技术领域
本发明涉及动物分子遗传学领域，具体是涉及一种能预示和鉴定绵羊羊毛 卷曲度的分子标记方法及其引物对。
背景技术
随着人们生活水平的提高，世界羊毛品质出现了划时代的变革，主要表现 在羊毛细度和卷曲度上。我国是世界上消耗羊毛最多的国家，羊毛的自给率仅 为1/3，供求缺口很大，每年需要从国外进口大批低细度、高卷曲度的优质羊 毛，羊毛成为我国唯一依赖进口的大宗畜产品。因此，应用现代分子育种新技 术快速培育高卷曲度绵羊、扩大高卷曲度绵毛羊种质规模势在必行。
中国美利奴羊(新疆军垦型)的培育始于1972年，至今已培育出六个品 系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛 用多胎品系和U品系。卷曲度是一个重要的羊毛品质经济性状，研究证明：羊 毛细度和卷曲度呈负相关，羊毛卷曲度越大，对应的羊毛细度越细，羊毛纤维柔 韧性越好，羊毛制品手感越好，经济价值越大。培育卷曲度高的绵羊，以及快速 扩大种群规模是一个重要问题。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性 别和环境的干扰，实现早期、快速和准确的选择羊毛卷曲度高的优质绵羊，组建 并扩大高卷曲度绵羊种群，因此，寻找羊毛卷曲度相关基因及分子标记对于高卷 曲度绵羊育种工作有重要意义。
SHCSH2-domainbindingprotein1(SHCBP1)是SHC蛋白SH2结构域上的一 个重要连接蛋白。SHCBP1基因主要在增殖能力强的细胞中表达，例如干细 胞，癌细胞等。研究表明SHCBP1参与细胞周期，在G2/M期，表达最高。 SHCBP1基因在畜禽中的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法及 其引物对，用于寻找羊毛卷曲度相关基因及分子标记方法，培育羊毛卷曲度高的 优质绵羊，实现早期、快速和准确的选择高卷曲度绵羊，组建并扩大高卷曲度 绵羊种群。
本发明的目的通过如下方法实现：一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子 标记方法所用引物对，上引物SHCBP1-P1-F：如序列表SeqNo.1所示；下引物 SHCBP1-P1-R：如序列表SeqNo.2所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，包括如下步骤：
(1)根据绵羊SHCBP1-P1-基因第14外显子区G14408374T位点设计 一对引物SHCBP1-P1-F和SHCBP1-P1-R，然后对绵羊基因组DNA进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶TaqI酶切PCR扩增产物，获 得酶切产物；
(2)使用质量浓度为2％～3％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离， 然后根据电泳分离结果进行基因型判定；
(3)根据中国美利奴羊试验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ +G+L+A+G×L+G×A+A×L+e，然后利用JMP7.0统计软件将基因 型与连续性性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值；
(4)根据基因型将中国美利奴羊试验群体分为三种类型，从而实现预示和 鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度 的分子标记方法。
2、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(1)PCR扩增的反应体系如下所示：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53.8℃退火25s， 72℃延伸30s，共40个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。
3、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(1)获得的PCR扩增产物，序列如SeqNo.3所示。
4、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(1)酶切体系如下所示：
10×BufferTaqI1μL
内切酶TaqI1μL
PCR产物10μL
酶切条件为：65℃酶切3h。
5、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(2)基因型的判定的标准如下所示：
(1)电泳呈现两条带，大小为309bp和36bp，则绵羊SHCBP1基因第 14外显子区G14408374T位点突变时，PCR扩增产物可以被TaqI酶完全切 开，将其命名为TT基因型；
(2)电泳呈现一条带，大小为345bp，则绵羊SHCBP1基因第14外显 子区G14408374T位点未突变时，PCR扩增产物不能被TaqI酶切，将其命名 为GG基因型；
(3)电泳呈现三条带，大小为345bp、309bp和36bp，则绵羊SHCBP1 基因第14外显子区G14408374T位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被 TaqI酶完全切开，将其命名为GT基因型。
6、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(3)构建基因型效应统计模型，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值， G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互 作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，A×L为品系和年龄的互作效 应，e为剩余值效应。
7、如上所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法，所述的 步骤(3)中中国美利奴羊均为1～12岁的新疆军垦型母羊。
