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1、(10)授权公告号 CN 102268429 B (45)授权公告日 2013.01.30 CN 102268429 B *CN102268429B* (21)申请号 201110217275.7 (22)申请日 2011.08.01 C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 西南林业大学 地址 650204 云南省昆明市白龙寺 (72)发明人 鄢波 于丽霞 汤晓倩 姚有林 樊国盛 (74)专利代理机构 昆明合众智信知识产权事务 所 53113 代理人 康珉 (54) 发明名称 植物开花相关基因 LFY/FLO 同源片段的快速 克隆方法及其专用引物 (57) 摘要 本发明是植物。
2、开花相关基因LFY/FLO同源 片段的快速克隆方法及其专用引物， 涉及植物 同源基因的快速分离克隆技术领域。该方法的 特征是所用的专用引物 LYF 的核苷酸序列是 5 -TAYATIAAYAARCCIAARATG-3， LYR 的核苷酸 序列是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3 ； 其引物 浓度为25M， 退火温度是44。 本发明能克隆获 得从苔藓植物到种子植物LFY/FLO基因的同源片 段， 适用的植物种类广泛 ； 能较好地避免以 cDNA 作为模板时， 可能存在的由于LFY/FLO基因的同 源片段未表达或表达量低等原因而导致该基因片 段难以扩增的问题 ； 该方法快速、 简。
3、便、 经济和有 效。 (51)Int.Cl. 审查员 彭郁葱 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一对植物开花相关基因LFY/FLO同源片段快速克隆的专用引物， 所述的专用引物是 简并引物 LYF 和 LYR， 所述的 LYF 的核苷酸序列是 5 - TAYATIAAYAARCCIAARATG -3， 所 述的 LYR 的核苷酸序列是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3。 2. 一 种 植 物 开 花 相 。
4、关 基 因LFY/FLO同 源 片 段 的 快 速 克 隆 方 法， 包 括 提 取 植 物样品的基因组 DNA， 用专用引物进行 PCR 扩增， 扩增产物的回收、 克隆和测序， 其特征在于 ： 所述的专用引物是简并引物 LYF 和 LYR， 所述的引物 LYF 的核苷酸 序 列 是 5 - TAYATIAAYAARCCIAARATG -3 ，所 述 的 引 物 LYR 的 核 苷 酸 序 列 是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3 ； 所述的 PCR 扩增的 PCR 反应体系是 ： 在一个 25l 反应 体系里， 10Buffer 2.5l， dNTP Mixture 2l，。
5、 25M LYF 1l ； 25M LYR 1l， 样品 DNA 1l ， 5U/l Taq 酶0.5l， ddH2O 17l ； PCR反应条件是 ： 94预变性2min ； 94 变性 30s， 44退火 30s， 72延伸 30s， 共 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 预期扩增片段大小 为 236bp。 权 利 要 求 书 CN 102268429 B 2 1/4 页 3 植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法及其 专用引物 技术领域 0001 本发明涉及植物同源基因的快速分离克隆技术领域， 具体涉及从苔藓植物到 种子植物的LFY/FLO基因同源片段的快速分离方。
6、法及其专用引物。 背景技术 0002 植物的成花过程是外界环境和内部遗传因子共同协调的结果， 在成花调控网络当 中，LFY基因是 GA 信号和光周期诱导信号转导的枢纽， 是决定花分生组织形成的必需基因， 并具有激活花器官基因活性的重要作用。LFY/FLO同源基因在有花和无花的高等植物中都 存在。LFY/FLO同源基因作为花分生组织特性基因， 是决定从营养生长向生殖生长阶段转变 的重要元件， 且控制着开花时间， 但其并非专一表达于成花相关组织。LFY/FLO同源基因广 泛表达于高等植物的营养性和生殖性组织， 并且可能只有当其表达量达到一定水平时才能 促进成花。LFY基因处于成花调控网络的关键位置。
7、， 不仅调控开花时间和成花转变， 而且在 花序和花的发育中也起重要作用。 0003 目前， 用于植物基因克隆常用的方法有序列克隆法、 功能克隆法、 转座子标记法、 图位克隆法、 消减杂交法和差异表达分析等方法。 尽管以上几种方法已得到了一定的应用， 但普遍存在着耗时长、 成本高等不足。 发明内容 0004 本发明的目的是建立一种从苔藓植物到种子植物都广泛适用的LFY/FLO基因 同源片段简便、 快速的克隆方法， 并提供其专用引物。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 0006 1、 一对植物开花相关基因LFY/FLO同源片段快速克隆的专用引物， 所述的专用引 物是简并引物LYF。
