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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710402513.9 (22)申请日 2017.06.01 (71)申请人 溯源生命科技股份有限公司 地址 100089 北京市海淀区北清路68号院 24号楼F区1-3层 (72)发明人 周丽英汪晓敏袁卫平万谦 (74)专利代理机构 北京科家知识产权代理事务 所(普通合伙) 11427 代理人 陈娟 (51)Int.Cl. C12N 5/077(2010.01) (54)发明名称 一种提高脂肪细胞移植成活率的方法 (57)摘要 本发明公开了一种提高脂肪细胞移植成活 率的方。
2、法， 它涉及细胞移植技术领域。 所述的提 高脂肪细胞移植成活率的方法为： 步骤一、 脂肪 干细胞获取， 步骤二、 脂肪细胞获取， 移植， 在处 理脂肪细胞的同时收获培养的脂肪干细胞， 计 数； 将脂肪干细胞与脂肪细胞按2:1比例进行混 合； 得到的细胞悬液进行移植到相应部位。 脂肪 干细胞的获取步骤较为简单， 脂肪干细胞能够分 泌多种生长营养因子， 改善组织器官内部的微环 境， 因此， 利用自体脂肪干细胞与脂肪细胞共移 植无疑可以大大改善脂肪细胞填充后因缺乏养 分而造成的死亡， 从而提高脂肪细胞的移植成活 率。 权利要求书1页 说明书3页 CN 107287155 A 2017.10.24 C。
3、N 107287155 A 1.一种提高脂肪细胞移植成活率的方法， 其特征在于： 提高脂肪细胞移植成活率的方 法为： 步骤一、 脂肪干细胞获取， 1-1、 将吸脂来源的脂肪组织放入预冷含1%双抗的生理盐水 中， 密封， 低温条件下,2-8下送回实验室； 1-2、 将上述脂肪组织用生理盐水冲洗， 去除残 留的血细胞和组织碎片， 把脂肪组织放入离心管中， 记录原始体积， 向组织中加入等体积的 消化液， 所述的消化液由0.25%胰酶， 0.1%I型胶原酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气 浴振荡器中消化30min， 然后将消化好的组织静置5min， 此时液面分为3层， 上层黄色油状物 是破碎。
4、的脂肪细胞释放的脂滴， 中层为大颗粒脂肪细胞层， 间或混合少量纤维， 下层为单个 核细胞层； 1-3、 弃掉上层和中层细胞， 将下层的细胞悬液以1500r/min， 离心10min后弃上 清， 得到离心管底部的脂肪干细胞团， 用非动物源血清L-DMEM培养液将其重悬， 密度调整到 1105个/mL， 然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中； 1-4、 在 37下5%的CO2条件下 培养； 1-5、 当脂肪干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代， 首先， 用生理盐水冲洗一遍细 胞， 然后加入3mL的混合酶溶液， 所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的EDTA在体积为为 1:1情况下配置。
5、而成,消化， 当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形， 缩成球状后， 立即用 等体积的培养基中止消化， 并用吸管轻轻吹打瓶底部， 确保细胞完全脱落至悬液中， 1000r/ min， 离心5min， 然后， 将离心得到的细胞团重悬， 调整密度后按1:2进行接种； 1-6、 在37， 5%的CO2条件下传代培养； 1-7、 细胞冻存， 冻存细胞前在12h内进行换液， 具体步骤与步骤1- 5相同， 即弃去培养液， 生理盐水洗一遍， 加入消化液， 待消化完成后， 中止消化； 轻轻吹打使 细胞悬浮于生理盐水中， 1000r/min， 离心5min； 弃上清， 再用生理盐水洗一遍， 计数； 最后加 入冻存液。
6、,所述的冻存液中无血清L-DMEM培养液： 人血白蛋白： DMSO=5:4:1， 使得细胞密度 为1106个/mL左右； 分装至2mL冻存管中， 每管1mL-1.5mL； 将冻存管放入程序降温盒内， 然 后放入-80冰箱过夜， 转至液氮罐内长期储存； 1-8、 细胞复苏， 从液氮中迅速取出冻存管， 立即放入37恒温水浴锅中， 并不断晃动， 使其完全溶化； 无菌条件下， 将细胞转移至含5mL 无血清L-DMEM培养液离心管中， 在1000r/min情况下， 离心5min， 弃上清； 重复洗一遍； 加入 适量非动物源血清L-DMEM培养液后接种于培养瓶中； 37、 5%CO2条件下培养， 待用； 。
