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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610112770.4 (22)申请日 2016.02.29 C09K 11/06(2006.01) C07D 491/107(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301 号 (72)发明人 吴向阳 肖慧丰 张海燕 刘杰 张敏 仰榴青 (54) 发明名称 一种检测汞离子的新型罗丹明荧光探针及其 制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种检测汞离子的新型罗丹明荧 光探针及其制备方法， 属于荧光探针及其制备方 法技术领域。本发明公开了罗丹明荧光探。
2、针的结 构。 本发明还公开了罗丹明荧光探针的制备方法， 将罗丹明 B 与水合肼在乙醇中回流反应生成罗丹 明酰肼 ； 然后与苯基乙二醛在乙醇中回流反应， 经重结晶得到席夫碱 ； 再经硼氢化钠还原生成荧 光探针。 本发明提供的荧光探针合成步骤简单、 收 率高， 对汞离子的选择性好、 响应时间快， 可在生 理环境条件下工作， 具有应用于生物荧光成像的 前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图6页 CN 105670609 A 2016.06.15 CN 105670609 A 1.一种检测汞离子的罗丹明B衍生物R的结。
3、构式如下所示： 。 2.根据权利要求1所述的罗丹明B衍生物R的制备方法， 其特征在于制备流程如下： 将罗 丹明B酰肼和苯基乙二醛 （罗丹明B酰肼与苯基乙二醛的摩尔比1:1.2） 溶解在在甲醇或乙醇 中， 加热回流至反应完全， 冷却析出固体， 过滤即得到席夫碱； 将席夫碱溶于四氢呋喃中， 缓 慢加入硼氢化钠 （席夫碱与硼氢化钠的摩尔比1:2） ， 除去溶剂， 重结晶得罗丹明B衍生物R。 3.根据权利要求1所述的罗丹明B衍生物R的应用， 其特征在于： 罗丹明B衍生物R可以作 为荧光探针。 4.根据权利要求3所述的罗丹明B衍生物R作为荧光探针， 其特征在于： 罗丹明B衍生物R 可以作为荧光探针实现汞。
4、离子的检测。 5.根据权利要求4所述的罗丹明B衍生物R作为汞离子荧光探针， 其特征在于： 罗丹明B 衍生物R可以实现活细胞内汞离子的检测。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105670609 A 2 一种检测汞离子的新型罗丹明荧光探针及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测汞离子的罗丹明荧光探针及其制备方法， 属于荧光探针及其 制备方法技术领域。 背景技术 0002 汞离子是一种典型的重金属离子， 具有极强的毒性。 汞离子一旦进入水环境， 就会 被细菌类微生物转化为有机的甲基汞， 并在生物体内(如鱼类)快速积累从而进入食物链。 甲基汞破坏人的神经系统， 引起大脑受损、 认知和运动。
5、紊乱等， 震惊世界的水俣病就是有机 汞中毒的一种类型。 因此， 寻找能够快速、 准确检测汞离子的方法具有重要意义。 0003 罗丹明类荧光染料具有光稳定性好、 长波长红光发射、 量子产率高、 水溶性好和适 用的pH范围较宽等优异的光物理和光化学性能， 已成为构建荧光探针最理想的报告基团之 一。 一些罗丹明类荧光探针及其在汞离子检测方面的应用已被报道， 如CN104530064A和CN 104479671A， 但如本发明所示的罗丹明荧光探针结构未见公开。 本发明提供的罗丹明荧光 探针合成步骤简单、 易于提纯、 收率高， 对汞离子的选择性好， 可在生理环境条件下工作， 具 有应用于生物荧光成像的前。
6、景。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种罗丹明B衍生物及其制备方法和在汞离子检测方面的应 用。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的： 0006 一种罗丹明B衍生物R， 其结构如下所示： 0007 说明书 1/5 页 3 CN 105670609 A 3 0008 0009 本发明合成罗丹明B衍生物R的流程式 0010 罗丹明B衍生物R的制备方法， 按照以下步骤进行： 0011 将罗丹明B酰肼和苯基乙二醛溶解在溶剂中， 罗丹明B酰肼与苯基乙二醛的摩尔比 为1:1.2,加热回流至反应完全， 冷却析出固体， 过滤即得到席夫碱。 将席夫碱溶于四氢呋喃 中， 缓慢加入硼氢化钠， 席夫碱与硼。
