热对流聚合酶连锁反应之方法及装置 技术领域 本发明系属以聚合酶连锁反应 (PCR) 扩增核酸序列之领域。更特定而言， 本发明 系关于热对流 PCR 之方法及其装置。
背景技术 以聚合酶连锁反应 (PCR) 扩增特定核酸序列已为成熟技术， 且为医学及生物学研 究之有力工具。此生化反应过程需要三个主要步骤 ： 「变性反应」 、 「炼合反应」 及 「延伸反 应」 ， 其各需不同之反应温度。 现今商业化之 PCR 扩增技术所需样本包含欲扩增之模板 DNA、 与模板 DNA 各股上特定序列互补之寡核苷酸引子对、 热安定性 DNA 聚合酶、 以及脱氧核苷三 磷酸 (dNTP)。 随后藉由反复加热与冷却样本， 使样本在三种不同温度间循环， 藉以扩增模板 DNA 核酸序列之特定部分。
PCR 之第一步骤为变性反应， 其系将样本加热至高温， 俾使双股之模板 DNA 分离成 为单股 DNA。第二步骤为炼合反应， 其系将样本冷却至较低温度， 俾使引子与第一步骤所形
成之单股 DNA 结合， 形成 DNA 与引子之复合物。最后步骤为聚合 ( 延伸 ) 反应， 其系将样本 维持于适当温度， 藉由 DNA 聚合酶之作用， 使 DNA 与引子之复合物中之引子得以延伸， 从而 产生与模板 DNA 各股互补之新单股 DNA。每一次由上述三步骤组成之循环可复制两份引子 结合位置间之 DNA 序列。典型地， 将包含变性反应、 炼合反应及延伸反应等三个温度各异之 步骤的 PCR 循环重复约 20 至 40 次， 可生产出数百万个标的核酸序列之复制物。
变性反应之温度典型地系介于 90 至 94℃之范围。炼合反应之温度系依据所用引 子之解链温度 (melting temperature ； Tm) 而选择， 典型地系介于 35 至 65℃之范围。聚合 反应之典型温度为 72℃， 这是由于最常用之 DNA 聚合酶， 即 Taq DNA 聚合酶 ( 一种萃取自 Thermus aquaticus 之热安定性 DNA 聚合酶 )， 在该温度下活性最佳。由于 Taq DNA 聚合酶 具有广泛之温度范围， 因此其亦可使用仅有两个步骤之温度循环， 其中聚合温度与炼合温 度几乎相同。
在传统之市售 PCR 仪器 ( 亦即热循环仪器 ) 中， 样本之温度系以热传导方式控制。 简言之， 令含有 PCR 样本之反应容器与具有高导热性之固体金属块接触。该金属块与加热 及冷却装置相连， 使其可改变温度， 以达到所需温度。采用该方法之传统 PCR 仪器通常使用 具极高导热性之镀金银块及 / 或珀耳帖 (Peltier) 冷却方法， 以达成迅速之温度改变。然 而， 传统之热循环 PCR 并非有效率之程序， 因其尚需花费额外的时间及能源去加热及冷却 PCR 样本本身以外的物质。 此外， 由于机器本身精密的特性， 因此热循环仪器通常十分昂贵。
热对流 PCR 方法系于具有两个温度控制组件之装置上进行 PCR(Krishnan， M. 等 人， 2002， Science 298 ： 793)。Benett 等人在美国专利第 6,586,233 号 (2003 年 7 月 1 日 核准 ) 中揭示了热对流 PCR(CPCR) 之方法及装置， 其中由热对流驱动之样本溶液在一侧加 热之封闭 O 形槽内循环流动。Hwang 等人在美国专利申请案第 10/801,342 号 (2004 年 3 月 15 日公开， 公开号 2004/0152122) 中揭示了热对流 PCR 之方法及装置， 其使用复数个热源， 以在样本溶液中维持不同温度之区域， 使得当样本在各区域间循环时， PCR 的三个步骤可依序并重复地发生。
虽然已经提供一些热循环 PCR 之方法， 但其所需之装置包含复杂的结构且十分昂 贵， 因而阻碍其在商业上的应用。目前仍需更方便且实用之热对流 PCR(CPCR) 方法及装置。 发明内容
本发明提供可方便、 有效率且经济地进行热对流 PCR(CPCR) 之新颖方法及装置。
因此， 在第一方面， 本发明提供一种以聚合酶连锁反应 (PCR) 扩增标的核酸序列 之方法， 包含步骤 ：
(1) 提供管状容器 ；
