技术领域
本发明涉及重组细胞筛选技术领域，具体来说，涉及一种重组细胞筛 选系统及其构建方法。
背景技术
基于报告基因的筛选系统是分子生物学研究中的重要工具，在基因表 达、蛋白质互作及药物筛选等研究中发挥着重要的作用。目前已经应用的 筛选系统主要基于如下蛋白或酶的编码基因：β-半乳糖苷酶(β -Lactamase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase),荧光素酶(luciferase) 和各种荧光蛋白(fluorescentprotein)等。
但是这些筛选系统存在一定的不足之处，它们或需要额外添加前体底 物，或需要特别的硬件检测设备。比如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶,荧 光素酶分别需要提供X-gal，X-gluc和luciferin作为信号产生的底物，实际 操作过程中往往由于底物添加不均匀或者底物不能正常进入细胞内部从而 极大地影响了筛选效果，另外这些前体底物的价格一般较高。基于荧光素 酶的筛选系统需要光子检测设备，基于荧光蛋白的筛选系统需要特定波长 的激发光源产生设备。总之，前体底物和硬件设备的需求不但增加了筛选 系统的复杂性和筛选的假阳性，而且增加了筛选的经济成本。
发明内容
本发明提供了一种重组细胞筛选系统及其制备方法，使用该系统时无 需添加前体底物，避免了底物添加不均匀或不能正常进入细胞内部产生的 问题，该系统产生的蓝色色素在可见光下用肉眼观察就可获得直观的结果， 使用方便且降低了筛选成本。
本发明的一个方面，提供一种重组细胞筛选系统，包括：可组成型表 达非核糖体肽合成酶编码基因的受体细胞和含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 编码基因的质粒。
以上所述的重组细胞筛选系统中，所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码 基因的第五个密码子之后插入了多克隆位点。
以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的 序列如SEQIDNO：1所示。
以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的 启动子序列如SEQIDNO：2所示。
以上所述的重组细胞筛选系统中，所述非核糖体肽合成酶编码基因的 核糖体结合位点序列如SEQIDNO：3所示。
以上所述的重组细胞筛选系统中，所述受体细胞为原核细胞、真菌细 胞或哺乳动物细胞；具体地，所述受体细胞为大肠杆菌；更具体地，所述 大肠杆菌为E.coliJM109。
本发明的另一个方面，提供一种以上所述的重组细胞筛选系统的构建 方法，包括如下步骤：
(1)将含有非核糖体肽合成酶编码基因及其启动子和其核糖体结合位 点的DNA序列整合到受体细胞基因组中；
(2)构建含有磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因的质粒。
以上所述的构建方法，所述非核糖体肽合成酶编码基因的序列如SEQ IDNO：1所示，所述非核糖体肽合成酶编码基因的启动子序列如SEQID NO：2所示，所述非核糖体肽合成酶编码基因的核糖体结合位点序列如SEQ IDNO：3所示。
以上所述的构建方法，所述受体细胞为原核细胞、真菌细胞或哺乳动 物细胞；具体地，所述受体细胞为大肠杆菌；更具体地，所述大肠杆菌为 E.coliJM109。
以上所述的构建方法，其中步骤(2)中所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 编码基因替代质粒pUC19中的lacZα基因，并将所述磷酸泛酰巯基乙胺转 移酶编码基因的第五个密码子之后插入了多克隆位点；具体地，所述多克 隆位点来自pUC19；更具体地，所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因来 源于枯草芽孢杆菌。
以上所述的构建方法，所述含有非核糖体肽合成酶编码基因及其启动 子和其核糖体结合位点的DNA序列通过大肠杆菌整合型质粒pOSIP-KO为 载体整合到E.coliJM109的基因组上，再去除pOSIP-KO来源的整合元件 和抗性基因元件仅保留非核糖体肽合成酶表达元件。
本发明系统的构建是基于链霉菌来源的非核糖体肽合成酶编码基因 idgS和芽孢杆菌来源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因sfp。活性的IdgS (Holo-idgS)能够催化L-谷氨酰胺(L-Gln)生成蓝色化合物-蓝靛素 (indigoidine)，而idgS的直接表达产物(Apo-IdgS)没有活性，需经翻译 后修饰过程(该过程由磷酸泛酰巯基乙胺转移酶催化)才能变成活性形式， Sfp蛋白能够完成IdgS的活化。L-谷氨酰胺(L-Gln)存在于所有细胞内， 无需外源添加，因此只要活性的IdgS纯在于细胞内，该细胞就会以内源L- 谷氨酰胺为底物合成蓝色化合物-蓝靛素(indigoidine)，因而呈现出肉眼可 见的蓝色。
