异丙醇生产细菌及异丙醇生产方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102498203 A (43)申请公布日 2012.06.13 CN 102498203 A *CN102498203A* (21)申请号 201080039906.4 (22)申请日 2010.09.13 2009-214694 2009.09.16 JP C12N 1/21(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12P 7/04(2006.01) (71)申请人 三井化学株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 森重敬 高桥均 竹林望 和田光史 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 杨宏军 (54) 发明名称 异

2、丙醇生产细菌及异丙醇生产方法 (57) 摘要 本发明提供一种生产异丙醇的大肠杆菌， 该 大肠杆菌至少含有属于蔗糖非 PTS 基因组的蔗糖 水解酶基因， 同时被赋予或强化了异丙醇生产系 统。本发明还提供使用该大肠杆菌由来自含有蔗 糖的植物的原料生产异丙醇的异丙醇生产方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.03.07 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2010/065770 2010.09.13 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/034031 JA 2011.03.24 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 17 页 序列表 5 页

3、附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 17 页 序列表 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种生产异丙醇的大肠杆菌， 至少含有属于蔗糖非 PTS 基因组的蔗糖水解酶基因， 同时被赋予或强化了异丙醇生产系统。 2. 如权利要求 1 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 仅含有所述属于蔗糖非 PTS 基因组的 基因中的蔗糖水解酶基因。 3.如权利要求1或2所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述生产异丙醇的大肠杆菌 是被赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇脱氢酶活性、 CoA 转移酶活性及硫解酶活性的大肠 杆菌。 4. 如权利要求

4、3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙 醇脱氢酶活性、 CoA 转移酶活性及硫解酶活性， 分别是通过导入编码来自下述细菌的各酶的 基因而得到的， 所述细菌为选自梭菌属细菌、 芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少 1 种。 5. 如权利要求 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述乙酰乙酸脱羧酶活性及异 丙醇脱氢酶活性是通过导入编码来自梭菌属细菌的各酶的基因而得到的， 所述 CoA 转移酶 活性及硫解酶活性是通过导入编码来自埃希氏菌属细菌的酶的基因而得到的。 6. 如权利要求 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述乙酰乙酸脱羧酶活性是通 过导入编

5、码来自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的， 所述异丙醇脱氢酶活性是通过导入编 码来自拜氏梭菌的酶的基因而得到的， 所述 CoA 转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编码 来自大肠杆菌的各酶的基因而得到的。 7. 如权利要求 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述编码乙酰乙酸脱羧酶的基 因、 编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因通过质粒被导入， 所述 CoA 转移酶 活性及硫解酶活性是通过宿主大肠杆菌内的基因组基因得到的。 8.如权利要求7所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述用于表达编码CoA转移酶的 基因及编码硫解酶的基因的启动子为甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶启动子及丝氨酸羟甲基转

6、移 酶启动子中的至少一个。 9. 如权利要求 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 所述乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙 醇脱氢酶活性、 所述 CoA 转移酶活性及硫解酶活性均是通过导入编码来自梭菌属细菌的各 酶的基因而得到的。 10.一种异丙醇生产方法， 包括使用权利要求19中任一项所述的生产异丙醇的大肠 杆菌由来自含有蔗糖的植物的原料生产异丙醇。 权 利 要 求 书 CN 102498203 A 2 1/17 页 3 异丙醇生产细菌及异丙醇生产方法 技术领域 0001 本发明涉及一种异丙醇生产细菌及异丙醇生产方法。 背景技术 0002 丙烯是聚丙烯等合成树脂和石油化学制品的重要的基础原料，

7、广泛用于汽车用减 震器或食品容器、 膜、 医疗器械等。 0003 因为由来自植物的原料制备的异丙醇可以经过脱水步骤转化为丙烯， 所以有希望 作为碳中和的丙烯原料。目前， 根据京都议定书， 从 2008 年至 2012 年间所有发达国家有义 务将二氧化碳排放量与 1990 年相比削减 5， 碳中和的丙烯由于其广泛适用性而对地球环 境极其重要。 0004 已知将来自植物的原料同化生产异丙醇的细菌。例如国际公开 2009/008377 号中 公开了为了以葡萄糖为原料高效地生产异丙醇而经修饰的细菌， 记载了其作为异丙醇工业 生产用生物催化剂优异。 0005 已知在大肠杆菌中不能同化蔗糖， 如果能够利用