(2) 将 PCR 样本置于该管状容器内， 其中该 PCR 样本包含具有欲扩增之标的核酸 序列的模板 DNA、 脱氧核糖核酸 (DNA) 聚合酶、 脱氧腺苷三磷酸 (dATP)、 脱氧胞苷三磷酸 (dCTP)、 脱氧鸟苷三磷酸 (dGTP)、 脱氧胸苷三磷酸 (dTTP) 及至少二种具有互补于标的核酸 序列之 3’ 端的序列之寡核苷酸引子， 其中该等引子系经设计为具有介于 40℃至约 90℃间 之解链温度 (Tm) ；
(3) 将该容器之底部埋置于热源中， 然后加热该 PCR 样本， 使引子解链， 并于稳定 维持 PCR 样本表面温度 (Ts) 低于引子之解链温度 (Tm) 至少约 2℃， 因而造成由 PCR 样本底 部至顶部渐减之温度梯度， 该梯度诱发热对流并致使下列事件依序并重复地在样本之不同 区域中发生 ： (i) 变性反应， 其中双股之模板 DNA 分离成为两条单股 DNA， (ii) 炼合反应， 其 中引子与单股 DNA 杂交形成 DNA 与引子之复合物， 及 (iii) 聚合 ( 延伸 ) 反应， 其中 DNA 与 引子之复合物中之引子藉由 DNA 聚合酶而延伸。
在第二方面， 本发明提供一种藉由本发明方法以聚合酶连锁反应 (PCR) 进行核酸 序列扩增之装置， 包含 ： (i) 单一热源 ； (ii) 在其中进行 PCR 之一或多个管状容器 ； 及 (iii) 支持物， 其具有使累积于多个容器间之热量均匀化之构件。 附图说明 上述发明内容及以下具体实施方式与所附图式一并阅读将更增了解。 为达阐明本 发明之目的， 图式中所示具体实例为目前较佳者。 然而， 应了解本发明并不限于所示之特定 排列及结构。
在图式中 ：
图 1 为根据本发明之 CPCR 的理想单一循环热对流图解， 其中 X 轴代表时间尺度， Y 轴代表温度尺度， 10、 20 及 30 表示 PCR 中所发生的三个事件 ( 分别为变性、 炼合及延伸 ) 之温度范围 ； 图 1A 显示根据本发明之 CPCR 的 PCR 样本之温度变化， 图 1B 显示传统 PCR 的 PCR 样本之温度变化， 以供比较。
图 2 为显示实例 1 之 PCR 结果之影像， 其中第 1 道及第 2 道代表使用相同样本及 程序的两次重复实验结果， 而第 3 道则代表负对照组之结果。
图 3 为显示实例 2 之 PCR 结果之影像， 其中标示为 「CPCR」 之各道为依据本发明方 法之 PCR 样本之结果， 所使用引子对之解链温度 (Tm) 如各道上端标示之数字， PCR 样本之表 面温度则为 68℃ ； 而标示为 「传统 PCR」 之各道则为相同样本但使用传统 PCR 方法之结果， 以供比较。
图 4 为依据本发明之装置 ( 具有均热器 ) 之具体实例的图像。
图 5 显示实例 3 之 CPCR 结果， 使用本发明之 CPCR 方法及具有或不具有均热器之 装置 ； 其中图 5A 显示样本位置之编号 ； 图 5B 显示无均热器之装置的 CPCR 结果 ； 图 5C 显示 有均热器之装置的 CPCR 结果。
图 6 显示实施依据本发明之 CPCR 方法的 PCR 样本之表面温度 (Ts) 变化， 样本位 置如图 5A 中位置编号 1-8 所示， 分为二组， 分别为使用具有或不具有均热器之装置 ； 其中曲 线 A(- ◆ -) 代表使用无均热器之装置之组别的变化， 曲线 B(- ■ -) 代表使用有均热器之 装置之组别的变化。 具体实施方式
本发明提供进行热对流 PCR 之新颖方法及装置。
本发明之具体实例为一种以 PCR 扩增标的核酸序列之方法， 包含步骤 ：
(1) 提供管状容器 ；
