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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610091024.1 (22)申请日 2016.02.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105566431 A (43)申请公布日 2016.05.11 (73)专利权人 常州市第四制药厂有限公司 地址 213004 江苏省常州市离宫路168号 (72)发明人 陈巍孙永强严益民冯晓晖 屠永锐蒋伟钱明霞王菊香 祁琪曹月华 (51)Int.Cl. C07J 41/00(2006.01) G01N 30/02(2006.01) 审查员 蒋薇薇 (54)发明名。
2、称 一种醋酸乌利司他的杂质及其制备和检测 方法 (57)摘要 本发明提供一种醋酸乌利司他的杂质化合 物及其制备方法， 具体地说， 提供了新化合物杂 质F(化合物F)和杂质K(化合物K)， 并还提供所述 杂质的检测方法及其用于醋酸乌利司他原料药 及其制剂的质量分析的用途。 权利要求书1页 说明书21页 附图4页 CN 105566431 B 2017.11.24 CN 105566431 B 1.一种化合物的检测方法， 所述化合物为化合物F： 化合物F： 其特征在于所述方法为HPLC法或者HPLC-MS法， 所述的HPLC法的检测条件为： 固定相以 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 流动相为pH2。
3、.53.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈， 体积比为 30 7050 50， 检测波长为302nm； 所述的HPLC-MS法的检测条件为： HPLC的色谱条件为固定 相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 流动相为乙腈： 0.1甲酸水50： 50， MS的条件为采 用选择性离子检测法， 检测化合物F母离子M+H+m/z518.2。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其中所述的流动相为pH3.0的三乙胺磷酸溶液-乙 腈， 体积比为40 60。 3.一种醋酸乌利司他原料药或者制剂的质量检测方法， 其包括按照权利要求1或2所述 方法测定其中有关物质的步骤。 4.根据权利要求3所述的质量检测方法， 其中所述的有。
4、关物质检测中， 供试品溶液的色 谱图中如有杂质峰， 以峰面积计算， 与各杂质相对应的峰各不得大于杂质对照品溶液的 0.15倍， 即杂质含量不超过0.15。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105566431 B 2 一种醋酸乌利司他的杂质及其制备和检测方法 技术领域 0001 本发明提供一种醋酸乌利司他的杂质化合物及其制备和检测方法， 所述的杂质化 合物应用于醋酸乌利司他原料药及其制剂的质量分析。 属于分析化学领域， 尤其涉及药物 分析化学领域。 背景技术 0002 醋酸乌利司他(Ulipristal Acetate； 化合物X； 化学名： 17 -乙酰氧基-11 -4- (N,N-二甲基氨。
5、基)苯基-19-去甲孕甾-4， 9-二烯-3， 20-二酮)是一种强效的抗孕激素和抗 糖皮质激素药物。 结构式如下： 0003 0004 醋酸乌利司他作为紧急避孕药已在欧洲和美国批准上市， 用于无防护性生活或已 知或怀疑避孕失败后5天内使用， 是一种有效且安全的紧急避孕药。 紧急避孕被定义为防止 无保护措施性行为导致的怀孕的治疗方法， 是一种防止无保护措施的性行为导致的意外怀 孕的重要方法。 它是作为偶然、 紧急时使用的一个备用措施。 0005 醋酸乌利司他作为子宫肌瘤治疗药已在欧洲批准上市， 用于术前治疗育龄妇女中 度重度子宫肌瘤。 子宫肌瘤(又称子宫平滑肌瘤)是良性的， 单克隆的， 激素-。