8、在来自植物的材料中也为廉价的 蔗糖， 则在工业上有利。 0006 根据现有的发现， 微生物同化蔗糖的机制大致分成蔗糖 PTS( 磷酸烯醇丙酮酸 ： 糖 磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate ： Carbohydrate Phosphotransferase System)和 蔗糖非PTS两种(例如日本特开2001-346578号公报)。 已知蔗糖非PTS由cscB(进行蔗糖 的获取 )、 cscA( 在微生物内部进行蔗糖的分解 )、 cscK( 进行果糖的磷酸化 ) 及 cscR( 控制 cscB、 A、 K 的表达 )4 个因子构成。Biotechnolohy Letter

9、s， Vol.27， pp.1891-1896(2005) 中记载了使用质粒将上述 4 个因子的基因导入 D- 乳酸生产大肠杆菌， 由蔗糖生产 D- 乳酸。 0007 另外， 已知蔗糖 PTS 由 scrA( 进行蔗糖的获取 )、 scrY( 进行蔗糖的磷酸化 )、 scrB( 在微生物内部进行蔗糖的分解 )、 scrR( 控制 scrA、 Y、 B 的表达 ) 及 scrK( 进行果糖 的磷酸化 )5 个因子构成。 0008 通常， 将细菌所不具有的功能导入微生物时， 研究表达上述功能的基因的导入。 对 于同化蔗糖能力来说， 上述各因子的DNA的大小为9001500bp， 且为了表达用于高效

10、生产 异丙醇所需的 4 种酶 ( 硫解酶、 CoA 转移酶、 乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶 ) 的基因， 所 需的 DNA 大小约为 4800bp。即， 要对大肠杆菌赋予同化蔗糖的能力和生产 IPA 的能力两者 时， 需要导入约 9300bp 大小的 DNA。 0009 但是， 由于所要导入的DNA的大小超过了基因导入中使用的质粒DNA大小的上限， 所以将上述两种能力同时导入大肠杆菌非常困难。即使使用 2 种质粒载体， 控制各个质粒 DNA 大小在 10000bp 以下， 通常将 2 种质粒导入大肠杆菌时， 重复增殖过程中某一方或两方 的质粒也经常脱落。为了避免上述现象， 需要使大肠杆菌经常暴

11、露在与选择标记对应的昂 贵的抗生素中， 不适合工业化生产。 0010 因此， 难以对大肠杆菌同时赋予同化蔗糖的能力和高效生产异丙醇的能力。 0011 另一方面， Can.J.Microbiol.， Vol.45， pp.18-422(1999) 公开了通过向大肠杆菌 说 明 书 CN 102498203 A 3 2/17 页 4 中仅导入蔗糖水解酶(cscA)， 能够以蔗糖作为原料使大肠杆菌增殖。 但是， 该论文中同时也 记载了通过基因重组技术使 cscA 基因大量表达时， cscA 几乎全部存在于细胞内， cscA( 转 化酶 ) 不在细胞外而在细胞内发挥作用， 不能预测 cscA 在细胞外

12、分解蔗糖。 0012 作为使用不能同化蔗糖的大肠杆菌由蔗糖生产物质的例子， 可以举出以蔗糖作为 原料的色氨酸的生产 ( 例如日本特开 2001-346578 号公报 )。但是， 在该例子中表明， 为了 赋予大肠杆菌由蔗糖生产氨基酸的能力， 需要至少导入 cscA、 cscB 和 cscK 的基因组。 发明内容 0013 如上所述， 由于需要导入的 DNA 的大小过大， 所以同时对不能同化蔗糖的大肠杆 菌赋予同化蔗糖的能力和高效生产异丙醇的能力非常困难。 0014 本发明的目的在于提供对从廉价且工业上利用价值高的蔗糖有效地生产异丙醇 有用的生产异丙醇的大肠杆菌及异丙醇生产方法。 0015 本发明

13、提供以下生产异丙醇的大肠杆菌及异丙醇生产方法。 0016 1 一种生产异丙醇的大肠杆菌， 至少含有属于蔗糖非 PTS 基因组的蔗糖水解酶 基因， 同时赋予或强化了异丙醇生产系统。 0017 2 如 1 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 属于蔗糖非 PTS 基因组的基因中， 仅含有上述蔗糖水解酶基因。 0018 3 如 1 或 2 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述生产异丙醇的大肠杆 菌是赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇脱氢酶活性、 CoA 转移酶活性及硫解酶活性的大肠 杆菌。 0019 4 如 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇 脱氢酶活性

