预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210269249.3	申请日：	2012.08.01
公开号：	CN102936285A	公开日：	2013.02.20
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C07K 16/12申请公布日:20130220\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/12申请日:20120801\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K16/12; C07K16/02; A61K39/40; A61P31/04	主分类号：	C07K16/12
申请人：	无锡贝瑞康生物科技有限公司
发明人：	刘海燕; 宋学宏; 包光明; 郭培红; 张志华; 刘金龙
地址：	214028 江苏省无锡市无锡新区新泰路江苏国际技术转移中心综合楼1323室
优先权：
专利代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司 32224	代理人：	董建林
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内容摘要

本发明公开了一种预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用，抗体的制备方法：将保藏编号为CCTCCNO:M2012024的鮰爱德华氏菌（Edwardsiellaictaluri）灭活后分次接种产蛋禽，获得含抗鮰爱德华氏菌的抗体的免疫蛋；上述抗体可应用在预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。本发明的特点在于：该抗体特异性高、无毒、无残留、无耐药性、无生物安全隐患；制备该抗体的方法简单、较为快速；尤其是该抗体可以制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂或全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，大大降低了劳动强度。

权利要求书

权利要求书预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，上述免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌的抗体。
根据权利要求1所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，上述鮰爱德华氏菌为保藏编号为CCTCC NO:M2012024的菌株。
根据权利要求2所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，上述灭活剂为甲醛。
预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，利用权利要求1所述的方法制得。
根据权利要求4所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，上述爱德华氏菌为保藏编号为CCTCC NO:M2012024的菌株。
权利要求4所述的抗体在制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中的应用。
根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用新鲜的免疫蛋经海藻糖微包膜后喷雾干燥制成含有上述抗体的粉剂，上述粉剂作为饲料添加剂直接投喂。
根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用水做辅料，将上述抗体制成水剂全池泼洒。