7、步骤二、 脂肪细胞获取， 2-1、 将吸脂来源的脂肪组织用生理盐水冲洗， 去除残留的血细 胞和组织碎片， 把脂肪组织放入离心管中， 记录原始体积； 2-2、 向组织中加入等体积的消化 液,所述的消化液由0.25%胰酶， 0.1%的I型胶原酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气浴 振荡器中消化30min， 然后将消化好的组织静置5min， 待其分层后， 用吸管吸取位于悬液中 层的脂肪细胞， 用细胞筛网过滤， 并将过滤后的细胞悬液以1000r/min， 离心2min后弃掉下 层悬液得到脂肪细胞； 2-3、 用生理盐水悬浮细胞， 计数； 步骤三、 移植， 3-1、 在处理脂肪细胞 的同时收获培。
8、养的脂肪干细胞， 计数； 3-2 、 将脂肪干细胞与脂肪细胞按2:1比例进行混合； 3-3 、 将步骤3-2中得到的细胞悬液进行移植到相应部位。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107287155 A 2 一种提高脂肪细胞移植成活率的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种提高脂肪细胞移植成活率的方法， 属于细胞移植技术领域。 背景技术 0002 随着年龄的增长， 皮肤会逐渐出现松弛、 弹性减弱以及局部凹陷等老化现象， 整形 外科常抽出患者身体多余脂肪， 纯化脂肪细胞后补充到患者需要填充的部位， 不仅快速美 化形体曲线， 且使脂肪的损伤降到最低。 一般采用低速离心、 提纯、 净化处理后， 选。
9、择完整的 脂肪细胞颗粒， 利用精细联合化注射技术， 多层次多点进行太阳穴、 苹果肌、 面颊、 额头、 鼻 子、 口周等面部填充/除皱/塑形等。 0003 自体脂肪移植已有上百年的历史， 由于其来源丰富、 取材容易、 操作简单、 充盈外 形好、 局部反应小， 无排异反应等优点， 且移植后具有较好的手感而易被患者接受， 可以获 得较好的塑形等效果备受整形美容外科医师的重视。 因此， 近年来， 自体脂肪移植美容已经 成为爱美者最为接受的美容方式之一。 0004 目前自体脂肪是整形外科进行软组织填充和塑形的常用填充材料， 自体脂肪填充 在临床上应用广泛， 自1893年Neuber首次报道后一直是整形外。
10、科的研究热点。 近100年来， 自体脂肪填充应用范围不断扩展， 可用于隆胸、 隆颌、 隆鼻术， 应用于面部老化处、 肢体不对 称、 凹陷性瘢痕以及各种原因导致的组织缺损处等。 0005 早期自体脂肪填充手术效果存在缺陷， 填充的脂肪吸收率高， 造成自体脂肪数量 减少， 填充部位出现感染、 液化、 坏死、 钙化以及囊肿形成等不良反应。 Coleman技术诞生后 一定程度上提高了移植脂肪的存活率， 自体脂肪填充才逐渐广泛应用于临床， 但自体脂肪 的吸收率仍较高。 脂肪抽脂技术将获得的脂肪推注到软组织损伤部位， 即脂肪细胞移植技 术， 但依旧存在移植脂肪低成活率和高吸收率的问题。 0006 虽然自体。
11、脂肪细胞移植备受整形美容外科医师的重视， 但是到目前仍未成为一种 常规的手术方法， 主要原因为移植后存活脂肪通常占初始脂肪体积的40%-50%， 而有些报道 脂肪组织最多仅仅存活10%， 这使得单纯的自体脂肪细胞注射的应用受到限制， 脂肪组织吸 收并且最终被纤维结缔组织所替代。 脂肪细胞移植成活率低的原因可能有两点， 一是成熟 脂肪细胞对损伤的耐受能力低， 不具备增殖更新的能力； 二是移植脂肪组织新生血管化速 度和程度低， 导致移植的脂肪组织缺少血供引起氧和营养的缺乏， 从而效果不佳。 0007 多数研究认为脂肪细胞填充后局部环境缺氧是影响脂肪成活的最重要因素。 自体 脂肪填充后初期， 脂肪处。
12、于缺氧和缺血环境， 通过受体区周围组织渗透作用获得养分； 新生 毛细血管形成后， 受体区域血运重建， 脂肪即可通过血运获得养分。 缺氧条件下脂肪细胞非 常敏感， 当氧分压过低， 超过其耐受阈值时， 脂肪细胞凋亡。 可见， 自体脂肪填充后成活的关 键是早期重建血运。 如果在植入组织中加入脂肪源性干细胞， 提高其中的干细胞与脂肪细 胞比例， 可使植入组织的整体存活率增加， 此即ADSCs协助自体脂肪移植术 （Cell-Assisted Lipotransfer， CAL） 。 0008 现有的脂肪细胞培养过程中成活率较低， 且步骤繁琐， 因此需要研究一种能提高 说明书 1/3 页 3 CN 107。