14、、 CoA 转移酶活性及硫解酶活性分别是通过导入编码来自下述细菌的各酶的基 因而得到的， 所述细菌选自梭菌属细菌、 芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少 1 种。 0020 5 如 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙 醇脱氢酶活性是通过导入编码来自梭菌属细菌的各酶的基因而得到的， 上述 CoA 转移酶活 性及硫解酶活性是通过导入编码来自埃希氏菌属细菌的酶的基因而得到的。 0021 6 如 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述乙酰乙酸脱羧酶活性是通过 导入编码来自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的， 上述异丙醇脱氢酶活性是通过导入编码 来自拜氏梭菌的酶

15、的基因而得到的， 上述 CoA 转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编码来 自大肠杆菌的各酶的基因而得到的。 0022 7 如 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述编码乙酰乙酸脱羧酶的基因、 编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因通过质粒被导入， 上述 CoA 转移酶活性 及硫解酶活性是通过宿主大肠杆菌内的基因组基因得到的。 0023 8 如 3 所述的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述编码乙酰乙酸脱羧酶的基因、 编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基因通过质粒被导入， 上述 CoA 转移酶活性 及硫解酶活性是通过宿主大肠杆菌内的基因组基因得到的。 0024 9 如 3 所述

16、的生产异丙醇的大肠杆菌， 其中， 上述乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇 脱氢酶活性、 上述 CoA 转移酶活性及硫解酶活性均是通过导入编码来自梭菌属细菌的各酶 的基因而得到的。 说 明 书 CN 102498203 A 4 3/17 页 5 0025 10 一种异丙醇生产方法， 包括使用 1 9 中任一项所述的生产异丙醇的大 肠杆菌由来自含有蔗糖的植物的原料生产异丙醇。 附图说明 0026 图1为表示以葡萄糖及果糖作为糖源， 培养大肠杆菌B株10小时时的培养上清 液中的糖的减少量的图。 具体实施方式 0027 本发明的生产异丙醇的大肠杆菌为至少含有属于蔗糖非 PTS 基因组的蔗糖水解 酶基因、 同

17、时赋予或强化了异丙醇生产系统的生产异丙醇的大肠杆菌。 0028 本发明的异丙醇生产方法， 包括使用上述生产异丙醇的大肠杆菌， 由来自含有蔗 糖的植物的原料生产异丙醇。 0029 本发明的生产异丙醇的大肠杆菌为了同化蔗糖， 至少含有构成蔗糖非 PTS 基因组 的蔗糖水解酶基因， 同时具有异丙醇生产系统， 因此， 在不能同化蔗糖的大肠杆菌中， 同时 发挥同化蔗糖的能力和生产异丙醇的能力， 能够由蔗糖有效地生产异丙醇。目前为止完全 没有报道在不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌中导入蔗糖非 PTS 基因组， 以蔗糖作为碳源生 产异丙醇的例子。 0030 本发明发现通过至少将属于构成非 PTS 基因组的基因组

18、的蔗糖水解酶基因导入 生产异丙醇的大肠杆菌中， 即使高效生产异丙醇的大肠杆菌， 也高效率地同化蔗糖。结果， 能够显著减小为了赋予同化蔗糖的能力而导入的 DNA 大小， 能够在 1 个质粒载体上同时连 接赋予同化蔗糖能力的DNA和赋予异丙醇生产能力的DNA。 由此， 能够对不能同化蔗糖的大 肠杆菌同时赋予同化蔗糖的能力和生产异丙醇的能力， 能够从来自甘蔗或甜菜的、 廉价且 能大量供给的蔗糖有效地得到异丙醇。 0031 特别是， 本发明的生产异丙醇的大肠杆菌几乎同时同化蔗糖的分解产物即葡萄糖 和果糖， 能够生产异丙醇， 因此更有效。 0032 一般认为在大肠杆菌中， 通常葡萄糖的摄取优先于果糖，

19、在葡萄糖存在下不能充 分地代谢果糖。因此， 令人惊奇的是本发明能够不受由葡萄糖引起的代谢抑制 ( 分解代谢 产物阻遏 (catabolite repression) 的影响， 有效地进行异丙醇的生产。 0033 需要说明的是， 在本发明中， 所谓 “宿主” ， 是指接收一个以上的基因从菌体外的导 入， 结果变为本发明的生产异丙醇的大肠杆菌的所述大肠杆菌。 0034 在本说明书中， 术语 “步骤” 不仅是独立的步骤， 即使在不能与其它步骤明确区别 时， 如果能实现本步骤所期望的作用， 也包含在本术语中。 0035 另外， 本说明书中， 使用 “” 表示的数值范围， 表示以 “” 前后记载的数值分

