技术领域
本发明涉及生物技术领域中基于miR1511的大豆分子标记iSIndel及其应用。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长度为19-24nt的非编码RNA，miRNA在转录后水平通过 与mRNAs的序列互补识别靶基因，并引起靶基因的降解或抑制其翻译，最终达到抑制 特定基因表达的目的(Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions.Cell,2009,136(2):215–233.)。近年来大量研究表明，miRNA参与调 控生长发育、应答生物及非生物胁迫和物种进化等许多重要生物学过程(Bushati N, Cohen S M.MicroRNA functions.Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2007,23:175-205.)。因此miRNA研究对于提高植物的产量和品质有重要的意义。
近年，Yijie Gui等(Gui Y et al.,iSNAP:a small RNA-based molecular marker technique.Plant Breeding,2011,130(5):515-520.)以烟草和水稻为材料开发了 一种基于小RNA序列的分子标记iSNAP，为分子标记辅助育种提供了一种新手段。Pang Mingxiong等(Pang M et al.,Comparative expression of miRNA genes and miRNA-based AFLP marker analysis in cultivated tetraploid cottons.Journal of Plant Physiology,2011,168:824-830.)以棉花为材料开发了一种基于miRNA的 AFLP分子标记。Xuemei Chen等(Chen X et al.,Linkage mapping and expression analysis of miRNAs and their target genes during fiber development in cotton. BMC Genomics,2013,14:706.)以棉花为材料开发了基于miRNA的SRAP标记 (Sequence-Related Amplified Polymorphism)。miRNA这类内源单链非编码小分子 RNA，在真核生物体中广泛存在(Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis, mechanisms,and function.Cell,2004,116:281-297.)。申请人通过5‘RACE-PCR 技术验证了miR1511的靶基因为Gmrpl4a，Gmrpl4a属于60S核糖体蛋白L4家族 (RPL4)，核糖体蛋白是核糖体亚基的关键成分,它们最为熟知的功能是组装核糖体和 蛋白质合成。大量研究表明,在动植物中一些核糖体蛋白还有多种与核糖体无关的生 物学功能，如细胞的生长、分化、发育、凋亡和逆境调节等方面(Luo et al.,MiR1511 co-regulates with miR1511*to cleave the GmRPL4a gene in soybean.Chinese Science Bulletin,2012(57)3804-3810)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定一年生野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)原生境，及如何鉴别栽培大豆(Glycine max(L.)Merr.)和一年生野生大豆。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了大豆分子标记或其多态性在鉴定或辅助 鉴定野生大豆原生境中的应用。
本发明所提供的大豆分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定野生大豆原生境中的 应用中，所述大豆分子标记(名称为miR1511 iSIndel)，是基于miR1511的大豆分子 标记，miR1511 iSIndel为以野生大豆的基因组DNA为模板，采用由与SEQ ID No.1 的第190位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No.1的第386位下游特异结合的单 链DNA组成的引物对进行扩增得到的DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由555个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第243-263位为miR1511 的对应序列(即成熟miR1511的序列)。
上述应用中，所述miR1511 iSIndel的多态性可为所述miR1511 iSIndel对应于 SEQ ID No.1的第190-386位为下述A1)、A2)或A3)：
A1)SEQ ID No.1的第190-386位；
A2)SEQ ID No.2的第190-314位；
A3)SEQ ID No.3的第190-239位。