说明书

说明书预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种用于预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
黄颡鱼、鮰鱼、鲶鱼等无鳞鱼是我国优质的名贵淡水鱼类，这些鱼类不仅肉质鲜嫩、少肌间刺，而且营养价值高，深受广大消费者的喜爱。然而近年来，各地的黄颡鱼、美国叉尾鮰、鲶鱼的养殖区暴发一种流行病，其主要症状为：鳍条基部、口腔、下颌、鳃盖、眼眶充血，头顶正中部位皮下发红，严重时头骨裂开，在头顶部出现一条狭长的溃烂出血带，呈现典型的“红头病”症状。该种疾病具有传染性强、死亡率高等特点，已成为制约无鳞鱼尤其是黄颡鱼养殖业的健康发展的瓶颈问题。目前各养殖区采取的应对方法主要是使用广谱抗菌素，然而该种方法不仅会增加治疗成本，而且还会带来耐药性的产生及鱼体内残留抗生素的超标等诸多问题。因此，寻找一种特异性高又无残留的抗红头病抗生素替代品成为黄颡鱼养殖业亟需解决的问题。
从免疫学角度出发，制备特异性的抗病原菌的抗体，是防病治病的可持续发展思路。目前，公开号为CN101829321A的专利文献已公开了制备抗黄颡鱼红头病疫苗的方法：用福尔马林灭活菌苗得到安全可靠的疫苗，通过浸泡和注射的方式给药，免疫保护达70%‑95%。然而这种疫苗在规模化养殖中使用有一定的局限性：①劳动强度大；②受免鱼容易受伤，造成继发性疾病；③预防工作要提前做好，对于病鱼无治疗作用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种使用方便、不会损伤鱼类、既可以预防又可以治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK‑ADHSJ）分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，前述免疫蛋中含有抗爱德华氏菌的抗体。
前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，前述鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ为保藏编号为CCTCC NO:M2012024的菌株。
前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，前述灭活剂为甲醛。
预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，利用如下的方法制得：用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，前述免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体。
前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，前述鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ为保藏编号为CCTCC NO:M2012024的菌株。
前述的抗体应用在制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。
前述的应用，其特征在于，用新鲜的免疫蛋经海藻糖微包膜后喷雾干燥制成含有前述抗体的粉剂，前述粉剂作为饲料添加剂或者预配料直接投喂。
前述的应用，其特征在于，用水做辅料，将前述抗体制成水剂或者专用的浸浴剂使用。
本发明的有益之处在于：预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体特异性高、无毒、无残留、无耐药性、无生物安全隐患；制备该抗体的方法工业化程度高，效率高；将该抗体应用到制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中，与广谱抗生素的使用不同，使用含有该抗体的药物不会改变病鱼的免疫状态，使用抗体后病鱼的免疫系统依然能够对其他外源侵害做出有效的反应；该抗体不仅可以制成水剂或者专用的浸浴剂使用，尤其可以制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂或全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，大大降低了劳动强度。
附图说明
图1是保藏编号为CCTCC NO:M2012024的菌株16S rRNA 基因序列与鮰爱德华氏菌标准菌株(AB453281.1、EU285522.1、EF015475.1)的16S rRNA 基因序列比对图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，包括如下步骤：①分离纯化病原菌；②确定该分离纯化所得病原菌为鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK‑ADHSJ）；③获取含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋。
第一步：分离纯化黄颡鱼“红头病”病原菌
1、材料：试验病鱼为具典型“红头病”症状的黄颡鱼，采自于浙江湖州某养殖场。
2、方法：首先，取活的具典型症状的病鱼，用无菌生理盐水冲洗体表2次，用接种环于肝脏、肾脏和头部发红部位的脑组织取样。然后，在TSA、普通营养琼脂培养基上进行平板划线，28℃恒温培养48h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离培养3次，再接种于TSB液体培养基上继续扩大培养。最后，菌液加甘油于‑80℃保存，作为试验用菌株待用。
第二步：确定第一步分离纯化所得病原菌为鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ
实施例一：人工感染试验
1、材料：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为35±5g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂养，试验水体经连续充氧循环过滤，使用自动控温仪控制试验水温(28±1)℃，暂养期间不投饵。