另外本发明在sfp基因的第五个密码子后同框插入多克隆位点区，并不 影响sfp的功能，并且带有多克隆位点区的sfp为该系统的使用提供了便利。
与传统的筛选系统相比，本发明的系统无需添加外源底物，也无需特 殊的检测设备，能够快速、简便、经济、高效地完成筛选过程。本发明在 实施例中也具体阐述了该系统的应用实例-基因片段的克隆筛选，证明了本 发明的系统可有效用于重组细胞的筛选。
附图说明
图1为本发明的重组细胞筛选系统构建原理示意图。
图2为本发明实施例提供的工程菌株idgS01和idgS02构建过程示意 图。
图3为本发明实施例提供的E.coliidgs01的验证结果电泳图；其中， 泳道(1、2、3)和泳道(4、5、6)分别对应三个随机挑选的转化子。
图4质粒pSFPHE及多克隆位点示意图。
图5含有质粒pSFPHE的菌株E.coliidgS02呈现蓝色表型。
图6为本发明实施例中GFP基因克隆筛选在可见光下的蓝白斑表型。
图7为本发明实施例中GFP基因克隆筛选在紫外灯下的表型，结果显 示白色菌落与GFP基因的成功插入存在良好的对应关系。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说 明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以 下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。 本发明仅以大肠杆菌为例，但是该系统在真菌细胞及哺乳动物细胞中也有 极大的应用潜力。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径 得到。
实施例1、idgS密码子的优化与全基因合成
idgS基因(具体序列见SEQIDNO：6)是本实验室从Streptomyces lavendulaeCGMCCNo.4.1386克隆到的一个非核糖体肽合成酶编码基因。 为了使该基因能够在大肠杆菌中得到更好的表达，根据大肠杆菌的密码子 使用偏好，重新设计了idgS基因序列(命名为idgSEc，具体序列见SEQID NO：1)。同时在idgS-E.coli上游，一并设计了一个强启动子(T5promoter， 具体序列见SEQIDNO：2)和一个强核糖体结合位点(RBSS，具体序列见 SEQIDNO：3)。包含有强启动子和强核糖体结合位点的idgSEc命名为 T5p-Rs-idgSEc，并委托由DNA合成公司(北京擎科新业生物技术有限公司) 进行全基因合成，全序列见SEQIDNO：4。
实施例2、构建工程菌株E.coliidgS01
如图2所示，利用大肠杆菌整合型质粒pOSIP-KO作为载体(St-Pierre, F.,Cui,L.,Priest,D.G.,Endy,D.,Dodd,I.B.,andShearwin,K.E.(2013) One-stepcloningandchromosomalintegrationofDNA.ACSsyntheticbiology 2,537-541.)，将实施例1中合成的DNA片段(T5p-Rs-idgS-Ec)整合到E.coli JM109的基因组上，构建了大肠杆菌工程菌株E.coliidgS01。
E.coliidgS01的详细构建过程如下：
2.1合成引物T5F-SpeI：5’-CGACTAGTAAGAATCATAAAAAATTTAT TTGCT-3’和引物idgsmR-bamHI：5’-GGGGATCCTTATTCACCCAG-3’。
2.2以合成的DNA片段(T5p-Rs-idgS-Ec)为模板，采用T5F-SpeI， idgsmR-bamHI引物进行PCR扩增，50μl扩增体系中含有如下组分：5X PhusionHFbuffer10μl，2.5mMdNTPs4μl，引物1(10μMT5F-SpeI)2μl， 引物2(10μMidgsmR-bamHI)2μl，模板(100ng/μlT5p-Rs-idgS-Ec)1μl， PhusionDNApolymerase(2U/ul)0.5μl，去离子水30.5μl。PCR扩增条件如 下：98℃30秒；98℃10秒，57℃10秒，72℃1分20秒，共30个循 环；72℃5分钟。
2.3PCR扩增产物进行纯化后，采用限制性内切酶SpeI(购自TakaraBio Company)、BamHI(购自TakaraBioCompany)进行双酶切，50μl酶切体 系包含如下组分：10XKbuffer5μl，PCR扩增产物(500ng/μl)5μl，SpeI (10U/μl)1μl，BamHI(10U/μl)1μl，去离子水:38μl。酶切条件为：37℃， 3小时。
2.4相似地，质粒载体pOSIP-KO采用SpeI、BamHI进行双酶切处理， 酶切条件同上。
2.5将上述酶切产物纯化后进行连接反应。20μl连接反应体系如下：10X T4DNA连接酶buffer2μl，T5p-Rs-idgS-Ec酶切产物(500ng/μl)4μl， pOSIP-KO酶切产物(500ng/μl)4μl，T4DNA连接酶2μl，去离子水：8 μl。连接反应条件为16℃，2小时。