(2) 将 PCR 样本置于该管状容器内， 其中该 PCR 样本包含具有欲扩增之标的核酸序 列的模板 DNA、 DNA 聚合酶、 脱氧腺苷三磷酸 (dATP)、 脱氧胞苷三磷酸 (dCTP)、 脱氧鸟苷三磷 酸 (dGTP)、 脱氧胸苷三磷酸 (dTTP) 及至少二种互补于标的核酸序列之 3’ 端之序列的寡核 苷酸引子， 其中该等引子系经设计为具有介于 40℃至约 90℃间之解链温度 (Tm) ； (3) 将该容器之底部埋置于热源中， 然后加热该 PCR 样本， 使引子解链， 并稳定维 持 PCR 样本表面温度 (Ts) 低于引子之解链温度 (Tm) 至少约 2℃， 因而造成由 PCR 样本底部 至顶部渐减之温度梯度， 该梯度诱发热对流并使下列事件依序并重复地在样本之不同区域 发生 ： (i) 变性反应， 其中双股之模板 DNA 分离成为两条单股 DNA， (ii) 炼合反应， 其中引子 与单股 DNA 杂交形成 DNA 与引子之复合物， 及 (iii) 聚合 ( 延伸 ) 反应， 其中 DNA 与引子之 复合物中之引子藉由 DNA 聚合酶而延伸。
欲实施本发明之热对流 PCR(CPCR)， 需将 PCR 样本中随机且混乱之自然热对流转 变为稳定之单一热对流循环， 俾使模板 DNA 在各个不同事件所需之不同温度间循环而逐步 扩增。如图 1A 及 1B 所示， PCR 包含三个事件的发生 ： (i) 藉由加热达到高温之变性反应， (ii) 炼合反应， 及 (iii) 于低于变性温度之温度下的延伸 ( 聚合 ) 反应。特定而言， 在热对 流 PCR 中， 应使低温维持足够时间， 以进行 PCR 样本之炼合。
在本发明中意外发现， 当 PCR 样本表面温度 (Ts) 稳定地维持低于引子之解链温度 (Tm) 至少约 2℃时， 造成由 PCR 样本底部至顶部渐减之温度梯度， 此温度梯度会诱发热对流 并使事件依序并重复地在 PCR 样本的不同区域发生， 如实例 2 所示。
在本发明之方法中， 该管状容器可以油封闭， 以避免样本在反应过程中蒸发。 在本 发明之具体实例中， 该油可为矿物油。依据本发明， 可于 PCR 样本上面添加一滴矿物油， 使 样本表面为油所覆盖。
欲实施本发明之热对流 PCR， 必须维持由 PCR 样本底部至顶部渐减之温度梯度。 该 温度梯度可藉由加热管状容器之底部， 同时维持 PCR 样本表面温度低于引子解链温度 (Tm) 至少约 2℃之稳定温度 (Ts) 达成。 上述目标可藉由设计具有特定解链温度之适当引子及控 制 PCR 之各个参数达成。
为达成单一循环之热对流， 进行了本发明 CPCR 之计算机仿真， 以得知各个 PCR 参
数间之关联性， 该等参数包括 ： PCR 样本之总体积 (V， 单位为 μl)、 PCR 溶液之黏度 (μ， 单 位为 Ns/m2)， 容器之内直径 (d， 单位为 mm)， 以及 PCR 样本之表面温度 (Ts， 单位为℃ )， 此单 一循环之热对流的达成可由下列公式决定 ：
V ＝ (A×Ts+B-500μ+0.7)×e(1.86+100μ)d
其中 A 值介于 -0.019 与 -0.016 之间， 且 B 值介于 1.85 与 2.27 之间。在本发明 之较佳具体实例中， A 值为 -0.01812 而 B 值为 2.1。
在本发明之具体实例中， Ts 系介于约 40 ℃与约 80 ℃之间 ； μ 系介于 0.001Ns/ m2 与 0.0018Ns/m2 之间 ； 且 d 系介于 0.6mm 与 5.0mm 之间。在较佳具体实例中， Ts 系介于 约 55℃与约 70℃之间 ； μ 系介于 0.001Ns/m2 与 0.0016Ns/m2 之间 ； 且 d 系介于 0.8mm 与 4.0mm 之间。在最佳具体实例中， Ts 系介于约 65℃与约 68℃之间 ； μ 系介于 0.001Ns/m2 与 0.0014Ns/m2 之间 ； 且 d 系介于 0.8mm 与 2.5mm 之间。
欲增加 PCR 样本之黏度， 可于样本添加非反应性液态物质。适当之物质为任何非 反应性之有机或无机物质， 包括但不限于甘油、 NP-40、 Tween20、 EDTA、 DMSO、 甲酰胺、 甜菜碱 及明胶。较佳之物质为甘油、 NP-40、 Tween 20 及 EDTA。最佳之物质为甘油。增加黏度物 质之添加量应为任何可达成所需黏度之量。在本发明之具体实例中， PCR 样本中添加 4％至 8％ v/v 之甘油。 本发明提供一种以聚合酶连锁反应 (PCR) 藉由本发明之方法进行核酸序列扩增 之装置， 包含 ： (i) 单一热源 ； (ii) 在其中进行 PCR 之一或多个管状容器 ； 及 (iii) 支持物， 其具有使累积于多个容器间之热量均匀化之构件。