2、方法：黄颡鱼暂养5天后开展人工感染试验。取‑80℃保存的试验用菌株，接种在TSA平板上，28℃培养48 h。无菌生理盐水冲洗下培养物并倍比稀释成不同浓度的菌悬液。肌肉注射暂养稳定后的试验鱼，每尾注射0.2 mL，对照组注射等量生理盐水，每试验浓度组设置重复组。试验鱼放置于20 L的水族缸，每缸放养10尾，内循环过滤处理氨氮、亚硝酸盐及增氧，控温仪自动控温在28℃，每天观察、记录试验鱼死亡情况，及时取出死鱼，连续观察14 天。人工感染的结果见表1：
表1 分离到的菌株人工感染120h后的试验结果菌液浓度/CFU·Ml‑1攻毒剂量/mL 试验鱼数/尾死亡数/尾 2.5×1090.2 10 10 2.5×1080.2 10 10 2.5×1070.2 10 10 2.5×1060.2 10 8 2.5×1050.2 10 7 生理盐水 0.2 10 1 空白对照 0 10 0
试验结果显示，肌肉注射细菌悬液的人工感染方法能使健康的黄颡鱼发病，且人工感染症状与“红头病”自然发病症状相似，即病鱼鳍条基部、上下颌、鳃盖、腹部出血，头顶皮肤颜色变浅、发红，肛门及生殖孔充血、出血、外突，腹腔膨大有腹水等；当菌液浓度达到2.0×107CFU/ml时，死亡率达100%。
实施例一证实了：第一步中得到的试验用菌株为黄颡鱼“红头病”的病原菌。
对感染组出现“红头病”典型症状的鱼体，按照第一步叙述的方法分离、纯化病原菌，得到的病原菌菌落特征与第一步分离到的菌株的菌落特征一致，说明从人工感染的病鱼中分离到的菌株与试验用菌株为同一菌株，均是黄颡鱼“红头病”的病原菌。
实施例二：试验用菌株的菌体形态显微观察
1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。
2、方法：取第一步分离纯化得到的试验用菌株，划线接种于普通营养琼脂、TSA平板，28℃培养48h，制备细菌悬液。进行细菌形态观察与革兰氏染色液染色。实验结果显示，该菌株在普通营养琼脂、TSA平板培养基上能形成圆形光滑、隆起、湿润并带有光泽、呈半透明状的小菌落。革兰氏染色呈阴性，短杆状，长约2µm，直径约0.5µm，无荚膜，不形成芽孢，个体之间两两纵向连接。
实施例三：试验用菌株的生理生化鉴定
1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。
2、测定项目及结果：参见表2
表2  试验用菌株的生化特性测定项目结果测定项目结果氧化/发酵 F H2S ‑ 鸟氨酸脱羧酶ODC ‑ 吲哚产生IND ‑ 精氨酸双解酶ADH ‑ N‑乙酰‑β葡萄糖甙βNAG ‑ 赖氨酸脱羧酶LDC ‑ Β半乳糖苷酶βGAL ‑ 脲酶URE ‑ D‑葡萄糖GLU ‑ L‑阿拉伯醇LARL ‑ D‑蔗糖SAC ‑ 半乳糖酸盐GAT ‑ L‑阿拉伯糖LARA ‑ 5‑酮基‑葡萄糖酸5KG ‑ D‑阿拉伯醇DARL ‑ 丙酮酸钠RP + α半乳糖苷酶αGAL ‑ β葡萄糖甙βGLU ‑ D‑海藻糖TRE ‑ D‑甘露醇MAN ‑ L‑鼠李糖RHA ‑ D‑麦芽糖MAL ‑ 肌醇INO ‑ 侧金盏花醇ADO ‑ D‑纤维二糖CEL ‑ 古老糖PLE ‑ D‑山梨醇SOR ‑ β葡萄糖苷酶βGUR ‑ 麦芽糖苷酶αMAL ‑
表2的测定结果显示：该试验用菌株的主要特征为接触酶阳性，氧化酶阴性，发酵型。
结合实施例一、二、三所显示的试验用菌株的病理变化、形态特征、培养特性和生理生化特性，可以初步鉴定该分离纯化所得试验用菌株为鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ。
实施例四：试验用菌株的16S rRNA 基因的特异性扩增鉴定
1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株；
引物，序列如下：
N1：5’ 一ACAGTITGATCCTGGCTCAG 一3’
N2：5’ 一CGCTACCTrGTTACGACTT 一3’
通用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
2、方法：取第一步分离纯化得到的试验用菌株在TSA平板上划线，28℃培养48h后挑取一环培养物，加入50 µL无菌水，吹吸混匀后，10000 r/min离心1 min，去上清，再加入50 µL无菌水，吹吸混匀后，沸水浴10 min，12000 r/min离心5 min，取1µL上清液用于 PCR扩增。
扩增反应体积为60 µL，分别加入10×PCR缓冲液6 µL，引物各1µL，dNTP 2µL，Taq酶0.5 µL，无菌水补足反应体积。
PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行30个循环，最后72℃延伸7 min结束反应。
取6 µL反应液在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，产物用胶回收试剂盒回收，进行DNA测序。测序工作由上海英骏生物技术有限公司协助完成。
将测得的试验用菌株16S rRNA 基因序列输入到NCBI数据库中进行Blast比对，对其基因核苷酸序列的同源性分析发现与鮰爱德华氏菌标准菌株(AB453281.1、EU285522.1、EF015475.1)的保守性片段有100％的同源性，参见图1。
结合形态学和生理生化特性，可以将所分离得到的试验用菌株进一步确定为鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK‑ADHSJ）。
实施例五：试验用菌株的药物敏感试验
1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。
2、方法：将第一步分离纯化得到的试验用菌株在TSB液体培养基上扩大培养，28 ℃培养48 h后，将液体培养物涂布于TSA平板上，适当干燥后贴药敏纸片，28 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径，按药敏纸片产品说明书判定药物的敏感度。药物敏感试验结果见表3
表3  药物敏感性试验结果药品名敏感性药品名敏感性庆大霉素 Gentamycin R 利福平 Rifampicin I 环丙沙星 Ciprofloxacin S 红霉素 Erythromycin R 复方新诺明 Cotrimoxazole S 新霉素 Neomycin S 左氧氟沙星 Ofloxacin S 链霉素 Streptomycin R 卡那霉素 Kanamycin R 氟哌酸 Norfloxacin I 头孢拉定 Ceftazidime S 洛美沙星 Ciprofloxzcin S 阿莫西林 Amoxicillin R 头孢噻吩 Cefalothin I 氨苄青霉素 Ampicillin S 先锋IV Cefalexin S 林可霉素 Lincomycin R 菌必治 Rocephin S 依诺沙星 Enoxacin S 妥布霉素 Tobramycin R 呋喃唑酮 Furazolidone S 强力霉素 Doxycycline S