7、氢化钠的摩尔比为1:2,减压除去溶剂， 重结晶得罗丹明 B衍生物R。 0012 具体制备步骤包括： 0013 (1)罗丹明B酰肼的制备 0014 将罗丹明B和水合肼溶解在溶剂中， 加热回流至反应完全， 冷却加水析出固体， 过 滤得浅粉色粗产品， 干燥、 重结晶得罗丹明B酰肼。 0015 所述的溶剂为甲醇或乙醇， 重结晶所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯。 0016 (2)席夫碱的制备 0017 将罗丹明B酰肼和苯基乙二醛溶解在溶剂中， 罗丹明B酰肼与苯基乙二醛的摩尔比 为1:1.2,加热回流至反应完全， 冷却析出固体， 过滤即得到席夫碱。 0018 所述的溶剂为甲醇或乙醇。 0019 (3)罗丹明B。
8、衍生物R的制备 0020 将席夫碱溶解于四氢呋喃中， 缓慢加入硼氢化钠， 室温搅拌2h， 反应完全后除去溶 剂， 重结晶得到罗丹明B衍生物R。 0021 所述的席夫碱与硼氢化钠摩尔比为1:2,重结晶所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯。 0022 罗丹明B衍生物R的应用： 所述的罗丹明B衍生物R可作为荧光探针。 所述的罗丹明B 衍生物R可作为荧光探针实现汞离子的检测。 所述的罗丹明B衍生物R可作为荧光探针用于 活细胞内汞离子的检测。 0023 本发明所具有的优点： 本发明提供的罗丹明B衍生物R， 合成步骤简单， 反应时间 短， 易于提纯， 收率高。 该化合物是汞离子的荧光增强型探针， 对汞离子具有高度。
9、专一性， 可 在生理环境条件下工作， 具有应用于生物荧光成像的前景。 说明书 2/5 页 4 CN 105670609 A 4 附图说明 0024 图1为本发明实施例合成罗丹明B衍生物R的流程图。 0025 图2为本发明实施例合成的席夫碱的核磁共振氢谱。 0026 图3为本发明实施例合成的席夫碱的质谱图。 0027 图4为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的核磁共振氢谱。 0028 图5为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的质谱图。 0029 图6为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R的单晶结构图。 0030 图7为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针的最佳醇/水比的测试。 0031 。
10、图8为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针的pH适用范围的测试。 0032 图9为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子选择性的测 试。 0033 图10为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子的荧光滴定 的测试。 0034 图11为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子络合的工作 曲线图。 0035 图12为本发明实施例合成的罗丹明B衍生物R作为荧光探针对汞离子在细胞体内 进行的荧光成像实验。 (a)加入荧光探针R细胞孵育20min后在荧光显微镜下的成像图， (b) 加入汞离子后孵育20min细胞在荧光显微镜下的成像图， (b)图中的。
11、白色部分在彩图中为红 色荧光的细胞。 具体实施方式 0036 下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。 0037 实施例1 0038 荧光探针分子罗丹明B衍生物R的制备， 具体路线图见下式。 0039 说明书 3/5 页 5 CN 105670609 A 5 0040 本发明合成罗丹明B衍生物R的流程式 0041 (1)罗丹明B酰肼的制备 0042 在50mL圆底烧瓶中加入罗丹明B(4.79g， 0.01mol,5mL80水合肼， 30mL乙醇， 混 合溶液搅拌回流4-5h， 冷却后加水析出固体， 过滤得到粗产品， 干燥后用乙酸乙酯/石油醚 重结晶得到浅粉色粉末固体， 即罗丹明B酰肼，。
12、 收率92。 0043 (2)席夫碱的制备 0044 在25mL圆底烧瓶中加入罗丹明B酰肼(2.28g， 0.005mol)， 一水合苯基乙二醛 (1.02g， 0.006mol)， 无水甲醇30mL， 搅拌回流3h后， 过滤、 干燥得席夫碱， 收率95。 其核磁 共振氢谱(1HNMR)图和质谱(ESI-MS)图分别见图2和图3。 1HNMR(400MHz,CDCl3) :8.40(s, 1H),7.89-8.04(m,3H),7.17-7.59(m,5H),6.28-6.54(m,6H),3.35(q,J6.8Hz,8H),1.18 (t,J6.8Hz,12H).ESI-MS(质荷比):C3。