6、敏感的子宫平 滑肌肿瘤。 它是女性绝经前生殖道最常见肿瘤， 据报道育龄女性20-40患有这种肿瘤。 子 宫肌瘤经常无症状， 但当出现症状时， 最初的症状是严重的子宫出血， 贫血， 腹部受压， 腹部 疼痛， 尿频加重和不育。 尤其， 严重的经血量减少是最常见的子宫肌瘤的症状。 0006 现有技术CN102516345B公开了可工业化生产醋酸乌利司他的方法， 是以易得的3, 3-(亚乙二氧基-19-去甲孕甾-5(10),9(11)-二烯-3,17-二酮(化合物II)与氰基化试剂加 成反应得到化合物III， 然后将17 -羟基保护， 得到式IV化合物， 接着与甲基锂或甲基格式 试剂反应后经酸水解得到。
7、式V化合物， 再经对甲苯磺酸等催化与乙二醇反应得到3,20-双缩 酮化合物VI， 然后环氧化反应得到环氧物VII， 接着与格氏试剂反应得到化合物VIII， 再经 酸性条件下水解得到化合物IX， 最后经乙酸化得到醋酸乌利司他(化合物X)(Scheme 1)。 该 方法合成路线短， 共8步反应， 而且反应条件温和， 更容易进行， 总收率约25-27左右， 且操 作更简便， 宜于产业化。 说明书 1/21 页 3 CN 105566431 B 3 0007 0008 任何影响药物纯度的物质统称为杂质。 杂质的研究是药品研发的一项重要内容， 它包括选择合适的分析方法， 准确地分辨与测定杂质的含量并综合。
8、药学、 毒理及临床研究 的结果确定杂质的合理限度。 这一研究贯穿于药品研发的整个过程。 药品中的杂质按其理 化性质一般分为三类： 有机杂质、 无机杂质及残留溶剂。 按照其来源， 杂质可以分为工艺杂 质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、 中间体、 副产物等)、 降解产物、 从反应物及试 剂中混入的杂质等。 按照其毒性分类， 杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。 杂质还可按其 化学结构分类， 如甾体、 生物碱、 几何异构体、 光学异构体和聚合物等。 有机杂质包括工艺中 引入的杂质和降解产物等， 可能是已知的或未知的、 挥发性的或不挥发性的。 由于这类杂质 的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系。
9、， 故通常又可称之为有关物质。 分析方法的 选择直接关系到杂质测定结果的专属性与准确性， 因此， 在进行杂质研究时首要问题是选 择合适的杂质分析方法。 0009 药物杂质检查分析方法应灵敏、 专属。 通过合适的分析技术将不同结构的杂质进 行分离、 检测， 从而达到对杂质的有效控制。 随着分离、 检测技术的发展与更新， 高效、 快速 的分离技术与灵敏、 稳定、 准确、 适用的检测手段相结合， 几乎所有的有机杂质均能在合适 的条件下得到很好的分离与检测。 在质量标准中， 目前普遍采用的杂质检测方法主要为高 效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography；。
10、 HPLC)、 薄层色谱法(Thin Layer Chromatography； TLC)、 气相色谱法(Gas Chromatography； GC)和毛细管电泳法 (Capillary Electrophoresis； CE)。 近年来， 质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛， 气相色谱联用技术、 液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。 发明内容 0010 为了更好地控制醋酸乌利司他原料药及其制剂的药物质量， 本发明对原料药中的 杂质进行研究， 获得了相关杂质化合物， 并提供其制备方法和检测方法。 本发明所制备的杂 质化合物， 作为杂质对照品， 可用于该醋酸乌利司他原料药及其制。
11、剂的质量分析， 同时也可 以为工艺条件的选择提供参考， 有利于生产过程中药品质量的控制。 0011 本发明技术方案如下： 0012 本发明提供一种化合物或其盐， 所述化合物的结构如下式化合物F或者化合物K所 说明书 2/21 页 4 CN 105566431 B 4 示： 0013 0014 0015 上述所述的化合物或其盐， 其中所述盐为无机酸盐或有机酸盐。 0016 作为本发明另一目的， 还提供一种上述所述化合物或其盐的制备方法， 其包括从 由3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应产物中经分离制备得到所述化合 物F或化合物K的步骤。 优选地， 所述的由3,20-双缩酮(中。