注：S 敏感 sensitive；R 耐药 resistant；I 中度敏感 mid‑sensitive.
试验结果表明，该菌株对环丙沙星、复方新诺明、左氧氟沙星、头孢拉定、氨苄青霉素、依诺沙星、呋喃唑酮、新霉素、洛美沙星、先锋Ⅳ、菌必治、强力霉素敏感；对试验药物中的庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林、林可霉素、红霉素、链霉素、妥布霉素不敏感；对利福平、氟哌酸、头孢噻吩中度敏感。该菌株对抗生素的敏感特征与鮰爱德华氏菌标准菌株相似。
综合以上五个实施例的试验结果，可以确定从自然发病的“红头病”黄颡鱼中分离纯化所得的试验用菌株为鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ。因“红头病”是由鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ引起的，所以此病又叫做鮰爱德华氏菌病。
申请人于2012年2月19日将从自然发病的“红头病”黄颡鱼中分离纯化所得的试验用菌株鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO: M 2012024。
第三步：获取含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋
首先，制备灭活的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌苗。具体操作如下：
在无菌条件下，取‑80℃条件下保存的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌种，用接种环从菌种管中挑取少量细菌接种到10 mlTSB肉汤中，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中，28 ℃振荡培养24 h。
把复苏培养的菌液10 ml再次接种至500 mlTSB肉汤中，接种后的肉汤于水浴振荡器中28℃继续振荡培养48h。将次级培养的TSB肉汤均匀涂布在制备好的TSA平板上，将涂布好的TSA平板放入28℃恒温培养箱中，培养48h，直至细菌菌苔长满整个平板。用灭过菌的生理盐水无菌操作冲洗平板上生长的菌苔，将洗下的菌悬液置于灭过菌的输液瓶中。
将从平板上洗脱的菌液按每10 ml菌液接种到200 mlTSB肉汤培养基的比例，进行菌液的扩大培养。28 ℃条件下振荡培养48 h，从而得到高浓度细菌悬液。对扩大培养得到的高浓度细菌悬液，按体积比例添加5‑6‰的甲醛，放入水浴振荡器中，28 ℃振荡48 h灭活。
将灭活完全的菌苗，无菌操作分装于500 ml灭菌高温瓶中，并进行石蜡封闭。分装好的灭活菌苗置于4 ℃保存，备用。
将制备的灭活菌苗接种到绵羊鲜血TSA琼脂平板上，28℃恒温培养24‑48h后，观察平板上是否有病原菌生长，以确定菌苗中是否含有未灭活完全的病原菌。
然后，制备含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋。具体操作如下：
选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，采用上述制备的灭活后的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌苗与适当的佐剂接种产蛋禽。在第一次接种后间隔7 d，再以同样剂量、方法接种第二次，第二次接种后再间隔60 d以相同剂量接种第3次。第一次接种后从第20 d开始拣取高免疫蛋，该免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体。
用上述制备方法获得的抗体，可以应用到预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。该抗体作为有效成分，再添加药学上可接受的辅料或者载体，制成各种制剂使用。
作为一种优选的方案，用水做辅料，水可以是生理盐水也可以是蒸馏水，将抗体制成水剂或者专用的浸浴剂使用。可在小范围内直接浸泡健康鱼或者病鱼，也可以全池泼洒，方便使用。
作为一种优选的方案，采用海藻糖作为载体，将抗体制成粉剂，该粉剂作为饲料添加剂或者预配料直接投喂。具体制作方法如下：首先用0.5%新洁而灭溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡消毒，然后用无菌水冲洗、晾干。将蛋黄或整个鸡蛋收集并匀浆以形成免疫蛋液，并用海藻糖微包膜后喷雾干燥，制得含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋粉，其中，海藻糖的重量为免疫蛋液重量的10%‑20%。
将预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂，也可以全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，而且大大降低了劳动强度。
以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例六：预防及治疗鮰爱德华氏菌病的免疫蛋粉中抗体的含量检测
1、材料：按以上工艺制取的免疫蛋粉
2、方法：应用SDS‑PAGE（十二烷基硫酸钠—聚丙烯凝胶）电泳测定法，对按以上工艺制取的免疫蛋粉进行检测，检测结果为：抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体中纯IgY含量为85.98%。
实施例七：检测抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的免疫蛋粉的抗体效价
1、材料：检测用抗原‑以本发明所述方案制备分离纯化并经灭活的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌苗作为检测抗原。
2、方法：用“ELSA”方法检测所制备的抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的免疫蛋粉的抗体效价，以未经免疫的普通禽蛋所制备的蛋粉作为对照，结果如表4：
表4  抗体效价检测结果