其中，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA序列均不含miR1511的对应序列 (即成熟miR1511的序列)。
上述应用中，所述miR1511 iSIndel的多态性可为所述miR1511 iSIndel对应于 SEQ ID No.1为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3。
上述应用中，所述应用可包括如下B1)或B2)：
B1)以待测野生大豆的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行扩增，得到扩增 产物，根据所述扩增产物的序列按照下述方法鉴别所述待测野生大豆的原生境：所述 扩增产物的序列含有所述A1)，所述待测野生大豆的原生境为或候选为中国或其周边 邻国(东经97.29°-132.3°、北纬23.57°-51.43°)；所述扩增产物的序列含有所 述A2)，所述待测野生大豆的原生境为或候选为湖南省或湖北省(东经109.26° -111.50°、北纬29.28°-31.52°)；所述扩增产物的序列含有所述A3)，所述待测野 生大豆的原生境为或候选为黄河中下游区域(东经104.41°-122.24°、北纬30.12° -40.50°)或辽宁省(东经119.47°-122.43°、北纬38.54°-42.03°)；
B2)检测野生大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4，如所述待测野生大豆的总 RNA含有SEQ ID No.4所示的miR1511，所述待测野生大豆的原生境为或候选为全中国 境内及周边国家(东经97.29°-132.3°、北纬23.57°-51.43°)；如所述待测野生 大豆的总RNA不含SEQ ID No.4所示的miR1511，所述待测野生大豆的原生境为或候 选为湖南省或湖北省(东经109.26°-111.50°、北纬29.28°-31.52°)或黄河中下 游区域(东经104.41°-122.24°、北纬30.12°-40.50°)或辽宁省(东经119.47° -122.43°、北纬38.54°-42.03°)。
上述应用中，所述检测野生大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4可用核苷酸序 列为SEQ ID No.5的探针进行。
上述应用中，所述检测野生大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4可利用Northern blot进行。
上述应用中，所述引物对可为由SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA和与 SEQ ID No.1的第532-555位反向互补的单链DNA组成的引物对。
上述应用中，所述扩增可为PCR扩增。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述miR1511 iSIndel。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测所述miR1511 iSIndel的多态性的系 统。
本发明所提供的检测所述miR1511 iSIndel的多态性的系统，含有所述引物对。
上述系统还可包括PCR所需的试剂和仪器。具体来说，所述系统可包括所述引物 对以及PCR所需要的其它试剂和仪器。
PCR所需要的其它试剂可包括DNA聚合酶和/或PCR缓冲液和/或dATP、dTTP、dCTP 和dGTP的dNTP的混合物和/或MgCl2。所述DNA聚合酶具体可为Taq DNA聚合酶。
所述引物对和PCR所需要的其它试剂均可独立包装。所述引物对的两条单链DNA 可独立包装。
上述系统还可仅包括所述引物对。所述引物对的两条单链DNA可独立包装。
在实际应用中，可将检测miR1511 iSIndel多态性的系统与其它系统(如检测其 它的大豆分子标记多态性的系统)联合在一起制备鉴定或辅助鉴定野生大豆原生境的 产品。
其中，检测miR1511 iSIndel多态性的系统可为通过DNA测序、Northern blotting 和/或Southern blotting确定miR1511 iSIndel多态性所需的试剂和/或仪器。利 用DNA测序确定miR1511 iSIndel多态性所需的试剂和/或仪器包括所述PCR引物对、 进行PCR反应所需试剂和仪器、进行DNA测序所需试剂和仪器。利用Southern blotting确定miR1511 iSIndel多态性所需的试剂和/或仪器包括探针以及进行 Southern blotting所需试剂和仪器。所述探针的序列可为与SEQ ID No.1的第243-263 位反向互补的序列，如序列表中SEQ ID No.5。所述探针可由T4多核苷酸激酶标记。
所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由引 物、PCR试剂、DNA测序试剂、PCR仪和/或DNA测序仪组成的系统或试剂盒，由包含 引物、PCR试剂、DNA测序试剂、PCR仪和/或DNA测序仪的系统或试剂盒与DNA测序 所需要的其他试剂组成的系统，由包含引物、PCR试剂、DNA测序试剂、PCR仪和/或 DNA测序仪的系统或试剂盒与提取基因组DNA所需要的试剂组成的系统，由探针、进 行Southern blotting的系统或试剂盒与进行Southern blotting所需其他试剂组 成的系统，由探针、进行Southern blotting的系统或试剂盒与提取RNA所需要的试 剂组成的系统。