8、和LYR， 所述的LYF的核苷酸序列是5- TAYATIAAYAARCCIAARATG -3， 所述的 LYR 的核苷酸序列是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3。 0007 2、 一种植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法， 包括提取植物样品 的基因组 DNA， 用专用引物进行 PCR 扩增， 扩增产物的回收、 克隆和测序等步骤， 所述的专用 引物是简并引物LYF和LYR， 所述的引物LYF的核苷酸序列是5- TAYATIAAYAARCCIAARATG -3， 所述的引物 LYR 的核苷酸序列是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3 ； 所述的 P。
9、CR 扩增 的 PCR 反应体系是 ： 在一个 25l 反应体系里， 10Buffer 2.5l， dNTP Mixture 2l, （各为 2.5mM） ， 25M LYF 1l ； 25M LYR 1l， 样品 DNA 1l ， 5U/l Taq 酶 0.5l， ddH2O 17l ； PCR 反应条件是 ： 94预变性 2min ； 94变性 30s， 44退火 30s， 72延伸 30s， 共 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 预期扩增片段大小为 236bp ； 所述的专用引物中 Y 表 示 t 或 c, I 表示肌苷 , R 表示 g 或 a， K 表示 g 或 t。 00。
10、08 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 0009 1、 通过本发明所设计的专用引物 （即简并引物 LYF 和 LYR） ， PCR 反应条件的优化， 说 明 书 CN 102268429 B 3 2/4 页 4 能克隆获得从苔藓植物到种子植物LFY/FLO基因的同源片段， 适用的植物种类广泛。 0010 2、 本发明中所用的专用引物是基于第二内含子之后的外显子部分进行引物设计， 可直接用于以基因组 DNA 作为模板的扩增， 能较好地避免以 cDNA 作为模板时， 可能存在的 由于LFY/FLO基因的同源片段未表达或表达量低等原因而导致该基因片段难以扩增的问 题。 0011 3、 本发明。
11、方法快速、 简便、 经济和有效。 附图说明 0012 图 1 是对 PCR 反应温度进行优化的结果， 图中各标记表示 ： 1. 36 ； 2. 39 ； 3. 44 ； 4. 49 ； 5. 55 ； M. DNA Marker。 0013 图 2 是应用本发明所述的简并引物 LYF 和 LYR 对 14 种植物进行 PCR 扩增后的电 泳检测结果， 其中 ： 0014 M 为 Marker， 0015 泳道 1 是罗汉松 ； 泳道 2 是苔藓 ; 泳道 3 是枸骨 ; 泳道 4 是叶子花 ; 泳道 5 是 杜鹃 ; 泳道 6 是桂花 ; 泳道 7 是美人蕉 ; 泳道 8 是绿萝 ; 泳道 9。
12、 是珙桐 ; 泳道 10 是青 冈 ; 泳道 11 是迎春 ; 泳道 12 是日本冬樱 ; 泳道 13 是竹子 ; 泳道 14 是牵牛。 0016 图 3 是从 14 种植物中所克隆的LFY/FLO基因同源片段与已报道的水稻和玉米该 基因片段的氨基酸序列的同源性分析结果， 图中百分数表示相应两种植物LFY/FLO基因同 源片段氨基酸序列的同源性。 具体实施方式 0017 以下结合实施例对本发明做进一步描述， 便于更好地理解本发明， 但并不构成对 本发明的限制， 下例实施例中实验方法均为常规方法， 所用试剂、 耗材， 均能从试剂公司购 买到， 实施例1用本发明方法对如下14种从苔藓植物到种子植物。
13、的不同科属的植物进行了 植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆及其基因同源性分析。 0018 罗汉松 （Podocarpus macrophyllus） ， 罗汉松科， 罗汉松属 ； 0019 苔藓 （Bryophyta） ； 0020 枸骨 （ Ilex cornuta ） ， 冬青科 , 冬青属 ； 0021 叶子花 （Bougainvillea spectabilis） ， 紫茉莉科 , 叶子花属 ； 0022 杜鹃 （Rhododendron hybrida） ， 杜鹃花科， 杜鹃属 ； 0023 桂花 （Osmanthus fragrans） ， 木樨科 , 木犀属 ； 0。