12、间体VI)制备得到醋酸乌利司他的 反应过程如下： 说明书 3/21 页 5 CN 105566431 B 5 0017 0018 上述所述的制备方法， 其中： 0019 所述环氧化反应为： 0020 0021 例如， 化合物VI溶于二氯甲烷中， 碱性条件下， 加入氧化剂和全卤代丙酮室温下反 应。 优选地， 所述碱选自吡啶， 磷酸氢二钾， 磷酸二氢钾， 磷酸氢二钠， 磷酸二氢钠等； 氧化剂 选自双氧水， 间氯过氧苯甲酸等， 优选双氧水； 反应温度-10-10。 0022 所述的格氏试剂反应为： 0023 0024 例如， 在THF， 氯化亚铜催化下与4-(N,N一二甲基氨基)苯基溴化镁格氏试剂进。
13、行 加成； 优选地， 反应原料与格氏试剂摩尔比1:1.5-5， 反应温度-10-40， 反应时间2-8h。 0025 所述的水解反应为： 说明书 4/21 页 6 CN 105566431 B 6 0026 0027 例如， 在二氯甲烷和稀酸中搅拌下进行水解反应， 优选地， 酸选自盐酸、 硫酸、 硫酸 氢钠等无机酸， 优选为0.2-4N HCl溶液， 反应温度-10-50， 反应时间1-5h。 0028 所述的乙酰化反应为： 0029 0030 例如， 用冰醋酸、 高氯酸或醋酐中任一种或者两种以上的酰化剂下进行酰化反应， 优选高氯酸和醋酐中加入冰醋酸； 反应温度-40-25， 优选-10-25。
14、； 冰醋酸的量占冰醋 酸、 高氯酸、 醋酐构成的乙酰化试剂体积的1-50V/V， 优选10-15V/V。 0031 作为本发明另一实施方式， 还提供另一种上述所述化合物或其盐的制备方法， 其 包括从由3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应产物中经分离制备得到所 述化合物F或化合物K的步骤。 3,20-双缩酮(中间体VI)制备得到醋酸乌利司他的反应， 例如 可以参见现有技术CN102516345B公开的可工业化生产醋酸乌利司他的方法。 0032 上述所述的制备方法， 其中所述的分离制备为制备高压液相色谱分离； 优选地， 所 述的制备高压液相色谱条件为： 固定相为C18反相填料，。
15、 流动相为三乙胺磷酸溶液乙腈梯 度洗脱， 检测波长为302nm。 0033 优选地， 上述所述的制备方法， 优选从醋酸乌利司他重结晶所得到的重结晶母液 中分离制备得到所述的化合物F或化合物K。 0034 作为本发明另一目的， 还提供一种上述所述化合物或其盐或者化合物D或E的检测 方法， 其中： 说明书 5/21 页 7 CN 105566431 B 7 0035 0036 0037 其中所述方法为HPLC法或者HPLC-MS法； 0038 优选地， 所述的HPLC法的检测条件为： 固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 流动相为三乙胺磷酸溶液乙腈梯度洗脱， 检测波长为302nm； 优选地， 流。
16、动相为pH2.5 3.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈， 体积比为30 7050 50； 更优选地， 流动相为pH3.0的三乙胺 磷酸溶液-乙腈， 体积比为40 60； 0039 优选地， 所述的HPLC-MS法的检测条件为： HPLC的色谱条件为固定相以十八烷基硅 烷键合硅胶为填充剂， 流动相为乙腈： 0.1甲酸水50： 50， MS的条件为采用选择性离子检 测法， 检测化合物D母离子M+H+m/z 462.2， 化合物E母离子M+H+m/z 434.0， 化合物F母离 子M+H+m/z 518.2， 或者化合物K母离子M+H+m/z 492.3。 0040 作为本发明另一目的， 还提供上述所述化合。
