技术领域
本发明涉及一种异丙醇生产细菌及异丙醇生产方法。
背景技术
丙烯是聚丙烯等合成树脂和石油化学制品的重要的基础原料，广泛 用于汽车用减震器或食品容器、膜、医疗器械等。
因为由来自植物的原料制备的异丙醇可以经过脱水步骤转化为丙 烯，所以有希望作为碳中和的丙烯原料。目前，根据京都议定书，从 2008年至2012年间所有发达国家有义务将二氧化碳排放量与1990年相 比削减5％，碳中和的丙烯由于其广泛适用性而对地球环境极其重要。
已知将来自植物的原料同化生产异丙醇的细菌。例如国际公开2009 /008377号中公开了为了以葡萄糖为原料高效地生产异丙醇而经修饰 的细菌，记载了其作为异丙醇工业生产用生物催化剂优异。
已知在大肠杆菌中不能同化蔗糖，如果能够利用在来自植物的材料 中也为廉价的蔗糖，则在工业上有利。
根据现有的发现，微生物同化蔗糖的机制大致分成蔗糖PTS(磷酸 烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate：Carbohydrate Phosphotransferase System))和蔗糖非PTS两种(例如日本特开2001 -346578号公报)。已知蔗糖非PTS由cscB(进行蔗糖的获取)、cscA (在微生物内部进行蔗糖的分解)、cscK(进行果糖的磷酸化)及cscR (控制cscB、A、K的表达)4个因子构成。Biotechnolohy Letters，Vol.27， pp.1891-1896(2005)中记载了使用质粒将上述4个因子的基因导入D -乳酸生产大肠杆菌，由蔗糖生产D-乳酸。
另外，已知蔗糖PTS由scrA(进行蔗糖的获取)、scrY(进行蔗糖 的磷酸化)、scrB(在微生物内部进行蔗糖的分解)、scrR(控制scrA、 Y、B的表达)及scrK(进行果糖的磷酸化)5个因子构成。
通常，将细菌所不具有的功能导入微生物时，研究表达上述功能的 基因的导入。对于同化蔗糖能力来说，上述各因子的DNA的大小为 900～1500bp，且为了表达用于高效生产异丙醇所需的4种酶(硫解酶、 CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶)的基因，所需的DNA 大小约为4800bp。即，要对大肠杆菌赋予同化蔗糖的能力和生产IPA 的能力两者时，需要导入约9300bp大小的DNA。
但是，由于所要导入的DNA的大小超过了基因导入中使用的质粒 DNA大小的上限，所以将上述两种能力同时导入大肠杆菌非常困难。 即使使用2种质粒载体，控制各个质粒DNA大小在10000bp以下，通 常将2种质粒导入大肠杆菌时，重复增殖过程中某一方或两方的质粒也 经常脱落。为了避免上述现象，需要使大肠杆菌经常暴露在与选择标记 对应的昂贵的抗生素中，不适合工业化生产。
因此，难以对大肠杆菌同时赋予同化蔗糖的能力和高效生产异丙醇 的能力。
另一方面，Can.J.Microbiol.，Vol.45，pp.18-422(1999)公开了通 过向大肠杆菌中仅导入蔗糖水解酶(cscA)，能够以蔗糖作为原料使大 肠杆菌增殖。但是，该论文中同时也记载了通过基因重组技术使cscA 基因大量表达时，cscA几乎全部存在于细胞内，cscA(转化酶)不在细 胞外而在细胞内发挥作用，不能预测cscA在细胞外分解蔗糖。
作为使用不能同化蔗糖的大肠杆菌由蔗糖生产物质的例子，可以举 出以蔗糖作为原料的色氨酸的生产(例如日本特开2001-346578号公 报)。但是，在该例子中表明，为了赋予大肠杆菌由蔗糖生产氨基酸的 能力，需要至少导入cscA、cscB和cscK的基因组。
发明内容
如上所述，由于需要导入的DNA的大小过大，所以同时对不能同 化蔗糖的大肠杆菌赋予同化蔗糖的能力和高效生产异丙醇的能力非常 困难。
本发明的目的在于提供对从廉价且工业上利用价值高的蔗糖有效 地生产异丙醇有用的生产异丙醇的大肠杆菌及异丙醇生产方法。
本发明提供以下生产异丙醇的大肠杆菌及异丙醇生产方法。
〔1〕一种生产异丙醇的大肠杆菌，至少含有属于蔗糖非PTS基因 组的蔗糖水解酶基因，同时赋予或强化了异丙醇生产系统。
〔2〕如〔1〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，属于蔗糖非 PTS基因组的基因中，仅含有上述蔗糖水解酶基因。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述 生产异丙醇的大肠杆菌是赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活 性、CoA转移酶活性及硫解酶活性的大肠杆菌。
〔4〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸 脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性分别是 通过导入编码来自下述细菌的各酶的基因而得到的，所述细菌选自梭菌 属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少1种。
〔5〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸 脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性是通过导入编码来自梭菌属细菌的各 酶的基因而得到的，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编 码来自埃希氏菌属细菌的酶的基因而得到的。
〔6〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸 脱羧酶活性是通过导入编码来自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的，上 述异丙醇脱氢酶活性是通过导入编码来自拜氏梭菌的酶的基因而得到 的，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编码来自大肠杆菌 的各酶的基因而得到的。
〔7〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述编码乙酰 乙酸脱羧酶的基因、编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因 通过质粒被导入，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过宿主大肠 杆菌内的基因组基因得到的。
〔8〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述编码乙酰 乙酸脱羧酶的基因、编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因 通过质粒被导入，上述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过宿主大肠 杆菌内的基因组基因得到的。
〔9〕如〔3〕所述的生产异丙醇的大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸 脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、上述CoA转移酶活性及硫解酶活性 均是通过导入编码来自梭菌属细菌的各酶的基因而得到的。
〔10〕一种异丙醇生产方法，包括使用〔1〕～〔9〕中任一项所述 的生产异丙醇的大肠杆菌由来自含有蔗糖的植物的原料生产异丙醇。
附图说明
[图1]为表示以葡萄糖及果糖作为糖源，培养大肠杆菌B株 10小时时的培养上清液中的糖的减少量的图。
具体实施方式
本发明的生产异丙醇的大肠杆菌为至少含有属于蔗糖非PTS基 因组的蔗糖水解酶基因、同时赋予或强化了异丙醇生产系统的生产 异丙醇的大肠杆菌。
本发明的异丙醇生产方法，包括使用上述生产异丙醇的大肠杆 菌，由来自含有蔗糖的植物的原料生产异丙醇。
本发明的生产异丙醇的大肠杆菌为了同化蔗糖，至少含有构成 蔗糖非PTS基因组的蔗糖水解酶基因，同时具有异丙醇生产系统， 因此，在不能同化蔗糖的大肠杆菌中，同时发挥同化蔗糖的能力和 生产异丙醇的能力，能够由蔗糖有效地生产异丙醇。目前为止完全 没有报道在不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌中导入蔗糖非PTS基因 组，以蔗糖作为碳源生产异丙醇的例子。