13、6H36N4O3+H+:理论值为573.28， 实测值为573.58. 0045 (3)罗丹明B衍生物R的制备 0046 在25mL圆底烧瓶中加入席夫碱(0.57g， 0.001mol)， 10mL四氢呋喃， 分批缓慢加入 硼氢化钠(0.08g， 0.002mol)， 常温搅拌2h， 旋干溶剂， 水洗， 萃取， 用乙酸乙酯石油醚重结晶 得罗丹明B衍生物R， 收率82。 其1HNMR谱图、 质谱图和单晶结构图分别见图4、 图5和图6。 1H NMR(400MHz,CDCl3) :7.98(d,J6.8Hz1H),7.53-7.56(m,2H),7.11-7.21(m,6H),6.29- 6.66。
14、(m,6H),5.46(s， 1H)， 4.51-4.69(m,2H),3.36(q,J7.2Hz,8H),2.47-2.49(m,2H), 1.18(t,J7.2Hz,12H).ESI-MS(质荷比):C36H40N4O3+H+:理论值为577.31， 实测值为 577.63. 0047 实施例2 0048 罗丹明B衍生物R的不同醇/水比的荧光光谱变化 0049 取实施例1制备的罗丹明B衍生物R溶于乙醇中， 制成100 M储备液。 分别配制不同 比例的乙醇和水比例的10 M荧光探针溶液， 依次加入0.5当量的汞离子， 溶液的荧光强度变 化如图7所示。 从图7可以看出， 溶液的荧光强度随醇/水。
15、比的增大而逐渐增强， 但当醇/水比 大于6： 4的时， 溶液荧光强度的增强趋于平缓。 因此， 醇/水比6： 4为最佳测试条件。 0050 实施例3 0051 罗丹明B衍生物R在不同pH的荧光光谱变化 0052 取实施例2配制的储备液分别配制不同pH的10 M荧光探针溶液， 溶液的荧光强度 变化如图8所示。 从图8可以看出， 在pH6的范围内， 随着酸性的增加， 荧光强度明显增强； 在pH6-9范围内,荧光强度基本处于恒定， 说明该探针可适用于生物环境条件下的测试。 0053 实施例4 0054 罗丹明B衍生物R荧光探针对汞离子的选择性 0055 金属离子溶液的配制： 所有的金属离子溶液都由它们。
16、的硝酸盐配制， 避光保存备 用。 0056 取实施例2配制的储备液配制成10 M的荧光探针缓冲溶液(pH7， 10mM4-羟乙基 哌嗪乙磺酸的水溶液(HEPES)， 分别加入等量的金属离子(Hg2+,Fe3+,Co2+,Mg2+,Zn2+,Al3+, Ni2+,Cr3+,Mn2+,Ca2+,Li+,Cd2+,Cu2+)； 立即以520nm为激发光检测溶液的发射光谱变化， 结果 见图9。 从图9可以看出， 其它金属离子对化合物R的荧光几乎没有影响， 而汞离子溶液的加 入使化合物R的荧光显著增强。 说明书 4/5 页 6 CN 105670609 A 6 0057 实施例5 0058 荧光探针R对。
17、不同浓度汞离子的荧光光谱变化 0059 取实施例2配制的储备液配制成10 M的荧光探针缓冲溶液(pH7， 10mMHEPES)， 加入不同当量(0-5.5eq)的Hg2+标准溶液， 以520nm为激发光测量其荧光性质， 荧光光谱图见 图10。 从图10可以看出， 探针在582nm处荧光强度最大； 荧光探针R溶液的荧光峰值随着Hg2+ 加入当量的增加荧光逐渐增强， 到达最大强度时， 荧光强度增加了约100倍。 图11的工作曲 线显示拐点在0.5， 表明荧光探针R和汞离子为1： 1的配比关系。 0060 实施例6 0061 荧光探针R对细胞内汞离子的荧光成像 0062 我们将本发明的荧光探针R应用。
18、于人体胃癌细胞(MGC-803)中的汞离子进行荧光 成像应用。 具体结果见图12。 具体操作步骤如下： 将20 M探针溶液加入到育有MGC-803细胞 的培养液中在二氧化碳培养箱中培养20min后用荧光显微镜进行成像。 首先用绿光进行激 发观察未加入汞离子的荧光成像情况， 此时观察不到荧光发射。 然后， 向体系中加入20 M汞 离子的水溶液， 培养20min后用绿光进行激发可以观察到明显的红光发射， 图12(b)图中的 白色部分在彩图中为红色荧光的细胞， 说明此荧光探针可以对活细胞内的汞离子进行荧光 成像。 说明书 5/5 页 7 CN 105670609 A 7 图1 图2 说明书附图 1/6 页 8 CN 105670609 A 8 图3 图4 说明书附图 2/6 页 9 CN 105670609 A 9 图5 图6 说明书附图 3/6 页 10 CN 105670609 A 10 图7 图8 说明书附图 4/6 页 11 CN 105670609 A 11 图9 图10 说明书附图 5/6 页 12 CN 105670609 A 12 图11 图12 说明书附图 6/6 页 13 CN 105670609 A 13 。