17、物或其盐在醋酸乌利司他原料药或者 制剂的有关物质检测中作为杂质对照品的用途。 0041 作为本发明另一目的， 还提供一种醋酸乌利司他原料药或者制剂的质量检测方 法， 其包括测定其中有关物质的步骤， 所述的有关物质选自上述所述的化合物F、 K、 D或者E， 其特征在于所述的测定采用HPLC法或者HPLC-MS法检测； 优选地， 所述的HPLC法或者HPLC- MS法如上述所述； 更优选地， 所述的检测采用HPLC法检测； 更优选地， 所述的HPLC法的检测 条件为： 固定相为十八烷基硅烷键合硅胶， 流动相为体积比为30 7050 50的pH2.53.5 的三乙胺磷酸溶液-乙腈， 检测波长为DAD。
18、(二极管阵列检测器)302nm， 理论板数按醋酸乌利 司他峰计算应不小于2000； 更优选地， 所述的有关物质检测中， 供试品溶液的色谱图中如有 杂质峰， 以峰面积计算， 与各杂质相对应的峰各不得大于杂质对照品溶液的0.15倍(即杂质 含量不超过0.15)。 0042 上述所述的用途， 其中所述的检测采用HPLC法或者HPLC-MS法检测； 优选地， 所述 说明书 6/21 页 8 CN 105566431 B 8 的检测采用HPLC法检测； 更优选地， 所述的HPLC法检测条件为： 固定相为十八烷基硅烷键合 硅胶， 流动相为体积比为30 7050 50的pH2.53.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈。
19、， 更优选流动 相为0.2三乙胺(磷酸调pH 3.0)缓冲液： 乙腈40:60， 检测波长为DAD(二极管阵列检测 器)302nm， 理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000； 更优选地， 所述的有关物质检测 中， 供试品溶液的色谱图中如有杂质峰， 以峰面积计算， 与各杂质相对应的峰各不得大于杂 质对照品溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15)。 总杂质含量不得超过1.0。 0043 作为本发明一个具体实施方式， 上述所述的杂质化合物D、 E、 F或K具体可通过以下 方法制备得到。 0044 1、 醋酸乌利司他的制备过程 0045 将3,20-双缩酮(化合物VI 1mo1)， 二氯甲烷。
20、， 吡啶、 三水六氟丙酮， 冷却至-10-0 ， 滴加50双氧水， 于-5-5反应2-3h， 分出有机相， 水相用二氯甲烷萃取两次合并， 用 10硫代硫酸钠水溶液洗涤， 有机相水洗两次， 无水硫酸镁干燥， 过滤， 减压浓缩至恒重。 0046 将Mg(1.6mo1)， 1,2一二溴乙烷和THF加入三口烧瓶， 滴加4-溴-N,N-二甲基苯胺和 THF， 加热引发反应后回流滴加， 加毕， 于50-60搅拌反应3h得到格氏试剂， 冷却至25， 加 入氯化亚铜， 25搅拌30分钟后， 冷却下滴加上述环氧化物的二氯甲烷溶液， 保持温度10- 20， 加毕保温搅拌2h， 倒入冰的饱和NH4Cl水溶液中， 搅。
21、拌10分钟， 分出有机相， 水相用二 氯甲烷萃取， 有机相合并， 加入2N HCl溶液。 于25下搅拌2h， 分出有机相， 水相用二氯甲烷 萃取， 合并， 依次用饱和碳酸氢钠水溶液， 水各洗一次， 无水硫酸镁干燥， 过滤， 滤液转入反 应瓶中， 加入冰醋酸(1.25mol)， 冷却至-10-0， 加入70高氯酸(1.18mo1)， 然后搅拌下 于-10-0滴加醋酐(5.96mo1)， 保温搅拌30分钟后， 水相用二氯甲烷萃取， 合并， 依次用饱 和碳酸氢钠水溶液， 水各洗一次， 无水硫酸镁干燥， 过滤， 减压浓缩至干约110g， 经用10倍量 异丙醇:乙醇(95:5)重结晶得到浅黄色结晶244。
22、.8g， 重结晶母液浓缩干得固体， 待用。 产物 再次用异丙醇:乙醇(95:5)重结晶， 60烘干得到浅黄色结晶的产物， 重结晶母液浓缩干得 固体， 待用。 0047 上述所得的醋酸乌利司他经LC-MS分析， 含有多个杂质， 其中包括杂质F(即化合物 F)和杂质K(即化合物K)的MS检测结果为： 杂质A： M+H+397.16， 杂质B： M+H+415.1， 杂质C： M+H+373.1， 杂质D： M+H+462.2， 杂质E： M+H+434.0， 杂质F： M+H+518.2， 杂质G： M+H+ 476.2， 杂质H： M+H+441.2， 杂质I： M+H+516.2， 杂质J： 。