本发明发现通过至少将属于构成非PTS基因组的基因组的蔗糖 水解酶基因导入生产异丙醇的大肠杆菌中，即使高效生产异丙醇的 大肠杆菌，也高效率地同化蔗糖。结果，能够显著减小为了赋予同 化蔗糖的能力而导入的DNA大小，能够在1个质粒载体上同时连接 赋予同化蔗糖能力的DNA和赋予异丙醇生产能力的DNA。由此， 能够对不能同化蔗糖的大肠杆菌同时赋予同化蔗糖的能力和生产异 丙醇的能力，能够从来自甘蔗或甜菜的、廉价且能大量供给的蔗糖 有效地得到异丙醇。
特别是，本发明的生产异丙醇的大肠杆菌几乎同时同化蔗糖的 分解产物即葡萄糖和果糖，能够生产异丙醇，因此更有效。
一般认为在大肠杆菌中，通常葡萄糖的摄取优先于果糖，在葡 萄糖存在下不能充分地代谢果糖。因此，令人惊奇的是本发明能够 不受由葡萄糖引起的代谢抑制(分解代谢产物阻遏(catabolite repression))的影响，有效地进行异丙醇的生产。
需要说明的是，在本发明中，所谓“宿主”，是指接收一个以上 的基因从菌体外的导入，结果变为本发明的生产异丙醇的大肠杆菌 的所述大肠杆菌。
在本说明书中，术语“步骤”不仅是独立的步骤，即使在不能与 其它步骤明确区别时，如果能实现本步骤所期望的作用，也包含在 本术语中。
另外，本说明书中，使用“～”表示的数值范围，表示以“～”前后 记载的数值分别作为最小值及最大值所包含的范围。
以下，说明本发明。
所谓本发明的蔗糖非PTS基因组，是指微生物的同化蔗糖途径 中与非PTS系相关的4个基因组。详细而言，为由阻抑蛋白(cscR)、 蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透过酶(cscB)构 成的基因组。本发明中，其中只要至少含有cscA的1种以上即可， 例如可以举出只有cscA、cscA及cscK的组合、cscA及cscB的组合、 cscA及cscR的组合、cscA、cscR及cscK的组合、cscA、cscR及cscB 的组合等。其中，从更有效地生产异丙醇的观点考虑，优选只具有 编码cscA的基因，不含有其它基因。
本发明中的蔗糖水解酶(转化酶，CscA)是指基于国际生物化 学联盟(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号3.2.1.26、催化由蔗 糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反应的酶的总称。
上述酶为K12株及B株等大肠杆菌中本来不具有的酶，为包括 质子共转运体、转化酶、果糖激酶及蔗糖特异性阻抑蛋白的非PTS 代谢途径的酶的1种(参见Canadian Journal of Microbiology，(1991) vol.45，pp418-422)。本发明中，通过赋予上述CscA，特别是通过仅 赋予cscA，菌体外的蔗糖可以在细胞膜上分解为葡萄糖及果糖并被 释放到细胞外，通过葡萄糖PTS及果糖PTS被磷酸化并被引入细胞 质内。结果，果糖被供给至细菌内的果糖代谢系统，并能够利用糖 酵解系统被同化。
作为本发明的被导入宿主细菌中的蔗糖水解酶(转化酶，CscA) 的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖水解酶(转 化酶，CscA)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱 基序列合成的合成DNA序列。作为优选的例子，可以举出来自欧文 菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、 农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球 菌属菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希 氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌 O157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自大肠杆菌 O157株的基因的碱基序列的DNA。另外，优选在cscA中添加用于 使cscA移到菌体的外周胞质的信号序列。
作为本发明的被导入宿主细菌中的阻抑蛋白(CscR)的基因， 可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码阻抑蛋白(CscR)的基 因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成 DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、 变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌 (Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属 菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株 的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株 的基因的碱基序列的DNA。
作为本发明的被导入宿主细菌中的果糖激酶(CscK)的基因， 可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码果糖激酶(CscK)的基 因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成 DNA序列。作为优选例子，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、 变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌 (Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属 菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株 的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157株 的基因的碱基序列的DNA。
作为本发明的被导入宿主细菌中的蔗糖透过酶(CscB)的基因， 可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖透过酶(CscB)的 基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合 成DNA序列。作为优选的例子，例如可以举出来自欧文菌属菌 (Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆 菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属 菌(Staphylococcus)、双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌 属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O157 株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O157 株的基因的碱基序列的DNA。
本发明中所说的生产异丙醇的大肠杆菌，是指通过基因重组导 入或修饰后的具有异丙醇生产能力的大肠杆菌。利用该大肠杆菌， 使其与上述CscA活性组合，即使本来不具有同化蔗糖能力的大肠杆 菌，也可以有效地由蔗糖生产异丙醇。
需要说明的是，本发明的“通过基因重组”的语句，包括全部通 过在原有基因的碱基序列中插入其它DNA、或基因的某部分的置换、 缺失或它们的组合而发生的碱基序列上的改变，例如该基因重组可 以是突变产生的。
本发明中，所谓同化蔗糖，是指将蔗糖直接低分子化或高分子 化，优选低分子化摄入机体内的能力，或代谢转换成其它物质的能 力。另外，本发明中，所谓同化包括将蔗糖进一步低分子化的分解。 详细而言，包括将蔗糖分解为D-葡萄糖和D-果糖。
本发明中的异丙醇生产系统，只要为在作为对象的大肠杆菌中 生产异丙醇的系统即可，可以为任意的系统。
本发明中赋予或强化的异丙醇生产系统，是指通过基因重组导 入或修饰后的、用于发挥异丙醇生产能力的构造。所述异丙醇生产 系统只要是使作为对象的大肠杆菌中的本来的异丙醇生产量增加的 系统即可，可以为任意的系统。优选可以举出与异丙醇生产活性相 关的酶活性的灭活、减少或增强或它们的组合。由此，与上述CscA 活性组合，即使为本来不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌，也能够有 效地由蔗糖生产异丙醇。
