080 2.NET MFI 样品 MFI-PCR 阴性对照 MFI(NET MFI 小于 0 的以 0 表示 ) ； 0081 3. 满足以上两个条件的数据， 按下列公式计算突变比值 ： 0082 突变比值突变型 NET MFI( 突变型 NET MFI+ 野生型 NET MFI) 0083 4.根据经验对每个检。
43、测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)， 以划分野生型纯 合子、 杂合子和突变型纯合子。 0084 使用本方法检测 20 份样本的 KITLG 基因多态性位点， 实验数据符合上述要求， 因 此可计算得它们的突变比值。阈值 (cut-off 值 ) 的设置如下 ： 突变比值范围在 0 -20 视为野生型纯合子 ； 30 -70视为杂合子 ； 80 -100视为变异型纯合子。以测序法检 测与液相芯片结果作对照， 计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测 20 份样本的 KITLG 基因型检测结果与测序结果吻合率达到 100。可见本发明所提供的 KITLG 基因多态性检测液相芯片。
44、能够准确地检测出 KITLG 基因多态性位点类型， 且结果稳 定可靠。 0085 表 4 样本检测结果 (MFI) 之一 0086 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A11/22 页 14 0087 表 5 样本检测结果 (MFI) 0088 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A12/22 页 15 0089 表 6 样本 KITLG 基因突变比值 ( ) 0090 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A13/22 页 16 0091 0092 表 7 样本 KITLG 基因突变类型分析结果 0。
45、093 样本号 液相芯片检测结果 测序结果 1 野生型 野生型 2 野生型 野生型 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A14/22 页 17 3 野生型 野生型 4 89GG 89GG 5 野生型 野生型 6 122GT 122GT 7 74TT 74TT 8 野生型 野生型 9 181AG 181AG 10 161TG 161TG 11 野生型 野生型 12 96GA 96GA 13 74TT 74TT 14 野生型 野生型 15 野生型 野生型 16 野生型 野生型 17 野生型 野生型 18 野生型 野生型 19 106GG 106GG 20 野生型 野。
46、生型 0094 0095 实施例 3 不同的 ASPE 引物的液相芯片对 KITLG 基因多态性位点的检测 0096 一、 液相芯片制备的设计 (Tag 序列及 Anti-Tag 序列的选择 ) 0097 以 KITLG 基因 A123G 和 A106G 位点突变检测液相芯片为例， 分别针对 A123G 和 A106G 的野生型和突变型设计 ASPE 引物 3 端的特异性引物序列， 而 ASPE 引物 5 端的 Tag 序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18， 相应的， 包被于微球上的与对应tag序列互补配对 的 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.37-SEQ。
47、 ID NO.54。具体设计如下表 ( 表 8) 所示。ASPE 引物的合成、 anti-tag 序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例 1 和实施例 2 所述。 0098 表 8 液相芯片制备的设计 0099 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A15/22 页 18 0100 0101 二、 样品检测 0102 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2 所述检测过程和方法对样品 21-40 进 行检测， 检测结果如下 ： 0103 表 9 样本检测结果与基因多态性分析 0104 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A。
48、16/22 页 19 0105 0106 表 10 样本检测结果与基因多态性分析 0107 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A17/22 页 20 0108 其它针对不同的突变位点的液相芯片， ASPE 引物运用不同的 Tag 序列， 其结果依 然稳定可靠， 具体数据省略。而 ASPE 引物选用实施例 1 中 tag 序列与特异性引物序列搭配 时， 效果更佳 ( 信噪比更好 )， 参见本实施例试验组 2。其它不同 tag 序列与特异性引物序 列搭配， 与实施例 2 和本实施例的结果相同， 具体数据省略。 0109 实施例 4 以 KITLG 基因多态性检测特。
49、异性引物序列的选择 0110 一、 液相芯片制备的设计 ( 野生型和突变型特异性引物序列的选择 ) 0111 以 KITLG 基因 A181G 和 T161G 位点突变检测液相芯片为例， 以该突变位点所在目 说 明 书 CN 102181573 A CN 102181576 A18/22 页 21 标序列的正向或反向互补序列为模板， 分别针对 A181G 和 T161G 的野生型和突变型设计 ASPE 引物 3 端的特异性引物序列， 包括本发明实施例 1 中优选的特异性引物序列和 2 条备 选的特异性引物序列， 如表 11 所示。其中， 内碱基为多态性位点。 0112 表 11 特异性引物序列 0113 0114 以 KITLG 基因 A181G 和 T161G 位点突变检测液相芯片为例， 针对 A181G 和 T161G 选用不同的特异性引物序列， 而 ASPE 引物 5 端的 Tag 序列则固定为实施例 1 中的最佳效 果序列， 并选用与之相对应的 anti-tag 序列， 具体设计如下表 ( 表 12) 所示。ASPE 引物的 合成、 anti-tag 序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如。