23、M+H+474.2， 杂质K： M+H+492.3。 0048 所用的LC-MS条件为： 0049 HPLC： 流动相为乙腈 0.1甲酸水50 50 0050 柱温2535 0051 流速0.3ml/min 0052 检测波长302nm 0053 色谱柱:Agilent Poroshe11120EC-C18 2.7um 4.6X 50mm 0054 MS： 条件 0055 ESI， fg25， MS2scan。 0056 2、 杂质D、 E、 F、 K的制备过程 0057 经HPLC分析， 醋酸乌利司他成品中杂质的含量低于0.1， 但经对合成过程中的母 液进行分析， 其中杂质的含量较高， 故采。
24、用从合成过程中处理过的母液中制备分离杂质。 说明书 7/21 页 9 CN 105566431 B 9 0058 将醋酸乌利司他的制备过程中所得重结晶母液浓缩至干得到固体， 此固体中含较 高比例杂质， 将此固体经高压制备液相纯化、 处理可得到高纯的的杂质对照品， 具体操作如 下: 0059 纯化条件: 0060 0061 梯度洗脱比例: 0062 0063 0064 具体操作步骤: 0065 将母液浓缩至干得到固体， 取约1g， 用40乙腈/水溶解， 上柱， 梯度洗脱， 根据出 峰情况， 分段收集洗脱液， 每次纯化完成后， 纯化柱用5乙腈水溶液重新平衡后， 可重复进 样纯化。 将多批次纯化得到。
25、的含各组份纯度98的洗脱液分别合并。 浓缩除去大部分乙 腈， 水层用乙酸乙酯提取， 浓缩乙酸乙酯至干， 分别得到杂质固体。 每批次纯化可得杂质A约 为5mg， 杂质B约为10mg， 杂质C约为5mg， 杂质D约为15mg， 杂质E约为5mg， 杂质F约为5mg， 杂质 G约为5mg， 杂质H约为15mg， 杂质I约为5mg， 杂质J约为10mg， 杂质K约为5mg。 0066 上述纯化过程中的分析检测条件为: 0067 流动相为pH3.0三乙胺磷酸缓冲液 乙腈40 60 0068 检测波长302nm 0069 柱温:30 0070 流速1.0mL/min 0071 作为本发明一个具体实施方式，。
26、 还提供了杂质F、 K在醋酸乌利司他原料及其制剂 产品质量检测方法中的用途。 优选用HPLC和/或HPLC-MS检测杂质F或K及其含量。 0072 更优选地， 所述HPLC所采用的条件为， 0073 流动相： pH2.53.5的三乙胺磷酸溶液-乙腈， 体积比为30 7050 50； 其中pH2.5 3.5的三乙胺磷酸溶液是由三乙胺-磷酸缓冲对组成， 1000份水加13份三乙胺得到三乙 胺溶液， 以磷酸调节pH为2.53.5； 0074 流速:0.81.2mL/min(优选流速1.0mL/min)； 说明书 8/21 页 10 CN 105566431 B 10 0075 柱温:2535摄氏度，。
27、 优选30； 0076 检测波长:采用多波长检测， 分别选择各杂质的最大吸收波长进行有关物质检测、 验证。 醋酸乌利司他： 303nm； 杂质A： 259nm； 杂质B： 234nm； 杂质C： 241nm； 杂质D： 303nm； 杂质 E： 304nm； 杂质F： 328nm； 杂质G： 253nm； 杂质H： 262nm； 杂质I： 256nm； 杂质J： 261nm； 杂质K： 299nm。 0077 固定相： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 0078 更一步优选的， 所述HPLC-MS所采用的条件为： 0079 色谱条件为:流动相:0.050.5HAc/水:乙腈(7580):(252。
28、0)； 优选 0.1HAc/水， 与乙腈比例优选78:22 0080 流速： 0.10.5ml/min， 优选0.3ml/min； 柱温： 2040， 优选30 0081 质谱条件为:采用选择性离子监测(SIM)法 0082 干燥气温度:300400， 优选350 0083 载气流速:812L/min， 优选10L/min 0084 雾化气压力:3050psi， 优选40psi 0085 毛细管电压:4000V 0086 作为本发明一个优选实施方式， 提供了上述杂质F或K作为杂质对照品在醋酸乌利 司他及其制剂的有关物质检查的质量分析中的应用， 其中所述的醋酸乌利司他及其杂质的 检测方法优选为H。