本发明的一个实施例中，采用DNA测序确定miR1511 iSIndel的多态性。所述PCR 引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括miR1511 iSIndel在内的基因组DNA 片段即可，扩增出包括miR1511 iSIndel在内的基因组DNA片段的PCR引物对为由SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA和与SEQ ID No.1的第532-555位反向互补的单 链DNA组成的引物对。
进行PCR反应所需仪器可为BIO-RAD的T100梯度PCR仪。进行PCR反应所需试 剂可为PCR缓冲液、dNTP混合物和Taq DNA聚合酶。所述PCR缓冲液、所述dNTP混 合物和所述Taq DNA聚合酶均可为TaKaRa、NEB或TIANGEN等公司产品。所述Taq DNA 聚合酶可为TaKaRa、NEB或TIANGEN等公司的高保真Taq DNA聚合酶，如TaKaRa 的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(R010A)、NEB的High-Fidelity DNA Polymerase(M0530S)或TIANGEN的PfuDNA Polymerase(EP101)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述大豆分子标记或其多态性在鉴定或辅 助鉴定大豆是栽培大豆或是野生大豆中的应用。
上述应用中，所述野生大豆可为野生大豆。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一用途：
X1、所述系统在鉴定或辅助鉴定野生大豆原生境中的应用；
X2、所述系统在制备鉴定或辅助鉴定野生大豆原生境的产品中的应用；
X3、所述系统在鉴定或辅助鉴定大豆是栽培大豆或是野生大豆中的应用；
X4、所述系统在制备鉴定或辅助鉴定是栽培大豆或是野生大豆的产品中的应用。
本发明中，所述野生大豆可为一年生野生大豆。
上述X3或X4的应用可为下述C1)或C2)：
C1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行扩增，得到扩增产物， 根据所述扩增产物的序列按照下述方法鉴别所述待测大豆：所述扩增产物的序列不含 所述miR1511的对应序列(即成熟miR1511的序列，SEQ ID No.1的第243-263位)， 所述待测大豆为或候选为一年生野生大豆；
C2)检测大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4，如所述待测大豆的总RNA不含 SEQ ID No.4所示的miR1511，所述待测大豆为或候选为一年生野生大豆。
上述用途中，C1)所述扩增产物的序列不含所述miR1511的对应序列(即成熟 miR1511的序列，SEQ ID No.1的第243-263位)可为所述扩增产物的序列不含SEQ ID No.1的第190-386位。
上述用途中，C1)所述扩增产物的序列不含所述miR1511的对应序列(即成熟 miR1511的序列，SEQ ID No.1的第243-263位)可为所述扩增产物的序列不含SEQ ID No.1。
上述用途中，所述检测大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4可用核苷酸序列为 SEQ ID No.5的探针进行。
上述用途中，所述检测大豆的总RNA中是否含有SEQ ID No.4可利用Northern blot 进行。
本申请中所述分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征 的DNA片段。
实验证明，在大豆中，miR1511 iSIndel的多态性存在于不同原生境的一年生野 生大豆中，miR1511 iSIndel为SEQ ID No.1的一年生野生大豆的原生境为全中国 及周边邻国(东经97.29°-132.3°、北纬23.57°-51.43°)；miR1511 iSIndel为 SEQ ID No.2的一年生野生大豆的原生境为湖南和湖北地区(东经109.26° -111.50°，北纬29.28°-31.52°)；miR1511 iSIndel为SEQ ID No.3的一年生野 生大豆的原生境为黄河中下游区域(东经104.41°-122.24°，北纬30.12°-40.50°) 和辽宁省境内(东经119.47°-122.43°，北纬38.54°-42.03°)。
实验证明，在大豆中，miR1511 iSIndel的多态性存在于栽培大豆和一年生野生 大豆中，栽培大豆的miR1511 iSIndel仅为SEQ ID No.1，一年生野生大豆的miR1511 iSIndel为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3。