以上检测结果表明，抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的免疫蛋粉可以与分离纯化所得的灭活后的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌苗蛋白特异性结合，并且具有很高的抗体结合效价，而未免疫产蛋禽所产蛋制备的蛋粉仅表现了与该菌苗蛋白很低的结合效价。试验结果证明，本发明所述方案制备的免疫蛋粉可以特异性与鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌苗蛋白结合，并具有很高的结合能力。
实施例八：含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼患“红头病”的预防效果。
1、材料：健康黄颡鱼，取自苏州吴江某养殖场；按以上工艺制取的免疫蛋粉；未免疫蛋所得蛋粉。
2、方法：健康黄颡鱼分为实验组和对照组，其中实验组以本发明所述免疫蛋粉以0.2%的添加量投喂2周或2mg/L养殖水体泼洒3天，而对照组则采取同样的手段处理后，用鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ对两组黄颡鱼进行人工感染实验：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为35±5g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂养，暂养期间不投饵，试验水体经连续充氧循环过滤，确保溶解氧在5mg/L以上；使用自动控温仪控制试验水温(28±1)℃，试验用鱼肌肉注射2.0×107CFU/ml浓度的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌液0.2ml/尾。14 d后的试验结果如表5：
表5  含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼“红头病”的预防情况

上述试验表明：经本发明所制备的免疫蛋粉投喂或泼洒的实验组黄颡鱼能产生显著抵抗“红头病”的能力，而对照组的发病率则接近100%。
实施例九：含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋粉对感染“红头病” 黄颡鱼的治疗效果。
1、材料：健康黄颡鱼，取自苏州吴江某养殖场；按以上工艺制取的免疫蛋粉；未免疫蛋所得蛋粉。
2、方法：首先用鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ对健康黄颡鱼进行人工感染试验：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为35±5g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂养，暂养期间不投饵，试验水体经连续充氧循环过滤，确保溶解氧在5mg/L以上；使用自动控温仪控制试验水温(28±1)℃，试验用鱼肌肉注射2.0×107CFU/ml浓度的鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ菌液0.2ml/尾。
然后，于感染后的第2天，将发病的黄颡鱼随机分为两组，其中实验组取饲料0.2%的量添加投喂本发明所述免疫蛋粉2周或以2mg/L的量连续泼洒5d，而对照组则采取同样的方法给未免疫蛋粉。治疗情况如表6：
表6  含抗鮰爱德华氏菌BRK‑ADHSJ的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼“红头病”的治疗情况

试验结果表明：本发明所述免疫蛋粉投喂或泼洒的实施能够很好的治疗实验组感染“红头病”黄颡鱼，其治愈率可达70%，而对照组感染“红头病”黄颡鱼病情几乎没有得到任何改善。
本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员将它作为饲料添加剂以已知的任何方法施用于黄颡鱼、鮰鱼、鲶鱼等无鳞鱼的养殖中。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

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1、(10)申请公布号 CN 102936285 A (43)申请公布日 2013.02.20 CN 102936285 A *CN102936285A* (21)申请号 201210269249.3 (22)申请日 2012.08.01 CCTCC NO: M 2012024 2012.02.19 C07K 16/12(2006.01) C07K 16/02(2006.01) A61K 39/40(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人无锡贝瑞康生物科技有限公司地址 214028 江苏省无锡市无锡新区新泰路江苏国际技术转移中心综合楼 1323 室 (72)。

