乳糖诊断/测定试剂(盒)及乳糖浓度测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。
牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影响。很多人在饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受地人还有大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良或乳糖酶缺乏。
据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为95％-100％。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3-13岁儿童乳糖不耐受症和乳糖吸收不良的发生率约为80％。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑发育，对人体健康危害很大。
在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明乳糖浓度测定方法如下：
乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖
葡萄糖+葡萄糖-1-磷酸麦芽糖磷酸化酶麦牙糖+磷酸根
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶
这种方法应用乳糖合成酶(lactose synthase EC 2.4.1.22)酶(偶)联麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase；EC 2.4.1.8)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；EC 1.2.1.59)酶促反应比色终点法。乳糖合成酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算乳糖的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
麦芽糖磷酸化酶 12000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
葡萄糖-1-磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 7mmol/L
本发明的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、乳糖合成酶、麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、尿苷二磷酸、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸。
试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、尿苷二磷酸、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、乳糖合成酶、麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、尿苷二磷酸、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、尿苷二磷酸、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶。
辅酶、乳糖合成酶、麦芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、尿苷二磷酸、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乳糖浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
【具体实施方式】
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
麦芽糖磷酸化酶 12000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
葡萄糖-1-磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 7mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
实施例二
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
葡萄糖-1-磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 7mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
麦芽糖磷酸化酶 12000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
实施例三
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
葡萄糖-1-磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 7mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
麦芽糖磷酸化酶 12000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定乳糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乳糖样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0007；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达20mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.0040±0.0020ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。