本发明中所使用之热源可为具有控温构件之简单加热装置。 适当热源包括但不限 于干浴加热器、 水浴加热器及油浴加热器。在本发明之具体实例中， 热源为沸腾中之水。
本发明之管状容器可以任何材料制成， 只要该材料为生物可兼容性且具有至少 120℃之抗热性即可。适当之材料包括聚合物材料如聚丙烯 (PP)、 聚碳酸酯 (PC)、 聚乙烯 (PE)、 聚砜 (PSF) 及聚醚砜 (PES)， 以及玻璃。
在本发明之具体实例中， 采用累积于多个容器之热量均匀化的构件为均热器， 其 可为金属板制成， 俾使复数试验之 PCR 中多个容器之表面温度均匀化。 本文中所用之 「均热 器」 乙词系指通常由铝或铜制成之外壳， 其系设计用以覆盖电子装置并散热， 通常用于计算 机之 CPU( 中央处理器 )。 例如， 用于进行复数试验 CPCR 之装置可包含具有均热器之配备之 支持物。在依据本发明之装置中， 均热器系用于驱散累积于复数试验 CPCR 容器之间隙的热 量。在本发明之具体实例中， 支持物系设计用于支持排列成长方矩阵之多个容器。在本发 明之较佳具体实例中， 该支持物系设计为可支持排列成 8 ∶ 12 之长方矩阵之 96 个容器。
本发明之装置亦可包含测量 PCR 样本表面温度之构件。该构件之实例为温度计。
本发明进一步以下列实例阐明。该等实例系供例示之目的， 在任何方面均不应视 为限制本发明范畴。
实例
在以下实例中， 下列缩写具有下列意义 ： ℃＝摄氏度数 ； hr ＝小时 ； min ＝分钟 ； sec ＝秒 ； M ＝莫耳浓度 ； mM ＝毫莫耳浓度 ； μM ＝微莫耳浓度 ； L 或 l ＝升 ； ml ＝毫升 ； μl ＝微升 ； G 或 g ＝克 ； mg ＝毫克 ； μg ＝微克 ； pg ＝毫微克。未定义之缩写具有一般所接受 之意义。
实例 1 1. 材料与方法 1.1 样本 PCR 样 本 包 含 下 列 反 应 试 剂 ： 3.32pg 之 模 板 DNA(pHBV-48， GenBank 编 号 -3Z 载 体 (Promega Corporation， Madison， WI) 中 )、 FastStart DNA MasterNC003977，其 插 入 于1.5pmol 之 F118 引 子 (5’ -CCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCG-3’ )、 1.5pmol 之 R145 引 子 (5’ -TCCAGTTGGCAGCACAGCCTAGCAG C-3’ )、 7.5μl 之 HybProbe 热起始反应混合物 (Rosche Applied Science， Indianapolis， IN) 及 5％ v/v 之 甘油。
进行仿真本发明 CPCR 抽象模型之计算机仿真， 获得如下式之参数公式 ： (1.86+100μ)d
V ＝ (A×Ts+B-500μ+0.7)×e
其中 A ＝ -0.01812， B ＝ 2.1， Ts ＝ 68℃， μ ＝ 0.0012Ns/m2， 且
d ＝ 2.2mm。
基于以上公式， 可算出 PCR 样本之总体基为 75.44μl。
1.2 装置 用于进行本发明热对流 PCR 之装置系由下列组件构成 ： 具控温功能之加热槽、 用 作反应容器之复数个玻璃毛细管 ( 内直径为 2.2mm)、 及具均热器之支持物， 如图 4 所示。
1.3 流程
在整个实验中， 加热槽中之硅油温度均维持于 95℃。 将 PCR 样本及一负对照组 ( 与 样本之成分相同， 但以相同体积， 即 30λ 之 ddH2O 取代模板 DNA) 分别注入玻璃毛细管中， 并以 10μl 之矿物油密封。然后将该等毛细管置于加热槽之站架上， 使各毛细管之下半部 埋置于加热之硅油中， 达 25 分钟。在整个反应过程中， 周围环境温度系维持于室温。时间 到时， 由站架取出毛细管并取各毛细管中 2μl 之所得混合物， 进行电泳分析。
2. 结果