13、287155 A 3 脂肪细胞移植成活率的方法。 发明内容 0009 针对上述问题， 本发明要解决的技术问题是提供一种提高脂肪细胞移植成活率的 方法。 0010 本发明的提高脂肪细胞移植成活率的方法为： 步骤一、 脂肪干细胞获取， 1-1、 将吸 脂来源的脂肪组织放入预冷含1%双抗的生理盐水中， 密封， 低温条件下,2-8下送回实验 室； 1-2、 将上述脂肪组织用生理盐水冲洗， 去除残留的血细胞和组织碎片， 把脂肪组织放入 离心管中， 记录原始体积， 向组织中加入等体积的消化液， 所述的消化液由0.25%胰酶， 0.1% I型胶原酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气浴振荡器中消化30。
14、min， 然后将消化好的 组织静置5min， 此时液面分为3层， 上层黄色油状物是破碎的脂肪细胞释放的脂滴， 中层为 大颗粒脂肪细胞层， 间或混合少量纤维， 下层为单个核细胞层； 1-3、 弃掉上层和中层细胞， 将下层的细胞悬液以1500r/min， 离心10min后弃上清， 得到离心管底部的脂肪干细胞团， 用 非动物源血清L-DMEM培养液将其重悬， 密度调整到1105个/mL， 然后接种在培养面积为 25cm2的细胞培养瓶中； 1-4、 在 37下5%的CO2条件下培养； 1-5、 当脂肪干细胞长满培养瓶 后按一传二进行传代， 首先， 用生理盐水冲洗一遍细胞， 然后加入3mL的混合酶溶液，。
15、 所述的 混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的EDTA在体积为为1:1情况下配置而成,消化， 当在显微镜 下观察到细胞发生明显的变形， 缩成球状后， 立即用等体积的培养基中止消化， 并用吸管轻 轻吹打瓶底部， 确保细胞完全脱落至悬液中， 1000r/min， 离心5min， 然后， 将离心得到的细 胞团重悬， 调整密度后按1:2进行接种； 1-6、 在37， 5%的CO2条件下传代培养； 1-7、 细胞冻 存， 冻存细胞前在12h内进行换液， 具体步骤与步骤1-5相同， 即弃去培养液， 生理盐水洗一 遍， 加入消化液， 待消化完成后， 中止消化； 轻轻吹打使细胞悬浮于生理盐水中， 1000。
16、r/min， 离心5min； 弃上清， 再用生理盐水洗一遍， 计数； 最后加入冻存液,所述的冻存液中无血清L- DMEM培养液： 人血白蛋白： DMSO=5:4:1， 使得细胞密度为1106个/mL左右； 分装至2mL冻存 管中， 每管1mL-1.5mL； 将冻存管放入程序降温盒内， 然后放入-80冰箱过夜， 转至液氮罐 内长期储存； 1-8、 细胞复苏， 从液氮中迅速取出冻存管， 立即放入37恒温水浴锅中， 并不 断晃动， 使其完全溶化； 无菌条件下， 将细胞转移至含5mL无血清L-DMEM培养液离心管中， 在 1000r/min情况下， 离心5min， 弃上清； 重复洗一遍； 加入适量非动。
17、物源血清L-DMEM培养液后 接种于培养瓶中； 37、 5%CO2条件下培养， 待用； 步骤二、 脂肪细胞获取， 2-1、 将吸脂来源的 脂肪组织用生理盐水冲洗， 去除残留的血细胞和组织碎片， 把脂肪组织放入离心管中， 记录 原始体积； 2-2、 向组织中加入等体积的消化液,所述的消化液由0.25%胰酶， 0.1%的I型胶原 酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气浴振荡器中消化30min， 然后将消化好的组织静置 5min， 待其分层后， 用吸管吸取位于悬液中层的脂肪细胞， 用细胞筛网过滤， 并将过滤后的 细胞悬液以1000r/min， 离心2min后弃掉下层悬液得到脂肪细胞； 2-3、。
18、 用生理盐水悬浮细 胞， 计数； 步骤三、 移植， 3-1、 在处理脂肪细胞的同时收获培养的脂肪干细胞， 计数； 3-2 、 将 脂肪干细胞与脂肪细胞按2:1比例进行混合， 3-3 、 将步骤3-2中得到的细胞悬液进行移植 到相应部位。 本发明的有益效果： 脂肪干细胞的获取步骤较为简单， 脂肪干细胞能够分泌多 种生长营养因子， 改善组织器官内部的微环境， 因此， 利用自体脂肪干细胞与脂肪细胞共移 植无疑可以大大改善脂肪细胞填充后因缺乏养分而造成的死亡， 从而提高脂肪细胞的移植 说明书 2/3 页 4 CN 107287155 A 4 成活率。 具体实施方式 0011 本具体实施方式采用以下技术。