本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的 标记基因型对绵羊羊毛卷曲度进行选择时，将使绵羊羊毛的卷曲度取得很大的 遗传进展。羊毛卷曲度是羊毛重要的品质性状和经济性状，毛越弯曲，羊毛卷曲 度越大，毛柔软度越好，纺织性能越高，对羊毛价格有重要的影响。利用本发 明可以对羊毛卷曲度进行选择，不仅为绵羊羊毛的品质性状改良提供了一种有 效的分子标记育种手段，也为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有 效、简便易行的分子标记方法。本发明可以有效的应用于高卷曲度绵羊的分子 辅助育种领域，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速高卷曲度绵 羊的育种进程。
附图说明
图1为酶切产物的电泳分离图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
实施例1
中国美利奴羊基因组DNA的获得
采集绵羊耳组织，-20℃保存备用。采用常规的苯酚/氯仿法提取绵羊基因 组DNA。具体方法如下：
(1)取中国美利奴羊(新疆军垦型)耳组织5g，剔除结缔组织，将组织 块用70％酒精清洗、消毒，置于Eppendorf管内，用剪刀剪碎，或研磨碎；
(2)待Eppendorf管内的酒精完全挥发之后，加入分离缓冲液700μL， 悬浮剪碎的组织后，加入蛋白酶K(20mg/mL)5.0μL，55℃作用8-12h，直 到无组织块为止；
(3)将消化好的组织液取出，加入等量组织液的饱和酚，混匀10min，4 ℃，12000r/m，离心10min；
(4)取上清液，加等量的苯酚/氯仿，轻轻混匀10min，4℃，12000r/m， 离心10min；
(5)取上清液，加等量的氯仿，混匀10min，4℃，12000r/m，离心10 min；
(6)取上清液，加2倍量的无水乙醇沉淀，颠倒混匀后，室温下静置10- 20min，DNA沉淀形成白色絮状物；
(7)弃去上清，再加70％的乙醇清洗，弃去上清，在吸水纸上吸取多余 液体，自然风干后，加适量的TE溶解，-20℃保存；
(8)若DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000r/m短暂离心，取上清； 如要去除其中的RNA，可加入5μLRNaseA(10μg/μL)，37℃保温30min， 用酚抽提后，按步骤4-7重新沉淀DNA。
实施例2
绵羊SHCBP1基因酶切产物的获得
根据绵羊基因组中的SHCBP1基因G14408374T位点设计一对引物 SHCBP1-P1-F和SHCBP1-P1-R，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物，再用内切酶TaqI酶切PCR扩增产物，获得酶切产物。
引物序列如下所示：
SHCBP1-P1-F：5’-TGATTCAATGCGCAACTGGTA-3’
SHCBP1-P1-R：5’-AGACATGAAGCAAAGTATGATAGCAG-3’。
PCR扩增体系如下：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53.8℃退火25s，72 ℃延伸30s，共40个循环；72℃终延伸10min。
酶切反应体系如下：
10×BufferTaqI1μL
内切酶TaqI1μL
PCR产物10μL
酶切条件为：65℃酶切3h。
实施例3
绵羊SHCBP1基因型的判定
使用浓度为2％～3％的琼脂糖凝胶对实施例1中的酶切产物进行电泳分 离，根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准：(1)电泳呈现两条带， 大小为309bp和36bp，则绵羊SHCBP1基因第14外显子区G14408374T 位点突变时，PCR扩增产物可以被TaqI酶完全切开，将其命名为TT基因 型；(2)电泳呈现一条带，大小为345bp，则绵羊SHCBP1基因第14外显 子区G14408374T位点未突变时，PCR扩增产物不能被TaqI酶切，将其命名 为GG基因型；(3)电泳呈现三条带，大小为345bp、309bp和36bp，则 绵羊SHCBP1基因第14外显子区G14408374T位点处于杂合状态，PCR扩 增产物不能被TaqI酶完全切开，将其命名为GT基因型。
本发明中的729只中国美利奴羊均为新疆军垦型1～12岁的母羊，共检测到 3种基因型，对3种不同基因型在6个绵羊群体中的分布进行分析，GT型个 体最多，结果如表1所示，频率为0.4623。
表1SHCBP1-P1-基因不同基因型在绵羊群体中的分布
实施例4
基因型效应统计模型的构建
根据中国美利奴羊试验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G +L+A+G×L+G×A+A×L+e，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均 值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互 作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，A×L为品系和年龄的互作效应，e为 剩余值效应，然后利用JMP7.0统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析。
本发明羊毛性状测定根据国家纤维检验标准并参考国际毛纺织组织(IWTO) 纤维检测标准，对绵羊体侧部位毛样进行卷曲度的测定。本实施方式中羊毛卷 曲度是指沿羊毛长度方向上每厘米的卷曲程度，单位：卷曲个数/2.5cm。
本发明对SHCBP1基因第14外显子区G14408374T位点G/T单碱基 突变的3种基因型与中国美利奴羊(新疆军垦型)试验群体729个个体的羊毛 卷曲度、卷曲度标准差、卷曲度离散和卷曲度性状等进行最小二乘分析，结果 表明绵羊SHCBP1基因第14外显子区G14408374T位点不同基因型多态性 与中国美利奴羊(新疆军垦型)试验群体的羊毛卷曲度显著相关，P值为 0.0114；再对3种基因型间的最小二乘均值进行多重比较，结果表明具有GG 基因型和GT基因型群体的羊毛卷曲度显著高于TT基因型群体(P＜0.05)， 结果如表2所示。
表2SHCBP1基因第14外显子区不同基因型对羊毛卷曲度的影响
均值比较时同一行无相同字母者差异显著(a-bP＜0.05)
以上结果表明，SHCBP1基因可作为绵羊羊毛卷曲度的主要候选基因之 一，GG型和GT型可以作为分子遗传标记用于预测绵羊羊毛卷曲度性状。可 以组建GG型和GT型个体为主的羊毛卷曲度性状育种群体，有效培育出高卷 曲度的优质绵羊品系。
实施例5
绵羊羊毛卷曲度的分子标记方法的确立
根据基因型将中国美利奴羊试验群体分为三种类型，从而实现预示和鉴定 绵羊羊毛卷曲度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛卷曲度的分 子标记方法。