20、别 作为最小值及最大值所包含的范围。 0036 以下， 说明本发明。 0037 所谓本发明的蔗糖非 PTS 基因组， 是指微生物的同化蔗糖途径中与非 PTS 系相关 的 4 个基因组。详细而言， 为由阻抑蛋白 (cscR)、 蔗糖水解酶 (cscA)、 果糖激酶 (cscK)、 蔗 糖透过酶 (cscB) 构成的基因组。本发明中， 其中只要至少含有 cscA 的 1 种以上即可， 例如 可以举出只有 cscA、 cscA 及 cscK 的组合、 cscA 及 cscB 的组合、 cscA 及 cscR 的组合、 cscA、 说 明 书 CN 102498203 A 5 4/17 页 6 csc

21、R 及 cscK 的组合、 cscA、 cscR 及 cscB 的组合等。其中， 从更有效地生产异丙醇的观点考 虑， 优选只具有编码 cscA 的基因， 不含有其它基因。 0038 本发明中的蔗糖水解酶 ( 转化酶， CscA) 是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.) 酶 委员会报告被归属于酶编号 3.2.1.26、 催化由蔗糖生成 D- 葡萄糖和 D- 果糖的反应的酶的 总称。 0039 上述酶为K12株及B株等大肠杆菌中本来不具有的酶， 为包括质子共转运体、 转化 酶、 果糖激酶及蔗糖特异性阻抑蛋白的非PTS代谢途径的酶的1种(参见Canadian Journal of Microbi

22、ology， (1991)vol.45， pp418-422)。本发明中， 通过赋予上述 CscA， 特别是通过 仅赋予 cscA， 菌体外的蔗糖可以在细胞膜上分解为葡萄糖及果糖并被释放到细胞外， 通过 葡萄糖 PTS 及果糖 PTS 被磷酸化并被引入细胞质内。结果， 果糖被供给至细菌内的果糖代 谢系统， 并能够利用糖酵解系统被同化。 0040 作为本发明的被导入宿主细菌中的蔗糖水解酶 ( 转化酶， CscA) 的基因， 可以利 用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖水解酶 ( 转化酶， CscA) 的基因的碱基序列的 DNA、 或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成 DNA 序列。作为优选的例

23、子， 可以举出 来自欧文菌属菌 (Erwinia)、 变形杆菌属菌 (Proteus)、 弧菌属菌 (Vibrio)、 农杆菌属菌 (Agrobacterium)、 根瘤菌属菌 (Rhizobium)、 葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、 双歧杆菌 属菌 (Bifidobacterium)、 埃希氏菌属菌 (Escherichia) 的基因， 例如可以举出具有来自大 肠杆菌 O157 株的基因的碱基序列的 DNA。特别优选具有来自大肠杆菌 O157 株的基因的碱 基序列的 DNA。另外， 优选在 cscA 中添加用于使 cscA 移到菌体的外周胞质的信号序列。 0041 作为本发

24、明的被导入宿主细菌中的阻抑蛋白 (CscR) 的基因， 可以利用由具有该 酶的生物得到的具有编码阻抑蛋白 (CscR) 的基因的碱基序列的 DNA、 或基于该基因的公知 的碱基序列合成的合成 DNA 序列。作为优选例子， 可以举出来自欧文菌属菌 (Erwinia)、 变形杆菌属菌 (Proteus)、 弧菌属菌 (Vibrio)、 农杆菌属菌 (Agrobacterium)、 根瘤菌属菌 (Rhizobium)、 葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、 双歧杆菌属菌 (Bifidobacterium)、 埃希 氏菌属菌(Escherichia)的基因， 例如可以举出具有来自大肠杆菌O

25、157株的基因的碱基序 列的 DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌 O157 株的基因的碱基序列的 DNA。 0042 作为本发明的被导入宿主细菌中的果糖激酶 (CscK) 的基因， 可以利用由具有该 酶的生物得到的具有编码果糖激酶 (CscK) 的基因的碱基序列的 DNA、 或基于该基因的公知 的碱基序列合成的合成 DNA 序列。作为优选例子， 可以举出来自欧文菌属菌 (Erwinia)、 变形杆菌属菌 (Proteus)、 弧菌属菌 (Vibrio)、 农杆菌属菌 (Agrobacterium)、 根瘤菌属菌 (Rhizobium)、 葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、 双歧杆