2.6将连接产物转化E.coliJM109(购自TakaraBioCompany)感受态 细胞,转化产物在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上进行筛选 (SambrookJ.etal.Molecularcloning,Laboratorymanuals.2001)。获得的转化 子被命名为E.coliidgs01。
2.7E.coliidgs01的验证。质粒载体pOSIP-KO在大肠杆菌中有一个 主要整合位点(attB1)和一个次要整合位点(attB2)，为了确定在工程菌株E. coliidgs01中载体pOSIP-KO的整合位点，合成了如下引物：
P1：5’-CTCATTCGAAACCACCCACCG-3’，
P2：5’-ACTTAACGGCTGACATGG-3’，
P3：5’-ACGAGTATCGAGATGGCA-3’，
P4：5’-GATCATCATGTTTATTGCGTGG-3’，
SP1：5’-TCCGGAATGCCTGCATTG-3’，
SP4：5’-CCCTGGAGCCAAAATATCC-3’。
其中P1，P4对应基因组上attB1位点两侧的序列，SP1和SP4对应 attB2位点两侧序列。P2和P3对应载体pOSIP-KO上的序列(图2)。以随 机挑选三个工程菌株(E.coliidgs01)作为模板，采用两组混合引物 (P1,P2,P3,P4)和(SP1,P2,P3,SP4)分别进行PCR扩增。PCR扩增体系 (50μl)如下：10XTaqbuffer5μl,2.5mMdNTPs4μl,引物(10μM)(1，2， 3，4)每种引物2μl,模板(E.coliidgs01)1μl,TaqDNA聚合酶(2U/ul)1 μl,去离子水31.0μl。PCR反应条件为：96℃30秒；96℃10秒，50℃15 秒，72℃30秒，共30个循环；72℃5分钟。PCR产物扩增产物经琼脂 糖凝胶电泳。结果如图3所示，引物组合(P1,P2,P3,P4)扩增出两条预测 大小的条带(图3，泳道1、2、3)，引物组合(SP1,P2,P3,SP4)扩增出一 条预测大小的条带(图3，泳道4、5、6)。表明在工程菌株E.coliidgs01 中，载体pOSIP-KO整合于attB1。
实施例3、工程菌株E.coliidgS02的构建
工程菌株E.coliidgs01中单拷贝整合有两个遗传元件，一个是 pOSIP-KO载体，另一个是idgS-Ec表达元件。在pOSIP-KO载体的主体部分 两侧包含FLP重组酶识别位点FRT，因此可以通过诱导表达FLP重组酶将 载体pOSIP-KO的主体部分进行消除，获得没有抗生物抗性选择性标记并 且只含有idgS-Ec表达元件的菌株，我们命名为E.coliidgS02(如图2所示)。 具体构建过程如下：
将FLP重组酶表达质粒pCP20(Datsenko,K.A.,andWanner,B.L.(2000) One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12using PCRproducts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnited StatesofAmerica97,6640-6645.)转化进入E.coliidgs01感受态细胞中，转 化子在30℃进行培养，并在含有100μg/ml的LB培养基上进行筛选，获得 的转化子命名为：E.coliidgs01/pCP20。接种E.coliidgs01/pCP20于没有抗 性的LB培养基中，37℃培养6小时，梯度稀释并涂布于没有抗性的LB平 板。37℃培养过夜，获得的单克隆经抗性检验，卡那霉素抗性和氨苄青霉 素抗性同时消失的菌株被命名为E.coliidgs02。进一步的通过测序验证，菌 株E.coliidgs02只含有idgS-Ec表达元件，pOSIP-KO载体来源的整合元件 和抗性基因元件都得到成功消除。
实施例4、质粒pSFPHE的构建
将枯草芽孢杆菌来源的sfp基因(具体序列见SEQIDNO：5)替代质 粒pUC19中的lacZα基因，获得质粒pSFP。进一步地，将来自于pUC19 的多克隆位点区(MCS)同框插入pSFP中sfp基因的第五个密码子之后， 获得质粒pSFP-HE。具体来说，构建过程如下：
4.1pSFP的构建，采用一步克隆试剂盒(ClonExpressIIOneStepCl oningKitC112，VazymeBiotechCo.,Ltd.)完成。首先以质粒pCIMt002 (Li,P.,etal.(2015)Anefficientblue-whitescreeningbasedgeneinactiva tionsystemforStreptomyces.Appliedmicrobiologyandbiotechnology99, 1923-1933.购自南京诺唯赞生物科技有限公司)为模板，采用引物sfpF-p uc18r(5’-CCGGCTCGTATGTTGTGTGGACTCTGTCAGATCTCACTCTGC -3’)和sfpR-puc18f(5’-GTGTCGGGGCTGGCTTAACTATAAAAGCTCT TCGTACGAGACCA-3’)进行PCR扩增，获得包含sfp基因的DNA片段。 