优选可以举出赋予与异丙醇的生产相关的被增强了的酶活性。 更优选可以举出硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱 氢酶的酶活性的增强。即，本发明的生产异丙醇的大肠杆菌优选被 赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及 硫解酶活性4种酶活性。
本发明中的活性的“赋予”除了包括将编码酶的基因从宿主细菌 的菌体外导入菌体内之外，还包括通过强化宿主细菌在基因组上具 有的酶基因的启动子活性或与其它启动子置换使酶基因强表达。
本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号4.1.1.4、催化由乙酰乙酸生 成丙酮的反应的酶的总称。
作为所述乙酰乙酸脱羧酶，例如可以举出来自丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii) 等梭菌属细菌、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)等芽孢杆菌属细 菌的乙酰乙酸脱羧酶。
作为本发明的被导入宿主细菌中的乙酰乙酸脱羧酶的基因，可 以利用从上述各来源生物得到的具有编码乙酰乙酸脱羧酶的基因的 碱基序列的DNA或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA 序列。作为优选基因，可以举出来自梭菌属细菌或芽孢杆菌属细菌 的DNA，例如可以举出具有来自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌的基 因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自丙酮丁醇梭菌的基因的碱 基序列的DNA。
本发明中的异丙醇脱氢酶是指基于国际生物化学联盟(I.U.B.) 酶委员会报告被归属于酶编号1.1.1.80、催化由丙酮生成异丙醇的反 应的酶的总称。
作为异丙醇脱氢酶，可以举出来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭菌属细菌的异丙醇脱氢酶。
作为被导入本发明的宿主细菌中的异丙醇脱氢酶的基因，可以 利用从上述各来源生物得到的具有编码异丙醇脱氢酶的基因的碱基 序列的DNA或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。 作为优选基因，可以举出来自梭菌属细菌的DNA，例如具有来自拜 氏梭菌的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的CoA转移酶是指基于国际生物化学联盟(I.U.B.)酶 委员会报告被归属于酶编号2.8.3.8、催化由乙酰乙酰基CoA生成乙 酰乙酸的反应的酶的总称。
作为所述CoA转移酶，例如可以举出来自下述细菌的CoA转移 酶，所述细菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏 梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭菌属细菌、Roseburia intestinalis 等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)等 Faecalibacterium属细菌、粪球菌(Coprococcus)属细菌、布氏锥虫 (Trypanosoma brucei)等锥虫、大肠杆菌(Escherichia coli：大肠杆 菌)等埃希氏菌属细菌。
作为本发明的被导入宿主细菌中的CoA转移酶的基因，可以利 用从上述各来源生物得到的具有编码CoA转移酶的基因的碱基序列 的DNA或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作 为优选的基因，可以为具有来自下述细菌的基因的碱基序列的DNA， 所述细菌为丙酮丁醇梭菌等梭菌属细菌、Roseburia intestinalis等罗 斯氏菌属细菌、普拉梭菌等Faecalibacterium属细菌、粪球菌属细菌、 布氏锥虫等锥虫、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌。作为较优选基因， 可以举出来自梭菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因，特别优选为具 有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
本发明中所说的硫解酶是指基于国际生物化学联盟(I.U.B.)酶 委员会报告被归属于酶编号2.3.1.9、催化由乙酰基CoA生成乙酰乙 酰基CoA的反应的酶的总称。
作为所述硫解酶，例如可以举出来自下述细菌的硫解酶，所述 细菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌 (Clostridium beijerinckii)等梭菌属细菌、大肠杆菌(Escherichia coli) 等埃希氏菌属细菌、盐杆菌种(Halobacterium sp.)细菌、生枝动胶 菌(Zoogloea ramigera)等动胶菌属细菌、红原鸡(Gallus gallus)等 雉科原鸡属、根瘤菌属(Rhizobium sp.)细菌、大豆慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌属细菌、褐家鼠(Rattus norvegicus)等鼠科鼠属细菌、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等 假丝酵母菌属细菌、野猪(Sus scrofa)等猪科猪属细菌、新月柄杆 菌(Caulobacter crescentus)等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌 (Streptomyces collinus)等链霉菌属细菌、向日葵(Helianthus annuus) 等菊科向日葵属细菌、欧洲牛(Bos taurus)等牛科牛属细菌、粪肠 球菌(Enterococcus faecalis)等肠球菌属细菌。
作为本发明的被导入宿主细菌中的硫解酶的基因，可以利用由 上述各来源生物得到的具有编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA 或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选基 因，可以举出具有来自下述细菌的基因的碱基序列的DNA，所述细 菌为丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌 属细菌、盐杆菌种的细菌、生枝动胶菌等动胶菌属细菌、红原鸡等 雉科原鸡属、根瘤菌种的细菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌属细 菌、褐家鼠等鼠科鼠属细菌、热带假丝酵母等假丝酵母菌属细菌、 野猪等猪科猪属细菌、新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌等 链霉菌属细菌、向日葵等菊科向日葵属细菌、欧洲牛等牛科牛属细 菌、粪肠球菌等肠球菌属细菌。作为较优选基因，可以举出来自梭 菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因，特别优选为具有来自丙酮丁醇 梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
其中，从酶活性的观点考虑，优选上述4种酶分别为来自下述 细菌的酶，所述细菌为选自梭菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏 菌属细菌中的至少一种，其中，更优选乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱 氢酶来自梭菌属细菌的情况，CoA转移酶活性及硫解酶活性来自埃 希氏菌属细菌，和所述4种酶均来自梭菌属细菌。
其中，从酶活性的观点考虑，优选本发明中的4种酶分别来自 丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大肠杆菌中的任一种；较优选乙酰乙酸 脱羧酶为来自丙酮丁醇梭菌的酶，CoA转移酶及硫解酶分别为来自 丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的酶，异丙醇脱氢酶为来自拜氏梭菌的酶； 上述4种酶从酶活性的观点考虑，特别优选乙酰乙酸脱羧酶活性来 自丙酮丁醇梭菌，上述异丙醇脱氢酶活性来自拜氏梭菌，CoA转移 酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌。