2、发明人刘海燕宋学宏包光明郭培红张志华刘金龙 (74)专利代理机构南京纵横知识产权代理有限公司 32224 代理人董建林 (54) 发明名称预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用 (57) 摘要本发明公开了一种预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用，抗体的制备方法：将保藏编号为 CCTCCNO:M2012024 的鮰爱德华氏菌（Edwardsiellaictaluri）灭活后分次接种产蛋禽，获得含抗鮰爱德华氏菌的抗体的免疫蛋；上述抗体可应用在预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。本发明的特点在于：该抗体特异性高、。

3、无毒、无残留、无耐药性、无生物安全隐患；制备该抗体的方法简单、较为快速；尤其是该抗体可以制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂或全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，大大降低了劳动强度。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 8 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 8 页附图 1 页 1/1 页 2 1. 预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌（Edwards。

4、iella ictaluri）分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，上述免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌的抗体。 2. 根据权利要求 1 所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，上述鮰爱德华氏菌为保藏编号为 CCTCC NO:M2012024 的菌株。 3. 根据权利要求 2 所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，上述灭活剂为甲醛。 4. 预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，利用权利要求 1 所述的方法制得。 5. 根据权利要求 4 所述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，上述爱德华氏菌为保藏编号为 C。

5、CTCC NO:M2012024 的菌株。 6. 权利要求 4 所述的抗体在制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用，其特征在于，用新鲜的免疫蛋经海藻糖微包膜后喷雾干燥制成含有上述抗体的粉剂，上述粉剂作为饲料添加剂直接投喂。 8. 根据权利要求 6 所述的应用，其特征在于，用水做辅料，将上述抗体制成水剂全池泼洒。权利要求书 CN 102936285 A 2 1/8 页 3 预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法和应用技术领域 0001 本发明涉及一种抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种用于预防及治疗鱼类鮰爱德。

6、华氏菌病的抗体及其制备方法和应用。背景技术 0002 黄颡鱼、鮰鱼、鲶鱼等无鳞鱼是我国优质的名贵淡水鱼类，这些鱼类不仅肉质鲜嫩、少肌间刺，而且营养价值高，深受广大消费者的喜爱。然而近年来，各地的黄颡鱼、美国叉尾鮰、鲶鱼的养殖区暴发一种流行病，其主要症状为：鳍条基部、口腔、下颌、鳃盖、眼眶充血，头顶正中部位皮下发红，严重时头骨裂开，在头顶部出现一条狭长的溃烂出血带，呈现典型的 “红头病” 症状。该种疾病具有传染性强、死亡率高等特点，已成为制约无鳞鱼尤其是黄颡鱼养殖业的健康发展的瓶颈问题。目前各养殖区采取的应对方法主要是使用广谱抗菌素，。

7、然而该种方法不仅会增加治疗成本，而且还会带来耐药性的产生及鱼体内残留抗生素的超标等诸多问题。因此，寻找一种特异性高又无残留的抗红头病抗生素替代品成为黄颡鱼养殖业亟需解决的问题。 0003 从免疫学角度出发，制备特异性的抗病原菌的抗体，是防病治病的可持续发展思路。目前，公开号为 CN101829321A 的专利文献已公开了制备抗黄颡鱼红头病疫苗的方法：用福尔马林灭活菌苗得到安全可靠的疫苗，通过浸泡和注射的方式给药，免疫保护达 70%-95%。然而这种疫苗在规模化养殖中使用有一定的局限性：劳动强度大；受免鱼容易受伤，造成继发性疾病；预防工作要提前做好，对。

8、于病鱼无治疗作用。发明内容 0004 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种使用方便、不会损伤鱼类、既可以预防又可以治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体及其制备方法。 0005 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK-ADHSJ）分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，前述免疫蛋中含有抗爱德华氏菌的抗体。 0006 前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，前述鮰爱德华氏菌 BRK-AD。

9、HSJ 为保藏编号为 CCTCC NO:M2012024 的菌株。 0007 前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，其特征在于，前述灭活剂为甲醛。 0008 预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，利用如下的方法制得：用经灭活剂灭活的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 分次接种产蛋禽，获得免疫蛋，前述免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体。 0009 前述的预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体，其特征在于，前述鮰爱德华氏菌说明书 CN 102936285 A 3 2/8 页 4 BRK-ADHSJ 为保藏编号为 CCTCC N。