于 2％洋菜胶上分析所得 PCR 反应产物， 结果示于图 2。如图 2 所示， 第 1 道及第 2 道中之明亮条带显示本发明之热对流 PCR 方法在少于半小时内即正确地扩增了 122bp 之 标的序列。 当使用传统式热循环机台时， 整个反应需花费超过一个半小时， 且造成之产品复 制数仍然较少 ( 数据未显示 )。 因此， 本发明之方法在效率及经济层面均较传统之 PCR 方法 优异。
实例 2
设计如下表 1 所示之七对引子对， 解链温度 (Tm) 介于 58℃至 80℃， 其中各引子之 Tm 系使用 Lightcycler Probe Design 2.0(Roche， Germany) 程序计算。
使用表 1 所示各对引子， 依据实例 1 所述方法及程序分别进行 CPCR， PCR 样本之 Ts 温度为 68℃。CPCR 之结果示于图 3， 使用 Tm 为 70 或高于 70 之引子之组别产生 122bp 条 带。鉴于上述发现， 结论为当 Ts 值少于 Tm 值至少约 2℃时可成功进行 CPCR。
表 1 经设计之引子序列及 Tm 值
名称 mer Tm(℃ ) 5`
HBV set 1-F 35 80 GCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCG
HBV set 1-R 33 80 CGCAGGATCCAGTTGGCAGCACAGCCTAGCAGC
HBV set 2-F 27 77 CCTA GCAG CTTG TTTT GCTC GCAG CCG
HBV set 2-R 26 76 TCCA GTTG GCAG CACA GCCT AGCA GC
HBV set 3-F 23 73 GCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCG
HBV set 3-R 22 72 GTTGGCAGCACAGCCTAGCAGC
HBV set 4-F 20 70 GCTTGTTTTGCTCGCAGCCG
HBV set 4-R 19 70 GGCAGCACAGCCTAGCAGC
HBV set 5-F 18 65 TTGTTTTGCTCGCAGCCG
HBV set 5-R 17 65 CAGCACAGCCTAGCAGC
HBV set 6-F 15 62 TTTTGCTCGCAGCCG
HBV set 6-R 15 62 GCACAGCCTAGCAGC
HBV set 7-F 13 61 TTGCTCGCAGCCG
HBV set 7-R 14 58 CACAGCCTAGCAGC
实例 3
分别使用具有或不具有支持物 ( 含均热器 ) 之装置进行 CPCR。 支持物系经设计为 可支持 96 个容器， 容器排列方式为 8( 栏 A-H) ： 12( 列 1-12) 的长方矩阵， 参见图 4。选择 此矩阵中 10 个不同位置的样本， 如图 5A 所示予以编号。图 5B( 无均热器 ) 及 5C( 有均热 器 ) 显示 CPCR 结果。如图 5B 及 5C 所示， 使用无均热器之装置时， 位于矩阵中心附近的位 置 3、 4 及 5 均无结果 ； 然而， 使用有均热器的装置时， 所有位置的 CPCR 结果均十分良好。
图 6 显示具有或不具有均热器之装置的进一步比较结果。测量并记录编号 1-10 之各 PCR 样本在加热后 30 分钟内之表面温度， 图 6 显示各样本在 30 分钟期间内之表面温 度 (Ts) 变化， 其中曲线 A 代表使用无均热器之装置之组别的变化， 曲线 B 代表使用有均热 器之装置之组别的变化。 结果显示， 使用有均热器之装置之组别的 Ts 值变化在 1℃以内， 但 使用无均热器之装置之组别的变化则在 2 ～ 3℃内。这表示具有均热器之装置可为实验中 之各位置提供稳定的表面温度， 以及 CPCR 所需的稳定热量条件。
熟习本技艺者应了解， 可针对上述具体实例加以改变而不背离其广泛之发明概 念。 因此， 应了解本发明并不限于所揭示之特定具体实例， 而是要涵盖下附申请专利范围所 定义之本发明精神及范畴内的修饰。