另外，CoA转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌时，从异丙 醇生产能力的观点考虑优选上述编码乙酰乙酸脱羧酶的基因、编码 异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因通过质粒被导入，上 述CoA转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌内的基因组基因 获得。
作为本发明中与异丙醇的生产相关的酶活性被增强、生产异丙 醇的大肠杆菌的例子，可以举出WO2009/008377号中记载的 pIPA/B株或pIaaa/B株。
本发明中的基因的启动子，只要为能够控制上述任一种基因的 表达的启动子即可，为平常在微生物内发挥作用的强有力的启动子， 并且为即使在葡萄糖存在下也不易受到表达抑制的影响的启动子， 具体可以举出甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称作GAPDH)的 启动子和丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。
本发明中的启动子是指与具有Sigma因子的RNA聚合酶连接 的、开始转录的部位。例如来自大肠杆菌的GAPDH启动子在 GenBank accession number X02662的碱基序列信息中，被记载于碱基 编号397-440中。
来自大肠杆菌的CoA转移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因 (atoB)以atoD、atoA、atoB的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵 子(Journal of Baceteriology Vol.169pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins 等)，因此，通过改变atoD的启动子，能够同时控制CoA转移酶基 因和硫解酶基因的表达。
由此，CoA转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌的基因 组基因得到时，从获得充分的异丙醇生产能力的观点考虑，优选通 过将担负两种酶基因的表达的启动子与其它启动子置换等，强化两 种酶基因的表达。作为用于强化CoA转移酶活性及硫解酶活性的启 动子，可以举出上述来自大肠杆菌的GAPDH启动子等。
本发明中的所述酶的活性可以从菌体外向菌体内导入，或者通 过强化宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性或与其他启 动子置换使酶基因强表达。
酶活性的导入可以通过例如使用基因重组技术将编码所述4种 酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内而进行。此时，被导入的 酶基因与宿主细胞同种或不同种均可。从菌体外向菌体内导入基因 时需要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR (Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成 等的方法，可以按照本领域技术人员公知的通常的方法来进行。所 述方法记载于Sambrook，J.，et.al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989) 等中。
本发明中的能力的“赋予”或“强化”除了包括将编码酶的基因从 宿主细菌的菌体外导入菌体内之外，还包括通过强化宿主细菌在基 因组上具有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强 表达。
本发明中赋予了酶的活性的大肠杆菌是指从菌体外向菌体内通 过任何方法能够赋予该酶活性的大肠杆菌。所述大肠杆菌例如可以 使用下述方法制备，即，使用与上述同样的基因重组技术，将编码 该酶及蛋白质的基因从菌体外导入菌体内等方法。
本发明中强化了酶的活性的大肠杆菌是指使用任何方法强化了 该酶活性的大肠杆菌。所述大肠杆菌例如可以使用下述方法制备， 即，使用与上述同样的基因重组技术，使用质粒将编码该酶及蛋白 质的基因从菌体外导入菌体内，或通过强化宿主大肠杆菌在基因组 上具有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强表达 等方法。
在本发明中，大肠杆菌是指不论本来是否具有从来自植物的原 料生产异丙醇的能力，能够通过使用任何方法具有从来自植物的原 料生产异丙醇的能力的大肠杆菌。
此处，作为用作上述各基因的导入对象的大肠杆菌，可以为不 具有异丙醇生产能力的大肠杆菌，只要能够导入及改变上述各基因， 则可以为任意大肠杆菌。
较优选为预先赋予了异丙醇生产能力的大肠杆菌，由此，能够 更有效地生产异丙醇。特别是，根据本发明，能够对本来不具有同 化蔗糖能力的大肠杆菌赋予同化蔗糖能力，有效地从蔗糖生产异丙 醇。作为上述本来不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌，可以举出K12 株、B株、C株及来自它们的株等。
作为上述生产异丙醇的大肠杆菌，例如可以举出国际公开2009 /008377号说明书中记载的赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢 酶活性、CoA转移酶活性、及硫解酶活性、且能够从来自植物的原 料生成异丙醇的异丙醇生成细菌等。
本发明的异丙醇生产方法包括使用上述生产异丙醇的大肠杆菌 从来自含有蔗糖的植物的原料生产异丙醇，即，包括使上述生产异 丙醇的大肠杆菌和来自含有蔗糖的植物的原料接触进行培养的步 骤、和回收通过接触得到的异丙醇的回收步骤。
上述异丙醇生产方法中使用的来自植物的原料只要为从植物得 到的碳源、且为来自含有蔗糖的植物的原料即可，没有特别的限制。 在本发明中指根、茎、秆、枝、叶、花、种子等器官、含有它们的 植物体、所述植物器官的分解产物，进而在由植物体、植物器官或 它们的分解产物得到的碳源中，能在微生物培养中用作碳源的物质 也包含在来自植物的原料中。
在包含于所述来自植物的原料中的碳源中，除蔗糖之外，作为 通常物质可以举出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、 或者大量含有所述成分的草木质分解产物、纤维素水解物等或它们 的组合，进而来自植物油的甘油或脂肪酸也可以包含在本发明的碳 源中。
作为本发明中的来自植物的原料的例子，可以优选举出谷物等 农作物、玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等或它们的组 合，作为这些原料的使用形态为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有 特别限定。另外，可以为仅是上述碳源的形态。
培养步骤中的生产异丙醇的大肠杆菌与来自植物的原料的接触 一般通过在含有来自植物的原料的培养基中培养生产异丙醇的大肠 杆菌而进行。
来自植物的原料与生产异丙醇的大肠杆菌的接触密度根据生产 异丙醇的大肠杆菌的活性而不同，但通常作为培养基中来自植物的 原料的浓度，以换算为葡萄糖计，可以使最初的糖浓度相对于混合 物的总质量为20质量％以下，从大肠杆菌的耐糖性的观点考虑，优 选可以使最初的糖浓度为15质量％以下。其他各成分只要以在微生 物的培养基中通常添加的量进行添加即可，没有特别限定。
另外，作为培养基中的生产异丙醇的大肠杆菌的含量，根据大 肠杆菌的种类及活性而不同，通常可以使培养开始时投入的预培养 的菌液的量相对于培养液为0.1质量％～30质量％，从控制培养条 件的观点考虑，优选可以为1质量％～10质量％。
作为生产异丙醇的大肠杆菌的培养中使用的培养基，只要为含 有了碳源、氮源、无机离子及微生物用于生产异丙醇所需的有机微 量元素、核酸、维生素类等的培养基即可，没有特别限制。
作为碳源，除蔗糖之外，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等 糖类；富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸；甲醇、乙醇、丙三醇等 醇类及其他。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、 氨水等无机体氮源；及蛋白质水解物等有机体氮源及其他。作为无 机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离 子、锰离子及其他。