29、PLC法， HPLC检测条件如下： 0087 固定相:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 0088 流动相： pH3.0的三乙胺磷酸溶液乙腈， 体积比为40 60； 其中pH3.0的三乙胺磷 酸溶液是由三乙胺-磷酸缓冲对组成， 1000份水加2份三乙胺， 以磷酸调节pH为3.0； 0089 流速:0.81.2mL/min(优选流速1.0mL/min)； 0090 柱温:2535摄氏度， 优选30； 0091 检测波长:优选302nm。 0092 理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000 0093 检测波长:紫外扫描显示， 各杂质及主成分最大吸收波长如下： 0094 醋酸乌利司他： 303nm；。
30、 杂质A： 259nm； 杂质B： 234nm； 杂质C： 241nm； 杂质D： 303nm； 杂 质E： 304nm； 杂质F： 328nm； 杂质G： 253nm； 杂质H： 262nm； 杂质I： 256nm； 杂质J： 261nm； 杂质K： 299nm， 综合考虑， 采用多波长检测， 分别选择各杂质的最大吸收波长进行有关物质检测、 验 证。 0095 实验操作: 0096 分别称取醋酸乌利司他对照品及杂质A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J、 K对照品各适量， 加 流动相溶解并稀释制成每1ml中分别含醋酸乌利司他、 杂质A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 。
31、H、 I、 J、 K各约 20ug的混合溶液， 作为系统适用性试验溶液。 精密量取系统适用性试验溶液10ul注入液相 色谱仪， 记录色谱图， 醋酸乌利司他及各杂质峰相互间的分离度应符合要求， 理论板数按醋 酸乌利司他峰计算应不小于2000。 0097 测定法 0098 精密称取本品10mg， 置20ml量瓶中， 用流动相溶解， 并稀释至刻度， 摇匀， 作为供试 品溶液。 精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中， 用流动相稀释至刻度， 摇匀， 作为对照溶 说明书 9/21 页 11 CN 105566431 B 11 液。 量取对照溶液10 l， 注入液相色谱仪， 调节检测灵敏度使主成分色谱。
32、峰的峰高为满量程 的10-20。 再精密量取供试品溶液10 l， 注入液相色谱仪， 记录色谱图至主成分峰保留时 间的3倍。 0099 各杂质重点研究检测波长： 0100 波长杂质 302nm杂质D、 E、 F、 K 237nm杂质B、 C 258nm杂质A、 G、 H、 I、 J 0101 供试品溶液的色谱图中如有杂质峰， 以峰面积计算， 与各杂质相对应的峰各不得 大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15)； 其他任一单个杂质峰均不得大于对照 溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15)， 总杂质不得超过1.0(即总杂质含量不得超过 1.0)， 小于对照溶液主峰面积0.05倍(即含量。
33、小于0.05)的峰忽略不计。 0102 本发明提供的上述醋酸乌利司他有关物质的检测的方法的优点是测定结果准确 可靠， 专属性强， 实用性强， 各杂质能有效检出， 且醋酸乌利司他及各杂质间均达到良好分 离， 采用该系统可检测多种杂质。 0103 上述方法同样适用醋酸乌利司他制剂的有关物质分析。 附图说明: 0104 图1： 醋酸乌利司他及杂质分离度图谱 0105 图2： 醋酸乌利司他检测图谱 0106 图3： 杂质D的HPLC测定线性关系图 0107 图4： 杂质E的HPLC测定线性关系图 0108 图5： 杂质F的HPLC测定线性关系图 0109 图6： 杂质K的HPLC测定线性关系图 具体实。