26、菌属菌 (Bifidobacterium)、 埃希 氏菌属菌(Escherichia)的基因， 例如可以举出具有来自大肠杆菌O157株的基因的碱基序 列的 DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌 O157 株的基因的碱基序列的 DNA。 0043 作为本发明的被导入宿主细菌中的蔗糖透过酶 (CscB) 的基因， 可以利用由 具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖透过酶 (CscB) 的基因的碱基序列的 DNA、 或基 于该基因的公知的碱基序列合成的合成 DNA 序列。作为优选的例子， 例如可以举出来 自欧文菌属菌 (Erwinia)、 变形杆菌属菌 (Proteus)、 弧菌属菌 (Vibrio)、 农

27、杆菌属菌 (Agrobacterium)、 根瘤菌属菌 (Rhizobium)、 葡萄球菌属菌 (Staphylococcus)、 双歧杆菌 属菌 (Bifidobacterium)、 埃希氏菌属菌 (Escherichia) 的基因， 例如可以举出具有来自大 说 明 书 CN 102498203 A 6 5/17 页 7 肠杆菌 O157 株的基因的碱基序列的 DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌 O157 株的基因的 碱基序列的 DNA。 0044 本发明中所说的生产异丙醇的大肠杆菌， 是指通过基因重组导入或修饰后的具有 异丙醇生产能力的大肠杆菌。利用该大肠杆菌， 使其与上述 CscA 活性

28、组合， 即使本来不具 有同化蔗糖能力的大肠杆菌， 也可以有效地由蔗糖生产异丙醇。 0045 需要说明的是， 本发明的 “通过基因重组” 的语句， 包括全部通过在原有基因的碱 基序列中插入其它 DNA、 或基因的某部分的置换、 缺失或它们的组合而发生的碱基序列上的 改变， 例如该基因重组可以是突变产生的。 0046 本发明中， 所谓同化蔗糖， 是指将蔗糖直接低分子化或高分子化， 优选低分子化摄 入机体内的能力， 或代谢转换成其它物质的能力。另外， 本发明中， 所谓同化包括将蔗糖进 一步低分子化的分解。详细而言， 包括将蔗糖分解为 D- 葡萄糖和 D- 果糖。 0047 本发明中的异丙醇生产系统，

29、 只要为在作为对象的大肠杆菌中生产异丙醇的系统 即可， 可以为任意的系统。 0048 本发明中赋予或强化的异丙醇生产系统， 是指通过基因重组导入或修饰后的、 用 于发挥异丙醇生产能力的构造。 所述异丙醇生产系统只要是使作为对象的大肠杆菌中的本 来的异丙醇生产量增加的系统即可， 可以为任意的系统。优选可以举出与异丙醇生产活性 相关的酶活性的灭活、 减少或增强或它们的组合。由此， 与上述 CscA 活性组合， 即使为本来 不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌， 也能够有效地由蔗糖生产异丙醇。 0049 优选可以举出赋予与异丙醇的生产相关的被增强了的酶活性。 更优选可以举出硫 解酶、 CoA 转移酶、 乙酰

30、乙酸脱羧酶、 异丙醇脱氢酶的酶活性的增强。即， 本发明的生产异丙 醇的大肠杆菌优选被赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇脱氢酶活性、 CoA 转移酶活性及硫解 酶活性 4 种酶活性。 0050 本发明中的活性的 “赋予” 除了包括将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌 体内之外， 还包括通过强化宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性或与其它启动 子置换使酶基因强表达。 0051 本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.) 酶委员会报告 被归属于酶编号 4.1.1.4、 催化由乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。 0052 作为所述乙酰乙酸脱羧酶， 例如可以举出来自丙酮丁醇

31、梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、 拜氏梭菌 (Clostridium beijerinckii) 等梭菌属细菌、 多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa) 等芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶。 0053 作为本发明的被导入宿主细菌中的乙酰乙酸脱羧酶的基因， 可以利用从上述各来 源生物得到的具有编码乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的 DNA 或基于该基因的公知的 碱基序列合成的合成 DNA 序列。作为优选基因， 可以举出来自梭菌属细菌或芽孢杆菌属细 菌的 DNA， 例如可以举出具有来自丙酮丁醇梭菌、 多粘芽孢杆菌的基因的碱基序列的 DNA。 特别优选具有来