14、024 美人蕉 （Canna indica） ， 美人蕉科， 美人蕉属 ； 0025 绿萝 （Epipremnum aureum） ， 天南星科， 麒麟叶属 ； 0026 珙桐 （Davidia involucrata） ， 珙桐科， 珙桐属 ； 0027 青冈 （Cyclobalanopsis glauca） ， 壳斗科， 青冈属 ； 0028 迎春 （ Jasminum nudiflorum） ， 木犀科 , 素馨属 ； 0029 日本冬樱 （Prunus subhirtella(Miq.)Sok.） ， 蔷薇科 , 李属 ； 0030 慈竹 （Sinocalmus affinis） ， 。
15、禾本科， 牡竹属 ； 0031 牵牛 （Pharbifis nil） ， 旋花科， 牵牛属。 说 明 书 CN 102268429 B 4 3/4 页 5 0032 实施例 1 0033 （1） 专用引物即简并引物 LYF 和 LYR 设计与合成 0034 根据已报道的LFY/FLO同源基因序列设计的简并引物LYF和LYR， 引物LYF的核苷 酸序列是 5 - TAYATIAAYAARCCIAARATG -3（即如 SEQ ID NO:1 所示） ， 引物 LYR 的核苷 酸序列是 5 -ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3（即如 SEQ ID NO:2 所示） ， 预期扩增的目标产 。
16、物为 236bp。 0035 上述专用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。 0036 （2） 用所述的专用引物对上述 14 种植物LFY/FLO同源片段进行 PCR 扩增， 其步骤 如下 ： 0037 样品的采集 0038 所述的 14 种植物样品取自云南省昆明市各公园。 0039 DNA 的提取 0040 应用快捷型植物基因组 DNA 试剂盒 （购于北京天根公司） 从植物组织中提取 DNA， 操作步骤根据天根公司提供的使用说明操作。 0041 PCR 反应条件的优化 0042 本实验用宝生物工程 （大连） 有限公司提供的 Taq 完成 PCR 反应。 0043 利用不同的退火温度进行梯度。
17、PCR， 结果表明， 在36和39以及49的条件下， 所扩增条带较弱， 55时没有目的条带扩增， 5 种不同退火温度中， 44扩增较好， 因此， 最 终确定 44 为本研究的最佳退火温度 （图 1） 。 0044 由于引物LYF和LYR具有较高的简并度， 设计了不同的引物使用浓度， 发现使用标 准浓度 （10M） 时无目的条带， 当引物浓度提高到 25M 时， 可获得目的条带。 0045 PCR 反应 0046 PCR 反应体系 ： 0047 0048 PCR 反应条件 0049 94 2min 说 明 书 CN 102268429 B 5 4/4 页 6 0050 0051 72 10min。
18、 0052 电泳检测 0053 PCR 反应终止后， 取 5lPCR 产物， 1.5% 琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出 236bp 左右的片段即为LFY/FLO同源片段， 如图 2。 0054 克隆和测序 0055 用天根胶回收试剂盒回收纯化 PCR 扩增产物， pMD18-T 载体 （购于宝生物工程有限 公司） 连接， 转化及克隆鉴定按常规操作方法进行， 并送上海生工生物工程技术服务有限公 司完成测序。 0056 序列比对 0057 利用Cluxtal X将所获得的14种植物LFY/FLO基因同源片段与已报道的水稻和玉 米该基因片段进行氨基酸序列比对及同源性分析， 并通过 NCBI BL。
19、AST (http:/www.ncbi. nlm.nih.gov/BALST/) 在线比对 , 均表现出较高的同源性， 如图 3 所示， 说明利用本发明方 法成功地从 14 种植物中克隆获得了LFY/FLO基因的同源片段。 说 明 书 CN 102268429 B 6 1/1 页 7 序列表 西南林业大学 植物开花相关基因 LFY/FLO 同源片段的快速克隆方法及其专用引物 - 2 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 人工序列 i 表示肌苷 1 tayatiaaya arcciaarat g 21 2 20 DNA 人工序列 i 表示肌苷 2 ariykigtig giacrtacca 20 序 列 表 CN 102268429 B 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102268429 B 8 2/3 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 102268429 B 9 3/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 102268429 B 10 。