34、施方式 0110 实施例1： 醋酸乌利司他的制备 0111 将3,20-双缩酮(100g,0.25mo1)， 二氯甲烷(1L)， 吡啶(5m1)、 三水六氟丙酮(20m1, 143mmol)， 冷却至-10-0， 滴加50双氧水(70ml,1.44mol)， 于-5-5反应2-3h原料消失 后， 分出有机相， 水相用二氯甲烷萃取两次合并， 用10硫代硫酸钠水溶液(10m1)洗涤一 次， 有机相水洗两次(50m1*2)， 无水硫酸镁干燥， 过滤， 减压浓缩至恒重约200m1。 0112 将Mg(9.6g， 0.4mo1)， 1,2-二溴乙烷(1ml)和THF(50m1)加入三口烧瓶， 滴加4-溴。
35、- N,N-二甲基苯胺(71g,0.35mo1)和THF(200m1)溶液， 加热引发反应后保持回流下滴加， 加 毕， 于50-60搅拌反应3h得到格氏试剂， 冷却至25， 加入氯化亚铜(3g,30mmol)， 25搅 拌30分钟后， 冷却下滴加上述环氧化物的二氯甲烷溶液， 保持温度10-20， 加毕保温搅拌 2h， 倒入冰的500m1饱和的NH4Cl水溶液中， 搅拌10分钟， 分出有机相， 水相用二氯甲烷萃取 400m1*5次， 有机相合并， 加入1000m12N HCl溶液。 于25下搅拌2h， 分出有机相， 水相用二 氯甲烷萃取200m1*3， 合并有机相， 依次用饱和碳酸氢钠水溶液， 。
36、水各洗一次， 无水硫酸镁干 说明书 10/21 页 12 CN 105566431 B 12 燥， 过滤， 滤液转入反应瓶中， 加入冰醋酸(18m1,315mmol)， 冷却至-100， 加入70高氯 酸(24m1,295mmo1)， 然后搅拌下于-100滴加醋酐(140m1,l.49mo1)， 保温搅拌30分钟 后， 水相用二氯甲烷萃取两次200m1*3， 合并， 依次用饱和碳酸氢钠水溶液， 水各洗一次， 无 水硫酸镁干燥， 过滤， 减压浓缩至干约110g， 经用10倍量异丙醇:乙醇(95:5)重结晶得到浅 黄色结晶61.2g， 重结晶母液浓缩干得固体， 待用。 产物再次用异丙醇:乙醇(95。
37、:5)重结晶， 60烘干得到浅黄色结晶的产物， 重结晶母液浓缩干得固体， 待用。 0113 实施例2： 杂质化合物的制备 0114 将醋酸乌利司他的制备过程中所得重结晶母液浓缩至干得到固体， 此固体中含较 高比例杂质， 将此固体经高压制备液相纯化、 处理可得到高纯的的杂质对照品， 0115 具体操作如下: 0116 纯化条件: 0117 0118 梯度洗脱比例: 0119 时间(分)AB 09010 304060 604060 0120 具体操作步骤: 0121 将母液浓缩至干得到固体， 取约1g， 用40乙腈/水溶解， 上柱， 梯度洗脱， 根据出 峰情况， 分段收集洗脱液， 每次纯化完成后，。
38、 纯化柱用5乙腈水溶液重新平衡后， 可重复进 样纯化。 将多批次纯化得到的含各组份纯度98的洗脱液分别合并。 浓缩除去大部分乙 腈， 水层用乙酸乙酯提取， 浓缩乙酸乙酯至干， 分别得到杂质固体。 每批次纯化可得杂质A约 为5mg， 杂质B约为10mg， 杂质C约为5mg， 杂质D约为15mg， 杂质E约为5mg， 杂质F约为5mg， 杂质 G约为5mg， 杂质H约为15mg， 杂质I约为5mg， 杂质J约为10mg， 杂质K约为5mg。 其中杂质D和E为 已知化合物。 其中， 所得新化合物杂质F(即化合物F)、 K(即化合物K)的结构以及已知化合物 杂质D和E的结构， 分别为： 说明书 11/。
39、21 页 13 CN 105566431 B 13 0122 说明书 12/21 页 14 CN 105566431 B 14 0123 0124 所述杂质F， 分子式： C32H39NO5 0125 分子量： 517.67 0126 化学名： 3,17 -二乙酰氧基-11 -(4-N,N-二甲基氨基苯基)-19-去甲孕甾-3,5 (10),9(11)-三烯-20-酮 0127 MS： 518.27M+H+， 540.26M+Na+ 0128 仪器型号： BRUKER AV-500型核磁共振仪 0129 杂质F的1H-NMR谱、 13C-NMR谱、 DEPT谱、 COSY谱、 HSQC谱和HM。