32、自丙酮丁醇梭菌的基因的碱基序列的 DNA。 0054 本发明中的异丙醇脱氢酶是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.) 酶委员会报告被 归属于酶编号 1.1.1.80、 催化由丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。 0055 作为异丙醇脱氢酶， 可以举出来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭菌 属细菌的异丙醇脱氢酶。 说 明 书 CN 102498203 A 7 6/17 页 8 0056 作为被导入本发明的宿主细菌中的异丙醇脱氢酶的基因， 可以利用从上述各来源 生物得到的具有编码异丙醇脱氢酶的基因的碱基序列的 DNA 或基于该基因的公知的碱基 序列合成的合成 DNA

33、序列。作为优选基因， 可以举出来自梭菌属细菌的 DNA， 例如具有来自 拜氏梭菌的基因的碱基序列的 DNA。 0057 本发明中的 CoA 转移酶是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.) 酶委员会报告被归 属于酶编号 2.8.3.8、 催化由乙酰乙酰基 CoA 生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。 0058 作为所述 CoA 转移酶， 例如可以举出来自下述细菌的 CoA 转移酶， 所述细菌为丙 酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、 拜氏梭菌 (Clostridium beijerinckii) 等 梭菌属细菌、 Roseburia intestinalis 等罗斯

34、氏菌属细菌、 普拉梭菌 (Faecalibacterium prausnitzii) 等 Faecalibacterium 属细菌、 粪球菌 (Coprococcus) 属细菌、 布氏锥虫 (Trypanosoma brucei)等锥虫、 大肠杆菌(Escherichia coli ： 大肠杆菌)等埃希氏菌属细 菌。 0059 作为本发明的被导入宿主细菌中的 CoA 转移酶的基因， 可以利用从上述各来源生 物得到的具有编码CoA转移酶的基因的碱基序列的DNA或基于该基因的公知的碱基序列合 成的合成 DNA 序列。作为优选的基因， 可以为具有来自下述细菌的基因的碱基序列的 DNA， 所述细菌为丙

35、酮丁醇梭菌等梭菌属细菌、 Roseburia intestinalis 等罗斯氏菌属细菌、 普 拉梭菌等 Faecalibacterium 属细菌、 粪球菌属细菌、 布氏锥虫等锥虫、 大肠杆菌等埃希氏 菌属细菌。 作为较优选基因， 可以举出来自梭菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因， 特别优选 为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的 DNA。 0060 本发明中所说的硫解酶是指基于国际生物化学联盟 (I.U.B.) 酶委员会报告被归 属于酶编号 2.3.1.9、 催化由乙酰基 CoA 生成乙酰乙酰基 CoA 的反应的酶的总称。 0061 作为所述硫解酶， 例如可以举出来自下述细菌的硫解酶

36、， 所述细菌为丙酮丁醇梭 菌 (Clostridium acetobutylicum)、 拜氏梭菌 (Clostridium beijerinckii) 等梭菌属细 菌、 大肠杆菌 (Escherichia coli) 等埃希氏菌属细菌、 盐杆菌种 (Halobacterium sp.) 细 菌、 生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)等动胶菌属细菌、 红原鸡(Gallus gallus)等雉科原 鸡属、 根瘤菌属 (Rhizobium sp.) 细菌、 大豆慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum) 等 慢生根瘤菌属细菌、 褐家鼠(Rattus norvegi

37、cus)等鼠科鼠属细菌、 热带假丝酵母(Candida tropicalis) 等假丝酵母菌属细菌、 野猪 (Sus scrofa) 等猪科猪属细菌、 新月柄杆菌 (Caulobacter crescentus) 等柄杆菌属细菌、 山丘链霉菌 (Streptomyces collinus) 等链 霉菌属细菌、 向日葵 (Helianthus annuus) 等菊科向日葵属细菌、 欧洲牛 (Bos taurus) 等 牛科牛属细菌、 粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) 等肠球菌属细菌。 0062 作为本发明的被导入宿主细菌中的硫解酶的基因， 可以利用由上述各来源生物得 到的

38、具有编码硫解酶的基因的碱基序列的 DNA 或基于该基因的公知的碱基序列合成的合 成 DNA 序列。作为优选基因， 可以举出具有来自下述细菌的基因的碱基序列的 DNA， 所述 细菌为丙酮丁醇梭菌、 拜氏梭菌等梭菌属细菌、 大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、 盐杆菌种的细 菌、 生枝动胶菌等动胶菌属细菌、 红原鸡等雉科原鸡属、 根瘤菌种的细菌、 大豆慢生根瘤菌 等慢生根瘤菌属细菌、 褐家鼠等鼠科鼠属细菌、 热带假丝酵母等假丝酵母菌属细菌、 野猪等 猪科猪属细菌、 新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、 山丘链霉菌等链霉菌属细菌、 向日葵等菊科向 日葵属细菌、 欧洲牛等牛科牛属细菌、 粪肠球菌等肠球菌属细菌。作为较优选