作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有它 们的酵母提取物、蛋白胨、玉米浆(Corn Steep Liquor)、酪蛋白分 解产物及其他。
另外，可以以通常使用的量含有通常被添加到微生物的培养基 中的其他添加成分，例如抗生素等。需要说明的是，为了抑制反应 时的发泡，优选适当添加消泡剂。上述成分在培养基中的含量通常 只要为大肠杆菌的培养所适用的范围即可，没有特别限制。
需要说明的是，作为本发明中使用的培养基，若从用于工业生 产方面考虑，优选液体培养基。
本方法中，从分离·回收率的观点考虑，优选异丙醇以溶解在培 养基和来自植物的原料的混合液中的形态、或溶解在捕集液中的形 态进行回收。作为捕集液，可以举出甲苯或二甲基甲酰胺等有机溶 剂或水等。作为捕集液，其中，优选易于分离异丙醇生产时副产的 挥发性杂质和异丙醇的水。作为上述回收方法，例如可以举出国际 公开2009/008377号说明书中记载的方法等。
作为在能以溶解在捕集液或混合物中的形态回收的异丙醇的生 产方法中能够使用的装置，例如可以举出国际公开2009/008377号 说明书的图1所示的生产装置。
在上述生产装置中，在容纳有含有异丙醇生产细菌和来自植物 的原料的培养基的培养槽上，连接有用于从装置外部注入气体的注 入管，能够对培养基通气。
另外，在培养槽上通过连接管连接有捕集槽，所述捕集槽容纳 有作为捕捉液的捕集液(trap solution)。此时，向捕集槽移动的气 体或液体与捕集液接触发生起泡。
由此，在培养槽中通过通气培养生成的异丙醇由于通气而蒸发， 易于从培养基中分离，同时在捕集槽中被捕集液捕集。结果，能够 以进一步精制的形态连续且简便地生产异丙醇。
实施例
以下记载本发明的实施例，但本发明并不限于此。需要说明的 是，记载中的“％”若没有特别说明则为质量基准。
[实施例1]
<来自大肠杆菌的硫解酶基因、来自大肠杆菌的CoA转移酶基 因、来自梭菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭菌属细菌的异 丙醇脱氢酶基因、来自大肠杆菌O157的转化酶基因表达载体及该表 达载体转化体的构筑>
已经报道了大肠杆菌的硫解酶及大肠杆菌的CoA转移酶的氨基 酸序列和基因的碱基序列。即，编码硫解酶的基因被记载于在 GenBank accession number U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基 因组序列的2324131～2325315中。另外，编码CoA转移酶的基因 被记载于上述大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322781 中。
作为用于使上述基因表达所需的启动子的碱基序列，可以使用 在GenBank accession number X02662的碱基序列信息中，记载于397 -440中的来自大肠杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称作 GAPDH)的启动子序列。
为了取得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组 DNA作为模板，通过cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(序列号1) 及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(序列号2)按照PCR法进行扩增， 将得到的DNA片段用限制酶NdeI、SphI进行消化，由此得到约100bp 的对应于GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段、和用 限制酶NdeI及SphI消化质粒pBR322(GenBank accession number J01749)而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌 DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含 有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。将得到的菌 落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃下培 养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认GAPDH启动子被正确插 入，将该质粒命名为pBRgapP。
为了取得异丙醇脱氢酶基因，使用Clostridium beijerinckii NRR L B-593的基因组DNA作为模板，通过aatatgcatgctggtggaacatatga aaggttttgcaatgctagg(序列号3)及gcggatccggtaccttataatataactactgcttta attaagtc(序列号4)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限 制酶SphI、BamHI进行消化，由此得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片 段。将得到的DNA片段、与用限制酶SphI及BamHI消化之前构筑 的pBRgapP而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆 菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到 在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。将得到 的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下 培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认异丙醇脱氢酶被正确插 入，将该质粒命名为pGAP-IPAdh。
为了取得来自大肠杆菌的硫解酶基因，使用大肠杆菌MG 1655 株的基因组DNA作为模板，通过atggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgt catcgtcag(序列号5)及gcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc(序 列号6)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶BamH I、HindIII进行消化，由此得到约1.2kbp的硫解酶片段。将得到的D NA片段、与用限制酶BamHI及HindIII消化之前制成的质粒pGAP- IPAdh而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH 5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有 50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。将得到的菌落 在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃下培养 一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认硫解酶基因被正确插入，将 该质粒命名为pGAP-IPAdh-atoB。
为了取得来自大肠杆菌的CoA转移酶α亚基基因，使用大肠杆 菌MG1655株的基因组DNA作为模板，通过gctctagagctggtggaacatat gaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列号7)及tagcaagcttctactcgagttatttgc tctcctgtgaaacg(序列号8)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片 段用限制酶XbaI、HindIII进行消化，由此得到约600bp的CoA转 移酶α亚基片段。将得到的DNA片段、和用限制酶XbaI及HindIII 消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB而得到的片段混合，使用连 接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式 会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂 板上繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的L B液体培养基中，于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒， 确认CoA转移酶α亚基基因被正确插入，将该质粒命名为pGAP-IP Adh-atoB-atoD。