10、O:M2012024 的菌株。 0010 前述的抗体应用在制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。 0011 前述的应用，其特征在于，用新鲜的免疫蛋经海藻糖微包膜后喷雾干燥制成含有前述抗体的粉剂，前述粉剂作为饲料添加剂或者预配料直接投喂。 0012 前述的应用，其特征在于，用水做辅料，将前述抗体制成水剂或者专用的浸浴剂使用。 0013 本发明的有益之处在于：预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体特异性高、无毒、无残留、无耐药性、无生物安全隐患；制备该抗体的方法工业化程度高，效率高；将该抗体应用到制备预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中，与广谱抗生素的使用。

11、不同，使用含有该抗体的药物不会改变病鱼的免疫状态，使用抗体后病鱼的免疫系统依然能够对其他外源侵害做出有效的反应；该抗体不仅可以制成水剂或者专用的浸浴剂使用，尤其可以制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂或全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，大大降低了劳动强度。附图说明 0014 图 1 是保藏编号为 CCTCC NO:M2012024 的菌株 16S rRNA 基因序列与鮰爱德华氏菌标准菌株 (AB453281.1、 EU285522.1、 EF015475.1) 的 16S rRNA 基因序列比对图。具体实施方式 00。

12、15 以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。 0016 预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体的制备方法，包括如下步骤：分离纯化病原菌；确定该分离纯化所得病原菌为鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK-ADHSJ）；获取含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋。 0017 第一步：分离纯化黄颡鱼 “红头病” 病原菌 1、材料：试验病鱼为具典型 “红头病” 症状的黄颡鱼，采自于浙江湖州某养殖场。 0018 2、方法：首先，取活的具典型症状的病鱼，用无菌生理盐水冲洗体表 2 次，用接种环于肝脏、肾脏。

13、和头部发红部位的脑组织取样。然后，在 TSA、普通营养琼脂培养基上进行平板划线， 28恒温培养 48h 后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离培养 3 次，再接种于TSB液体培养基上继续扩大培养。最后，菌液加甘油于-80保存，作为试验用菌株待用。 0019 第二步：确定第一步分离纯化所得病原菌为鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 实施例一：人工感染试验 1、材料：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为 355g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂养，试验水体经连续充氧循环过滤，使用自动控温仪控制试验水温 (281)，暂养期间不。

14、投饵。 0020 2、方法：黄颡鱼暂养 5 天后开展人工感染试验。取 -80保存的试验用菌株，接种在 TSA 平板上， 28培养 48 h。无菌生理盐水冲洗下培养物并倍比稀释成不同浓度的菌悬液。肌肉注射暂养稳定后的试验鱼，每尾注射 0.2 mL，对照组注射等量生理盐水，每试验浓度组设置重复组。试验鱼放置于 20 L 的水族缸，每缸放养 10 尾，内循环过滤处理氨氮、亚硝酸盐及增氧，控温仪自动控温在 28，每天观察、记录试验鱼死亡情况，及时取出死鱼，连说明书 CN 102936285 A 4 3/8 页 5 续观察 14 天。人工感染的结果见表 1 ：。

15、表 1 分离到的菌株人工感染 120h 后的试验结果菌液浓度 /CFUMl-1攻毒剂量 /mL试验鱼数 / 尾死亡数 / 尾 2.51090.21010 2.51080.21010 2.51070.21010 2.51060.2108 2.51050.2107 生理盐水0.2101 空白对照0100 试验结果显示，肌肉注射细菌悬液的人工感染方法能使健康的黄颡鱼发病，且人工感染症状与 “红头病” 自然发病症状相似，即病鱼鳍条基部、上下颌、鳃盖、腹部出血，头顶皮肤颜色变浅、发红，肛门及生殖孔充血、出血、外突，腹腔膨大有腹水等；当菌液浓度达到 2.0107CFU/。

16、ml 时，死亡率达 100%。 0021 实施例一证实了：第一步中得到的试验用菌株为黄颡鱼 “红头病” 的病原菌。 0022 对感染组出现 “红头病” 典型症状的鱼体，按照第一步叙述的方法分离、纯化病原菌，得到的病原菌菌落特征与第一步分离到的菌株的菌落特征一致，说明从人工感染的病鱼中分离到的菌株与试验用菌株为同一菌株，均是黄颡鱼 “红头病” 的病原菌。 0023 实施例二：试验用菌株的菌体形态显微观察 1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。 0024 2、方法：取第一步分离纯化得到的试验用菌株，划线接种于普通营养琼脂、 TSA 平板， 28培养48h。