19、方案： 所述的提高脂肪细胞移植成活率的方法为： 步骤一、 脂肪干细胞获取， 1-1、 将吸脂来源的脂肪组织放入预冷含1%双抗的生理盐水中， 密 封， 低温条件下,2-8下送回实验室； 1-2、 将上述脂肪组织用生理盐水冲洗， 去除残留的血 细胞和组织碎片， 把脂肪组织放入离心管中， 记录原始体积， 向组织中加入等体积的消化 液， 所述的消化液由0.25%胰酶， 0.1%I型胶原酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气浴振 荡器中消化30min， 然后将消化好的组织静置5min， 此时液面分为3层， 上层黄色油状物是破 碎的脂肪细胞释放的脂滴， 中层为大颗粒脂肪细胞层， 间或混合少量纤维， 。
20、下层为单个核细 胞层； 1-3、 弃掉上层和中层细胞， 将下层的细胞悬液以1500r/min， 离心10min后弃上清， 得 到离心管底部的脂肪干细胞团， 用非动物源血清L-DMEM培养液将其重悬， 密度调整到1 105个/mL， 然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中； 1-4、 在 37下5%的CO2条件下培 养； 1-5、 当脂肪干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代， 首先， 用生理盐水冲洗一遍细胞， 然后加入3mL的混合酶溶液， 所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的EDTA在体积为为1:1 情况下配置而成,消化， 当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形， 缩成球状后， 立即。
21、用等 体积的培养基中止消化， 并用吸管轻轻吹打瓶底部， 确保细胞完全脱落至悬液中， 1000r/ min， 离心5min， 然后， 将离心得到的细胞团重悬， 调整密度后按1:2进行接种； 1-6、 在37， 5%的CO2条件下传代培养； 1-7、 细胞冻存， 冻存细胞前在12h内进行换液， 具体步骤与步骤1- 5相同， 即弃去培养液， 生理盐水洗一遍， 加入消化液， 待消化完成后， 中止消化； 轻轻吹打使 细胞悬浮于生理盐水中， 1000r/min， 离心5min； 弃上清， 再用生理盐水洗一遍， 计数； 最后加 入冻存液,所述的冻存液中无血清L-DMEM培养液： 人血白蛋白： DMSO=5:。
22、4:1， 使得细胞密度 为1106个/mL左右； 分装至2mL冻存管中， 每管1mL-1.5mL； 将冻存管放入程序降温盒内， 然 后放入-80冰箱过夜， 转至液氮罐内长期储存； 1-8、 细胞复苏， 从液氮中迅速取出冻存管， 立即放入37恒温水浴锅中， 并不断晃动， 使其完全溶化； 无菌条件下， 将细胞转移至含5mL 无血清L-DMEM培养液离心管中， 在1000r/min情况下， 离心5min， 弃上清； 重复洗一遍； 加入 适量非动物源血清L-DMEM培养液后接种于培养瓶中； 37、 5%CO2条件下培养， 待用； 步骤 二、 脂肪细胞获取， 2-1、 将吸脂来源的脂肪组织用生理盐水冲洗。
23、， 去除残留的血细胞和组织 碎片， 把脂肪组织放入离心管中， 记录原始体积； 2-2、 向组织中加入等体积的消化液,所述 的消化液由0.25%胰酶， 0.1%的I型胶原酶， 以1:1比例混合配制而成， 放入37气浴振荡器 中消化30min， 然后将消化好的组织静置5min， 待其分层后， 用吸管吸取位于悬液中层的脂 肪细胞， 用细胞筛网过滤， 并将过滤后的细胞悬液以1000r/min， 离心2min后弃掉下层悬液 得到脂肪细胞； 2-3、 用生理盐水悬浮细胞， 计数； 步骤三、 移植， 3-1、 在处理脂肪细胞的同时 收获培养的脂肪干细胞， 计数； 3-2 、 将脂肪干细胞与脂肪细胞按2:1比例进行混合， 3-3 、 将步骤3-2中得到的细胞悬液进行移植到相应部位。 以上显示和描述了本发明的基本原理 和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提 下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。 说明书 3/3 页 5 CN 107287155 A 5 。