进而，为了得到来自大肠杆菌的CoA转移酶β亚基基因，使用 大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，通过aagtctcgagctggt ggaacatatggatgcgaaacaacgtattg(序列号9)及ggccaagcttcataaatcaccccg ttgc(序列号10)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制 酶XhoI、HindIII进行消化，由此得到约600bp的CoA转移酶β亚 基片段。将得到的DNA片段、和用限制酶XhoI及HindIII消化之前 制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD而得到的片段混合，使用连接 酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会 社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板 上繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基上，于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确 认CoA转移酶β亚基基因被正确插入，将该质粒命名为pGAP-IP Adh-atoB-atoD-atoA。
进而，为了取得来自大肠杆菌O 157株的cscA，使用大肠杆菌O 157株的基因组DNA作为模板，通过gctggtggaacatatgacgcaatctcgatt gcatg(序列号11)及ttaacccagttgccagagtgc(序列号12)按照PCR 法进行扩增，将得到的DNA片段用T4多核苷酸激酶进行末端磷酸 化，由此得到约1470bp的cscA片段。将该DNA片段、和将之前制 成的pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA用限制酶HindIII消化后用T 4DNA聚合酶进行平端化进而用碱性磷酸酶将末端脱磷酸化得到的 片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受 态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/m L氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质 粒，连接CoA转移酶β亚基基因的3’末端侧和cscA的5’末端侧， 将确认了cscA被正确插入的质粒命名为pGAP-IPAdh-atoB-atoD -atoA-cscA。
需要说明的是，大肠杆菌O157的基因组可以从标准物质及计量 技术研究所获得。
为了取得乙酰乙酸脱羧酶基因，使用Clostridium acetobutylicu m ATCC824的基因组DNA作为模板，通过caggtaccgctggtggaacatat gttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列号13)、及gcggatccttacttaagata atcatatataacttcagc(序列号14)按照PCR法进行扩增，将得到的DN A片段用限制酶KpnI、BamHI进行消化，由此得到约700bp的乙酰 乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段、和用限制酶KpnI及BamHI 消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA-cscA而得到 的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态 细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL 氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到 的菌体中回收质粒，确认乙酰乙酸脱羧酶基因被正确插入，将该质 粒命名为pGAP-Iaaa-cscA。将该质粒转化到大肠杆菌B株(ATCC1 1303)中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上于37℃下培 养一夜，将得到的转化体作为pGAP-Iaaa-cscA/B株。
[实施例2]
<使用3L培养槽、利用大肠杆菌pGAP-Iaaa-cscA/B株由蔗糖 生产异丙醇>
本实施例中，使用WO2009/008377号说明书图1所示的生产 装置进行异丙醇的生产。培养槽使用3升容积的槽，捕集槽使用10L 容积的槽。培养槽、捕集槽、注入管、连接管、排出管均为玻璃制。 在捕集槽中，以6L的量注入作为捕集液的水(捕集水)。需要说明 的是，在培养槽中设置废液管，将由糖和中和剂的流入而增加的培 养液适当排出至培养槽外。
作为预培养，在加入了25mL含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的100mL容量的锥形瓶中接种 实施例1中得到的pGAP-Iaaa-cscA/B株，在培养温度35℃、120rpm 的条件下搅拌培养一夜。将全部量的预培养液移至装入了1475g以 下所示组成的培养基的3L容积的培养槽(ABLE公司制培养装置 BMJ-01)中，进行培养。
培养在大气压下、在通气量1.5L/min、搅拌速度550rpm、培 养温度35℃、pH7.0(用NH3水溶液调节)下进行。从培养开始至8 小时后的期间，以5g/L/小时的流速添加40wt/wt％的蔗糖水溶 液。之后，以15g/L/小时的流速添加40wt/wt％的蔗糖水溶液。 从培养开始至48小时后，对菌体培养液取样，通过离心操作除去菌 体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇 的蓄积量。
<培养基组成>
玉米浆(日本食品化工制)：20g/L
Fe2SO4·7H2O：0.09g/L
K2HPO4：2g/L
KH2PO4：2g/L
MgSO4·7H2O：2g/L
(NH4)2SO4：2g/L
Adecanol LG126(旭电化工业)0.6g/L
(剩余部分：水)
结果，培养开始48小时后确认到蓄积有5.9g/L的异丙醇。需 要说明的是，测定值为培养后的培养液和捕集水(6L)中的合计值。
由上述结果可知，通过在蔗糖非PTS基因组中导入cscA分解蔗 糖，作为分解产物的葡萄糖和果糖被迅速摄入细胞内，转化为异丙 醇。
[实施例3]
强化宿主大肠杆菌的基因组上的CoA转移酶基因(atoD及atoA) 和硫解酶基因(atoB)的表达，在导入的质粒载体上仅连接乙酰乙 酸脱羧酶基因、异丙醇脱氢酶基因及cscA，使质粒全长的DNA大小 变小，尝试由蔗糖生产异丙醇。
<大肠杆菌B株基因组上atoD启动子置换为GAPDH启动子>
大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全部碱基序列是公知的 (GenBank accession number U00096)，还报道了编码大肠杆菌 MG1655株的CoA转移酶α亚基的基因(以下有时简写为atoD)的 碱基序列。即，atoD记载于在GenBank accession number U00096中 记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322131中。