PCR体系组成为：5XPhusionHFbuffer10μl，2.5mMdNTPs4μl，引 物sfpF-puc18r(10μM)2μl，引物sfpR-puc18f(10μM)2μl，模板(1 00ng/μlpCIMt002)1μl，PhusionDNA聚合酶(2U/ul)0.5μl，去离子水3 0.5μl。PCR反应程序为98℃30秒；98℃10秒，63℃10秒，72℃20秒， 共30个循环；72℃5分钟。然后，以pUC19(购自ThermoFisherScie ntificInc.)为模板，采用引物puc18F-sfp(5’-TGGTCTCGTACGAAGAGC TTTTATAGTTAAGCCAGCCCCGACAC-3’)和引物puc18R-sfp(5’-GCAGA GTGAGATCTGACAGAGTCCACACAACATACGAGCCGG-3’)进行PCR 扩增，获得大小约2.7kb的DNA片段。PCR体系组成为：5XPhusionHF buffer10μl，2.5mMdNTPs4μl，引物puc18F-sfp(10μM)2μl，引 物puc18R-sfp(10μM)2μl，模板(100ng/μlpCIMt002)1μl，Phusion DNA聚合酶(2U/ul):0.5μl，去离子水30.5μl。PCR反应程序为：98℃30 秒；98℃10秒，67℃10秒，72℃1分钟，共30个循环；72℃5分钟。 上述两个扩增产物末端包含有同源序列，因此采用一步克隆试剂盒(ClonE xpressIIOneStepCloningKitC112，购自VazymeBiotechCo.,Ltd.)获 得质粒pSFP。
4.2pSFPHE的构建
以pSFP为模板，pucsfpF-EcorI(5’-CTCGAATTCCTGTAAATCTTC ATGTGCGTCCTC-3’)和pucsfpR-HindIII(5’-TGCAAGCTTGATTTATATG GACCGCCCGCTTTC-3’)为引物，采用PhusionDNA聚合酶进行PCR扩 增。扩增条件为：98℃30秒；98℃10秒，69℃10秒，72℃1分05秒， 共30个循环；72℃5分钟。获得约3.1kb大小的PCR产物PSFP。合成 两个DNA单链MCSF(5’-AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGG ATCCCCGGGTACCGAGCTCG-3’)和MCSR(5’-AATTCGAGCTCGGTACC CGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA-3’)经复性后获得包含 多克隆位点区的DNA片段MCS。MCS末端分别含有与EcoRI和HindIII 互补配对的粘性末端。因此PSFP片段经EcoRI和HindIII双酶切后能够与 MCS相连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞获得质粒pSFPHE(如 图4)。
实施例5、pSFPHE和E.coliidgS02组成有效的蓝白斑筛选系统
通过质粒pSFPHE转化E.coliidgS02感受态细胞，并涂布到含有氨苄 青霉素(100μg/ml)的LB培养基上，30℃培养18小时，转化子呈现蓝色 表型。这一结果表明在sfp第5个密码子后同框插入多克隆位点区，仍能表 达出功能性的sfp蛋白。质粒pSFPHE和菌株E.coliidgS02组成了有效的蓝 白斑筛选系统(图5)。
该系统用于DNA片段克隆的实例：
以sfGFP基因(PédelacqJD1,etal.(2006)Engineeringandcharacter izationofasuperfoldergreenfluorescentprotein.NatBiotechnol.Jan；24 (1):79-88.)为模板，GFPF-EcoRI(5’-CAGGAATTCAAGAGGAGAAATA CTAGATGCG-3’)和GFPR-HindIII(5’-ATCAAGCTTTCATCATTTGTAC AGTTCATCC-3’)为引物，采用PhusionDNA聚合酶进行PCR扩增。扩增 条件为：98℃30秒；98℃10秒，61℃10秒，72℃20秒，共30个循 环；72℃5分钟。PCR扩增产物经EcoRI和HindIII双酶切后，在T4连 接酶作用下，与经过同样酶切处理的pSFPHE相连接。连接产物转化E.col iidgS02感受态细胞，转化子在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基 上进行筛选，经30℃培养18小时，结果如图6所示，该系统呈现出了良较 好的蓝白表型，几乎所有的白斑在紫外激发下都呈现出绿色荧光(图7)， 表明GFP基因的正确插入，经统计阳性率大于96％。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作 的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也 无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变 动仍处于本发明的保护范围之中。