39、基因， 可以举 说 明 书 CN 102498203 A 8 7/17 页 9 出来自梭菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因， 特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆 菌的基因的碱基序列的 DNA。 0063 其中， 从酶活性的观点考虑， 优选上述 4 种酶分别为来自下述细菌的酶， 所述细菌 为选自梭菌属细菌、 芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少一种， 其中， 更优选乙酰乙 酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶来自梭菌属细菌的情况， CoA 转移酶活性及硫解酶活性来自埃希 氏菌属细菌， 和所述 4 种酶均来自梭菌属细菌。 0064 其中， 从酶活性的观点考虑， 优选本发明中的 4 种酶分别来自丙酮丁醇梭菌、

40、拜 氏梭菌或大肠杆菌中的任一种 ； 较优选乙酰乙酸脱羧酶为来自丙酮丁醇梭菌的酶， CoA 转 移酶及硫解酶分别为来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的酶， 异丙醇脱氢酶为来自拜氏梭菌的 酶 ； 上述 4 种酶从酶活性的观点考虑， 特别优选乙酰乙酸脱羧酶活性来自丙酮丁醇梭菌， 上 述异丙醇脱氢酶活性来自拜氏梭菌， CoA 转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌。 0065 另外， CoA 转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌时， 从异丙醇生产能力的观点考 虑优选上述编码乙酰乙酸脱羧酶的基因、 编码异丙醇脱氢酶的基因及编码蔗糖水解酶的基 因通过质粒被导入， 上述 CoA 转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌内的

41、基因组基因 获得。 0066 作为本发明中与异丙醇的生产相关的酶活性被增强、 生产异丙醇的大肠杆菌的例 子， 可以举出 WO2009/008377 号中记载的 pIPA/B 株或 pIaaa/B 株。 0067 本发明中的基因的启动子， 只要为能够控制上述任一种基因的表达的启动子即 可， 为平常在微生物内发挥作用的强有力的启动子， 并且为即使在葡萄糖存在下也不易受 到表达抑制的影响的启动子， 具体可以举出甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 ( 以下有时称作 GAPDH) 的启动子和丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。 0068 本发明中的启动子是指与具有Sigma因子的RNA聚合酶连接的、 开始转录的部位。

42、例如来自大肠杆菌的GAPDH启动子在GenBank accession number X02662的碱基序列信息 中， 被记载于碱基编号 397-440 中。 0069 来自大肠杆菌的 CoA 转移酶基因 (atoD 及 atoA) 和硫解酶基因 (atoB) 以 atoD、 atoA、 atoB 的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵子 (Journal of Baceteriology Vol.169pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins 等 )， 因此， 通过改变 atoD 的启动子， 能够同时 控制 CoA 转移酶基因和硫解酶基因的表达。 0070 由此， CoA 转移

43、酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌的基因组基因得到时， 从获 得充分的异丙醇生产能力的观点考虑， 优选通过将担负两种酶基因的表达的启动子与其它 启动子置换等， 强化两种酶基因的表达。作为用于强化 CoA 转移酶活性及硫解酶活性的启 动子， 可以举出上述来自大肠杆菌的 GAPDH 启动子等。 0071 本发明中的所述酶的活性可以从菌体外向菌体内导入， 或者通过强化宿主细菌在 基因组上具有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强表达。 0072 酶活性的导入可以通过例如使用基因重组技术将编码所述 4 种酶的基因从宿 主细菌的菌体外导入菌体内而进行。此时， 被导入的酶基因与宿主细胞同种或不同

44、种均 可。从菌体外向菌体内导入基因时需要的基因组 DNA 的制备、 DNA 的切断及连接、 转化、 PCR(Polymerase Chain Reaction)、 用作引物的寡核苷酸的设计、 合成等的方法， 可以按 照本领域技术人员公知的通常的方法来进行。所述方法记载于 Sambrook， J.， et.al.， 说 明 书 CN 102498203 A 9 8/17 页 10 “Molecular Cloning A Laboratory Manual， Second Edition” ， Cold Spring Harbor Laboratory Press， (1989) 等中。 007