作为用于表达上述基因所需的启动子的碱基序列，可以使用在 GenBank accession number X02662的碱基序列信息中，记载于397- 440的来自大肠杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称作 GAPDH)的启动子序列。为了取得GAPDH启动子，使用大肠杆菌 MG1655株的基因组DNA作为模板，通过 cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列号15)及 acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列号16)按照PCR法进行扩增， 将得到的DNA片段用限制酶MfeI及EcoRI消化，由此得到约100bp 的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段和用限制 酶EcoRI消化质粒pUC19(GenBank accession number X02514)、进 而进行碱性磷酸酶处理而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转 化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903) 中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。 将得到的10个菌落分别在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培 养基中于37℃下培养一夜，回收质粒，选择用限制酶EcoRI及KpnI 进行消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列， 将GAPDH启动子被正确插入的质粒作为pUCgapP。将得到的 pUCgapP用限制酶EcoRI及KpnI消化。
进而，为了取得atoD，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA 作为模板，通过cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序 列号17)及gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序列号18)按照PCR法 进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶EcoRI及KpnI消化，由此 得到约690bp的atoD片段。将该DNA片段与之前用限制酶EcoRI 及KpnI消化后的pUCgapP混合，使用连接酶连接后，转化到大肠 杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得 到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。从得 到的菌体中回收质粒，确认atoD被正确插入，将该质粒命名为 pGAPatoD。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可以由美国标准生物品收 藏中心(American Type Culture Collection)获得。
如上所述，还报道了大肠杆菌MG1655株的基因组DNA中的 atoD的碱基序列。使用基于大肠杆菌MG1655株的atoD的5’附近区 域的基因信息制成的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序列号19)和 tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列号20)，以大肠杆菌MG1655株 的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.1kbp的DNA片 段。
另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列 信息制作的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列号21)和基于大肠杆 菌MG1655株的atoD的序列信息制作的序列号18的引物，以上述 制作的表达载体pGAPatoD作为模板进行PCR，得到具有GAPDH 启动子和atoD的约790bp的DNA片段。
将如上得到的片段分别用限制酶PstI和XbaI、XbaI和KpnI消 化，将该片段和将温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)〕 用PstI和KpnI消化得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到 DH5α株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上于30℃繁 殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养 基中于30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒转化 到大肠杆菌B株(ATCC11303)中，在含有10μg/ml氯霉素的LB 琼脂板上于30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种在 含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上，在30℃下培养一夜。将 得到的培养菌体涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在 42℃下培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养 基中于30℃下培养2小时，涂布在不含抗生素的LB琼脂板上，得 到在42℃下繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机地取出100个菌落，分别使它们在不含抗 生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上繁殖，选 择氯霉素感受性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA 中使含有GAPDH启动子和atoD的约790bp片段扩增，选择atoD启 动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名 为大肠杆菌B株atoD缺失GAPpatoD基因组插入株。
需要说明的是，大肠杆菌B株(ATCC11303)可以从作为细胞·微 生物·基因文库的美国标准生物品收藏中心获得。
[实施例4]
<来自梭菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭菌属细菌的 异丙醇脱氢酶基因表达载体及该表达载体转化体的构筑>
梭菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶记载于GenBank accession number M55392中，异丙醇脱氢酶记载于GenBank accession number AF157307中。
为了取得异丙醇脱氢酶基因，使用Clostridium beijerinckii NRR L B-593的基因组DNA作为模板，通过AATATGCATGCTGGTG GAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列号3)及gcggat ccttataatataactactgctttaattaagtc(序列号22)按照PCR法进行扩增，将 得到的DNA片段用限制酶SphI、BamHI消化，由此得到约1.1kbp 的异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段、与用限制酶SphI及Ba mHI消化之前制成的质粒pBRgapP而得到的片段混合，使用连接酶 连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社 DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上 繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液 体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体回收质粒，确认IPAd h被正确插入，将该质粒命名为pGAP-IPAdh。