本发明发现基于miR1511的大豆分子标记miR1511 iSIndel在来自于不同原生境 的一年生野生大豆中具有位点的多态性，这些多态性的位点能够用来区分不同原生 境的一年生野生大豆。本发明发现miR1511 iSIndel在栽培大豆与一年生野生大豆 中也具有位点的多态性。本发明的miR1511 iSIndel及其检测miR1511 iSIndel多 态性的系统或产品可用来鉴定一年生野生大豆的原生境，还可用来鉴定或辅助鉴定 一年生野生大豆。本发明的基于miR1511的大豆分子标记miR1511 iSIndel有助于检 测miRNA对大豆生长发育、逆境胁迫和物种进化的调控。
附图说明
图1为栽培大豆和一年生野生大豆PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，a 为部分栽培大豆PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；部分一年生野生大豆PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的序列比对结果。其中，下划 线处的序列为miR1511的对应序列(即成熟miR1511的序列)。
图3为miR1511 iSIndel中miR1511的Northern blotting验证结果。其中， 泳道M为RNA分子量标准，泳道1为ZDD00002，泳道3为ZDD00050，泳道5为 ZYD00036，泳道7为ZYD00190，泳道2为ZYD04402，泳道4为ZYD04371，泳道6 为ZYD03294，泳道8为ZYD03609。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的栽培大豆(Glycine max(L.)Merr.)与一年生野生大豆 (Glycine soja Sieb.et Zucc.)均来自于中国农业科学院国家种质库。
下述实施例中的BIO-RAD(T100)的温度循环仪为美国BIO-RAD公司产品。Taq DNA 聚合酶为TaKaRa公司的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(R010A)。
实施例1、miR1511 iSIndel是与一年生野生大豆原生境相关的大豆分子标记
1.miR1511 iSIndel的发现
1.1提取大豆基因组DNA
分别提取表1中1000个栽培大豆和表2中459个一年生野生大豆的基因组DNA， 具体方法如下：
1)钻取得到种子粉末；
2)向步骤1)的0.2g种子粉末中加入800μl提取缓冲液(该提取缓冲液由溶 质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为50mM Tris、0.1M NaCl、0.1M EDTA 和1％(质量百分比浓度)SDS，pH8.0)和5μl RNase A溶液(RNase A溶液中RNase A的浓度为10mg/ml)，然后依次37℃下孵育15min、65℃下水浴45分钟；
3)加入400μl酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，剧 烈摇荡混匀，室温静置至分层，12000rpm离心10分钟；
4)取上清液(约750μl)，加入等体积异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离 心5分钟；
5)弃上清液，用70％(体积百分比浓度)乙醇水溶液洗涤沉淀两次，尽量去除 乙醇，风干10min，得到大豆基因组DNA，大豆基因组DNA可溶于水中冻存。
1.2PCR扩增反应
PCR扩增反应在BIO-RAD(T100)的温度循环仪上进行，PCR扩增反应的体系均 为：2.0μl的10×PCR缓冲液，1.6μl dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM 的4种dNTP混合物，SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA水溶液0.5μl(10μ M/μl)，与SEQ ID No.1的第532-555位反向互补的单链DNA水溶液0.5μl(10μM/ μl)，0.2μl的5U Taq DNA聚合酶，1μl的大豆基因组DNA水溶液(20ng/μl)， 无菌水补至20μl。
PCR扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃30s、56℃30s、72℃30s， 进行35个循环；72℃延伸8min。
表1、1000个栽培大豆
表2、459个一年生野生大豆
1.3序列分析
将1.2的所有的PCR产物进行2.0％的琼脂糖凝胶中电泳。在紫外灯下观察， 1000个栽培大豆的PCR产物大小无差异(图1中a)，459个一年生野生大豆的PCR 产物有三种大小的条带(图1中b)。
将1.2的所有的PCR产物测序，结果发现，1000个栽培大豆的PCR产物的序 列均为序列表中SEQ ID No.1，459个一年生野生大豆的PCR产物的序列有三种，分 别为序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，每个一年生野生大豆的 PCR产物的序列如表2所示。将这三条序列进行序列比对发现，SEQ ID No.1的第 243-263位为miR1511(SEQ ID No.4)对应的DNA序列(TAACCAGGCTCTGATACCATG， 即成熟miR1511的序列)，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3均不含有miR1511对应的DNA 序列(即成熟miR1511的序列)(图2)。