45、3 本发明中的能力的 “赋予” 或 “强化” 除了包括将编码酶的基因从宿主细菌的菌体 外导入菌体内之外， 还包括通过强化宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性或与 其他启动子置换使酶基因强表达。 0074 本发明中赋予了酶的活性的大肠杆菌是指从菌体外向菌体内通过任何方法能够 赋予该酶活性的大肠杆菌。 所述大肠杆菌例如可以使用下述方法制备， 即， 使用与上述同样 的基因重组技术， 将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入菌体内等方法。 0075 本发明中强化了酶的活性的大肠杆菌是指使用任何方法强化了该酶活性的大肠 杆菌。所述大肠杆菌例如可以使用下述方法制备， 即， 使用与上述同样的基因重组技术，

46、 使 用质粒将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入菌体内， 或通过强化宿主大肠杆菌在基因 组上具有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强表达等方法。 0076 在本发明中， 大肠杆菌是指不论本来是否具有从来自植物的原料生产异丙醇的能 力， 能够通过使用任何方法具有从来自植物的原料生产异丙醇的能力的大肠杆菌。 0077 此处， 作为用作上述各基因的导入对象的大肠杆菌， 可以为不具有异丙醇生产能 力的大肠杆菌， 只要能够导入及改变上述各基因， 则可以为任意大肠杆菌。 0078 较优选为预先赋予了异丙醇生产能力的大肠杆菌， 由此， 能够更有效地生产异丙 醇。特别是， 根据本发明， 能够对本来

47、不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌赋予同化蔗糖能力， 有效地从蔗糖生产异丙醇。作为上述本来不具有同化蔗糖能力的大肠杆菌， 可以举出 K12 株、 B 株、 C 株及来自它们的株等。 0079 作为上述生产异丙醇的大肠杆菌， 例如可以举出国际公开 2009/008377 号说明书 中记载的赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、 异丙醇脱氢酶活性、 CoA 转移酶活性、 及硫解酶活性、 且 能够从来自植物的原料生成异丙醇的异丙醇生成细菌等。 0080 本发明的异丙醇生产方法包括使用上述生产异丙醇的大肠杆菌从来自含有蔗糖 的植物的原料生产异丙醇， 即， 包括使上述生产异丙醇的大肠杆菌和来自含有蔗糖的植物 的原料接触进行

48、培养的步骤、 和回收通过接触得到的异丙醇的回收步骤。 0081 上述异丙醇生产方法中使用的来自植物的原料只要为从植物得到的碳源、 且为来 自含有蔗糖的植物的原料即可， 没有特别的限制。在本发明中指根、 茎、 秆、 枝、 叶、 花、 种子 等器官、 含有它们的植物体、 所述植物器官的分解产物， 进而在由植物体、 植物器官或它们 的分解产物得到的碳源中， 能在微生物培养中用作碳源的物质也包含在来自植物的原料 中。 0082 在包含于所述来自植物的原料中的碳源中， 除蔗糖之外， 作为通常物质可以举出 淀粉、 葡萄糖、 果糖、 木糖、 阿拉伯糖等糖类、 或者大量含有所述成分的草木质分解产物、 纤 维素

49、水解物等或它们的组合， 进而来自植物油的甘油或脂肪酸也可以包含在本发明的碳源 中。 0083 作为本发明中的来自植物的原料的例子， 可以优选举出谷物等农作物、 玉米、 米、 小麦、 大豆、 甘蔗、 甜菜、 棉花等或它们的组合， 作为这些原料的使用形态为未加工品、 榨汁、 粉碎物等， 没有特别限定。另外， 可以为仅是上述碳源的形态。 0084 培养步骤中的生产异丙醇的大肠杆菌与来自植物的原料的接触一般通过在含有 说 明 书 CN 102498203 A 10 9/17 页 11 来自植物的原料的培养基中培养生产异丙醇的大肠杆菌而进行。 0085 来自植物的原料与生产异丙醇的大肠杆菌的接触密度根据生产异丙醇的大肠杆 菌的活性而不同， 但通常作为培养基中来自植物的原料的浓度， 以换算为葡萄糖计， 可以使 最初的糖浓度相对于混合物的总质量为 20 质量以下， 从大肠杆菌的耐糖性的观点考虑， 优选可以使最初的糖浓度为 15 质量以下。其他各成分只要以在微生物的培养基中通常 添加的量进行添加即可， 没有特别限定。 0086 另外， 作为培养基中的生产异丙醇的大肠杆菌的含量， 根据大肠杆菌的种类及活 性而不同， 通常可以使培养开始时投入的预培养的菌液的量相对于培养液为 0.1 质量 30 质量， 从控制培养条件的观点考虑， 优选可以为 1 质量 10 质量