为了取得乙酰乙酸脱羧酶基因，使用Clostridium acetobutylicu m ATCC824的基因组DNA作为模板，通过caggatccgctggtggaacatat gttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列号23)及ggaattcggtaccttacttaag ataatcatatataacttcagc(序列号24)按照PCR法进行扩增，将得到的D NA片段用限制酶BamHI、EcoRI消化，由此得到约700bp的乙酰乙 酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段、与用限制酶BamHI及EcoRI 消化之前制成的质粒pGAP-IPAdh而得到的片段混合，使用连接酶 连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社 DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上 繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液 体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认ad c被正确插入，将该质粒命名为pGAP-Ia。
将上述质粒pGAP-Ia转化到实施例3中制成的大肠杆菌B株 atoD缺失GAPpatoD基因组插入株的感受态细胞中，在含有50μg/mL 氨苄青霉素的LB琼脂板上于37℃下培养一夜，由此得到大肠杆菌 pGAP-Ia/GAPpatoD基因组插入株。
需要说明的是，Clostridium acetobutylicum ATCC824、大肠杆菌 B株可以从作为细胞·微生物·基因文库的美国标准生物品收藏中心获 得。另外，Clostridium beijerinckii NRRL B-593可以从作为细胞·微 生物文库的VTT生物品收藏中心获得。
[实施例5]
<来自梭菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭菌属细菌的 异丙醇脱氢酶基因、来自大肠杆菌O157的转化酶基因表达载体及该 表达载体转化体的构筑>
大肠杆菌O157株的基因组DNA的全部碱基序列是公知的 (GenBank accession number AE005174)，还报道了编码大肠杆菌 O157株的转化酶的基因(以下有时简写为cscA)的碱基序列。即， cscA记载于在GenBank accession number AE005174中记载的大肠杆 菌O157株基因组序列的3274383～3275816中。
为了取得cscA，使用大肠杆菌O157株的基因组DNA作为模板， 通过ATGGTACCGCTGGTGGAACATATGACGCAATCTCGATTGC ATG(序列号25)及CGAATTCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序 列号26)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶KpnI 及EcoRI消化，由此得到约1470bp的cscA片段。将上述DNA片段、 和用限制酶KpnI及EcoRI消化之前实施例4中制成的pGAP-Ia(来 自梭菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭菌属细菌的异丙醇脱 氢酶基因表达载体)而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化 到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903) 中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖的转化体。 从得到的菌体中回收质粒，确认cscA被正确插入，将该质粒命名为 pGAP-Ia-cscA。
将上述质粒pGAP-Ia-cscA转化到实施例3中制成的大肠杆菌B 株atoD缺失GAPpatoD基因组插入株的感受态细胞中，在含有50μg /mL氨苄青霉素的LB琼脂板上，于37℃下培养一夜，由此得到大 肠杆菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因组插入株。
需要说明的是，大肠杆菌O157的基因组可以从标准物质及计量 技术研究所获得。
[实施例6]
<使用3L培养槽、利用大肠杆菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基 因组插入株由蔗糖生产异丙醇>
使用实施例5中得到的大肠杆菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基因 组插入株，与实施例2同样地进行异丙醇生产研究。
另外，测定培养槽中的蔗糖、葡萄糖、果糖的蓄积量，结果示 于表1。
结果，在培养开始48小时后确认到蓄积了31.4g/L的异丙醇。 需要说明的是，测定值为培养后的培养液和捕集水中的合计值。
[表1]
由上述结果可知，选择来自梭菌属细菌的基因用于乙酰乙酸脱 羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性，将它们仅与蔗糖非PTS基因组中的 cscA导入，由此分解蔗糖，作为分解产物的葡萄糖和果糖被迅速摄 入细胞内，转化为异丙醇。另外，本结果中，虽然通过蔗糖的分解 应等摩尔生成葡萄糖和果糖，但果糖在培养基中不蓄积，能确认到 有效地进行异丙醇的生产而不受由葡萄糖产生的代谢抑制(分解代 谢产物阻遏)的影响。
[实施例7]
<使用1L培养槽、利用大肠杆菌pGAP-Ia-cscA/GAPpatoD基 因组插入株由糖蜜生产异丙醇>
与实施例6同样地进行异丙醇生产研究。其中，使用80wt/wt％ 的糖蜜(大日本明治精糖制)代替40wt/wt％的蔗糖水溶液进行。 培养开始48小时后确认到蓄积了29.4g/L的异丙醇。需要说明的 是，测定值为培养后的培养液和捕集水中的合计值。
[比较例1]
<使用3L培养槽、利用大肠杆菌pGAP-Ia/GAPpatoD基因组 插入株生产异丙醇>
在与实施例2同样的条件下，针对实施例4中制成的pGAP-Ia /GAPpatoD基因组插入株进行异丙醇培养研究。结果，即使在48 小时后也未确认到异丙醇的生产，添加的蔗糖几乎以相同量残留在 培养上清液中。
上述结果表明即使赋予异丙醇生产能力，如果不导入CscA，则 不能生产异丙醇。
[比较例2]
<使用3L培养槽、利用大肠杆菌pGAP-Ia-cscA/B株生产异丙 醇>
将实施例5中制成的质粒pGAP-Ia-cscA转化到大肠杆菌B株 (ATCC 11303)中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上， 于37℃下培养一夜，以得到的转化体作为pGAP-Ia-cscA/B株。对 于制成的pGAP-Ia-cscA/B株，在与实施例2相同的条件下，进行 异丙醇培养研究。在48小时未确认到异丙醇的生产。
上述结果表明如果不赋予异丙醇生产能力，即使仅将CscA导入 大肠杆菌B株，也不能生产异丙醇。
[比较例3]
<大肠杆菌B株中的由葡萄糖产生的代谢抑制(分解代谢产物 阻遏)的确认>
确认到作为本发明的生产异丙醇的大肠杆菌的宿主的B株为本 来受由葡萄糖引起的代谢抑制(分解代谢产物阻遏)的影响的大肠 杆菌。
作为预培养，在加入了5mL LB Broth，Miller培养液 (Difco244620)的14mL容量的塑料管(FALCON社制2057)中接 种大肠杆菌B株(ATCC11303)，在培养温度37℃、120rpm的条件 下搅拌培养一夜。将0.3mL预培养液移至装入了30mL表2所述的 1～4组成的培养基的100mL容量的三角瓶(Baffled Flasks)中，进 行培养。培养在搅拌速度120rpm、培养温度37℃下进行。
从培养开始0、2、4、6、8、10小时后对菌体培养液取样，通 过离心操作除去菌体后，用F-试剂盒葡萄糖/果糖(J.K.国际产 品编号139106)测定得到的培养上清液中的葡萄糖和果糖的含量。 结果示于图1。图1中黑圆点表示葡萄糖的减少量，白圆点表示果糖 的减少量。进而，算出从培养第0小时开始的各培养时间下葡萄糖 或果糖的减少程度。各培养基中的10小时后的葡萄糖减少量示于表 2。
[表2]
如表2所示，比较10小时后的果糖葡萄糖减少量，结果表明仅 含有果糖作为糖源的培养基No.4变为3.4g/L，相对于此，在含有 糖源为葡萄糖和果糖两者的培养基No.2中，果糖的摄入被抑制。由 此确认到在B株中糖源单独为果糖时，与葡萄糖同样地摄入果糖， 但葡萄糖和果糖共存时，果糖的摄入被抑制。
综上所述，根据本发明，能够提供用于从廉价且工业上利用价 值高的蔗糖有效地生产异丙醇的有用的生产异丙醇的大肠杆菌及异 丙醇生产方法。
2009年9月16日申请的日本国专利申请第2009-214694号公 开的全部内容通过参照被引入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术规格，与各文献、 专利申请及技术标准通过参照被具体且单独记载的情况相同程度地 被引入本说明书中。