将由SEQ ID No.1的第1-25位所示的单链DNA和与SEQ ID No.1的第532-555 位反向互补的单链DNA组成的引物对扩增得到的DNA分子命名为大豆分子标记 miR1511 iSIndel。miR1511 iSIndel的多态性为miR1511 iSIndel对应于SEQ ID No.1 的第190-386位的核苷酸序列是下述A1)、A2)或A3)：
A1)SEQ ID No.1的第190-386位的序列；
A2)SEQ ID No.2的第190-314位的序列；
A3)SEQ ID No.3的第190-239位的序列。
表明，miR1511 iSIndel是一种区分一年生野生大豆与栽培大豆的分子标记， 可用来区分一年生野生大豆与栽培大豆。当待测大豆的miR1511 iSIndel为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3时，待测大豆为一年生野生大豆；当待测大豆的miR1511 iSIndel 为SEQ ID No.1时，待测大豆为一年生野生大豆或栽培大豆。
2.miR1511 iSIndel中miR1511的验证
随机选取PCR产物为SEQ ID No.1的两个栽培大豆(种质统一编号为ZDD00002 的黑农1号和种质统一编号为ZDD00050的合交6号)与两个一年生野生大豆(种 质统一编号分别为ZYD00036和ZYD00190)、PCR产物为SEQ ID No.2的两个一年生 野生大豆(种质统一编号分别为ZYD04402和ZYD04371)和PCR产物为SEQ ID No.3 的两个一年生野生大豆(种质统一编号分别为ZYD03294和ZYD03609)，共八个大豆， 用Northern blotting进行miR1511 iSIndel的验证，将U6snRNA作为内参，每 个大豆的Northern blotting验证的具体操作步骤如下：
1)合成T4多核苷酸激酶5′末端标记的miR1511探针，miR1511探针的序列 与miR1511的序列(SEQ ID No.4)反向互补，为SEQ ID No.5；
2)Trizol法分别提取上述八个大豆的总RNA；
3)small RNA富集
取400μL(1-2mg)大豆总RNA，加入50μL PEG8000浓度为50％PEG8000水 溶液和50μL 5mol/L的NaCl水溶液，混匀。冰上放置2h后15000×g下离心10min。 弃沉淀，向上清液中加入是上清液1/10体积的3mol/L的NaAc水溶液(pH5.2)、 2倍体积无水乙醇及1μL 20mg/ml糖原，混匀后于-20℃下放置2h。15000×g下 离心10min，弃上清液。沉淀用体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液洗涤2次，干 燥，溶于50％去离子甲酰胺中备用。
4)Northern杂交
40μg富集后的小分子RNA经8mol/L尿素-15％聚丙稀酰胺变性胶电泳分离， 用半干转膜仪(Trans-Blot SD，BIO-RAD)转移至尼龙膜(Hybond N+，Amersham) 上，然后膜置于紫外交联仪(Ultraviolet Crosslinkers，UVP)中正面-反面-正 面各交联1min，80℃烘烤30min以上，在杂交液(Ambion)中 42℃预杂交2h以上，加入miR1511探针过夜(14-24h)杂交。杂交膜压磷屏(Storage Phosphor Screen，GE Healthcare)后用激光激发分子成像系统(FX Pro Plus， BIO-RAD)进行成像分析(图3)，证实测序结果的正确，除该位点外miR1511无其 余家族成员。泳道1、3、5和7(泳道1、3、5和7对应的大豆的种质统一编号依 次为ZDD00002、ZDD00050、ZYD00036和ZYD00190)中均含有miR1511，泳道2、4、 6和8(泳道2、4、6和8对应的大豆的种质统一编号依次为ZYD04402、ZYD04371、 ZYD03294和ZYD03609)中均不含有miR1511。
3.miR1511 iSIndel与大豆原生境的相关性分析
将表1中1000个栽培大豆和表2中459个一年生野生大豆的原生境与其 miR1511 iSIndel的序列进行相关性分析，结果发现，1000个栽培大豆的遍及全中 国及周边邻国。459个一年生野生大豆中，miR1511 iSIndel为SEQ ID No.1的一年 生野生大豆的原生境为中国或其邻国(东经97.29°-132.3°、北纬23.57°-51.43°) (具体地理位置见表2)区域内；miR1511 iSIndel为SEQ ID No.2的一年生野生大 豆的原生境为湖南省或湖北省(东经109.26°-111.50°、北纬29.28°-31.52°)(具 体地理位置见表2)区域内；miR1511 iSIndel为SEQ ID No.3的一年生野生大豆的 原生境为黄河中下游区域(东经104.41°-122.24°、北纬30.12°-40.50°)或辽 宁省(东经119.47°-122.43°、北纬38.54°-42.03°)(具体地理位置见表2)。表 明，miR1511 iSIndel是与一年生野生大豆原生境相关的大豆分子标记，可用来鉴 定一年生野生大豆的原生境。