40、BC谱归属如下表所示 0130 说明书 13/21 页 15 CN 105566431 B 15 0131 0132 说明书 14/21 页 16 CN 105566431 B 16 0133 0134 所述杂质K， 分子式： C30H37NO5 0135 分子量： 491.63 0136 化学名： 17 -乙酰氧基-11 -(4-N,N-二甲基氨基苯基)-19-去甲孕甾-4,9(11)-二 烯-3,20-二酮-N-氧化物 0137 MS： 475.30M+H-OH+， 492.30M+H+， 514.27M+Na+ 0138 仪器型号： BRUKER AV-500型核磁共振仪 0139 杂质。
41、K的1H-NMR谱、 13C-NMR谱、 DEPT谱、 COSY谱、 HSQC谱和HMBC谱归属如下表所示 0140 说明书 15/21 页 17 CN 105566431 B 17 0141 0142 说明书 16/21 页 18 CN 105566431 B 18 0143 0144 实施例3： 醋酸乌利司他及其杂质的检测方法 0145 醋酸乌利司他有关物质的检测的方法采用液相色谱检测， HPLC检测条件如下: 0146 固定相： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 0147 流动相： 0.2三乙胺(磷酸调pH 3.0)缓冲液： 乙腈40:60 说明书 17/21 页 19 CN 105566。
42、431 B 19 0148 检测波长： DAD 302nm、 258nm、 237nm 0149 流速： 1.0ml/min； 0150 柱温： 25 0151 实验操作： 0152 分别称取醋酸乌利司他对照品及各杂质对照品各适量， 加流动相溶解并稀释制成 每1ml中分别含醋酸乌利司他、 各杂质各约20u g的混合溶液， 作为系统适用性试验溶液。 精 密量取系统适用性试验溶液10ul注入液相色谱仪， 记录色谱图(如图1所示)， 醋酸乌利司他 及各杂质峰相互间的分离度应符合要求， 理论板数按醋酸乌利司他峰计算应不小于2000。 0153 测定法: 0154 精密称取醋酸乌利司他10mg， 置20。
43、ml量瓶中， 用流动相溶解， 并稀释至刻度， 摇匀， 作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中， 用流动相稀释至刻度， 摇匀， 作 为对照溶液。 量取对照溶液10 l， 注入液相色谱仪， 调节检测灵敏度使主成分色谱峰的峰高 为满量程的10-20。 再精密量取供试品溶液10 l， 注入液相色谱仪， 记录色谱图至主成分 峰保留时间的3倍， 色谱图如图2所示。 0155 各杂质重点研究检测波长： 0156 波长杂质 302nm杂质D、 E、 F、 K 237nm杂质B、 C 258nm杂质A、 G、 H、 I、 J 0157 供试品溶液的色谱图中如有杂质峰， 以峰面积计算， 与各。
44、杂质相对应的峰各不得 大于对照溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15)； 其他任一单个杂质峰均不得大于对照 溶液的0.15倍(即杂质含量不超过0.15)， 总杂质不得超过1.0倍(即总杂质含量不超过 1.0)， 小于对照溶液主峰面积0.05倍(即含量小于0.05)的峰忽略不计。 0158 方法学验证： 0159 杂质测定方法学验证结果如下： 说明书 18/21 页 20 CN 105566431 B 20 0160 说明书 19/21 页 21 CN 105566431 B 21 0161 说明书 20/21 页 22 CN 105566431 B 22 0162 说明书 21/21 页 23 CN 105566431 B 23 图1 说明书附图 1/4 页 24 CN 105566431 B 24 图2 说明书附图 2/4 页 25 CN 105566431 B 25 图3 图4 图5 说明书附图 3/4 页 26 CN 105566431 B 26 图6 说明书附图 4/4 页 27 CN 105566431 B 27 。