17、，制备细菌悬液。进行细菌形态观察与革兰氏染色液染色。实验结果显示，该菌株在普通营养琼脂、 TSA 平板培养基上能形成圆形光滑、隆起、湿润并带有光泽、呈半透明状的小菌落。革兰氏染色呈阴性，短杆状，长约 2m，直径约 0.5m，无荚膜，不形成芽孢，个体之间两两纵向连接。 0025 实施例三：试验用菌株的生理生化鉴定 1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。 0026 2、测定项目及结果：参见表 2 表 2 试验用菌株的生化特性测定项目结果测定项目结果氧化 / 发酵FH2S- 鸟氨酸脱羧酶 ODC-吲哚产生 IND- 精氨酸双解酶 ADH-N- 乙酰。

18、 - 葡萄糖甙 NAG- 赖氨酸脱羧酶 LDC- 半乳糖苷酶 GAL- 脲酶 URE-D- 葡萄糖 GLU- L- 阿拉伯醇 LARL-D- 蔗糖 SAC- 半乳糖酸盐 GAT-L- 阿拉伯糖 LARA- 5- 酮基 - 葡萄糖酸 5KG-D- 阿拉伯醇 DARL- 丙酮酸钠 RP+ 半乳糖苷酶 GAL- 葡萄糖甙 GLU-D- 海藻糖 TRE- D- 甘露醇 MAN-L- 鼠李糖 RHA- D- 麦芽糖 MAL-肌醇 INO- 侧金盏花醇 ADO-D- 纤维二糖 CEL- 古老糖 PLE-D- 山梨醇 SOR- 葡萄糖苷酶 GUR-麦芽糖苷酶 MAL- 说明书 CN 102936285 。

19、A 5 4/8 页 6 表 2 的测定结果显示：该试验用菌株的主要特征为接触酶阳性，氧化酶阴性，发酵型。 0027 结合实施例一、二、三所显示的试验用菌株的病理变化、形态特征、培养特性和生理生化特性，可以初步鉴定该分离纯化所得试验用菌株为鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ。 0028 实施例四：试验用菌株的 16S rRNA 基因的特异性扩增鉴定 1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株；引物，序列如下： N1 ： 5 一 ACAGTITGATCCTGGCTCAG 一 3 N2 ： 5 一 CGCTACCTrGTTACGACTT 一 3 通用引物由上海生工生。

20、物工程技术有限公司合成。 0029 2、方法：取第一步分离纯化得到的试验用菌株在TSA平板上划线， 28培养48h后挑取一环培养物，加入50 L无菌水，吹吸混匀后， 10000 r/min离心1 min，去上清，再加入 50 L无菌水，吹吸混匀后，沸水浴10 min， 12000 r/min离心5 min，取1L上清液用于 PCR 扩增。 0030 扩增反应体积为60 L，分别加入10PCR缓冲液6 L，引物各1L， dNTP 2L， Taq 酶 0.5 L，无菌水补足反应体积。 0031 PCR反应条件为： 95预变性5 min， 94变性1 min， 55退火。

21、45s， 72延伸45s，共进行 30 个循环，最后 72延伸 7 min 结束反应。 0032 取6 L反应液在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，产物用胶回收试剂盒回收，进行 DNA 测序。测序工作由上海英骏生物技术有限公司协助完成。 0033 将测得的试验用菌株 16S rRNA 基因序列输入到 NCBI 数据库中进行 Blast 比对，对其基因核苷酸序列的同源性分析发现与鮰爱德华氏菌标准菌株 (AB453281.1、 EU285522.1、 EF015475.1) 的保守性片段有 100的同源性，参见图 1。 0034 结合形态学和生理生化特性，可以将所分离得到的试验用菌。

22、株进一步确定为鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ（Edwardsiella ictaluri BRK-ADHSJ）。 0035 实施例五：试验用菌株的药物敏感试验 1、材料：第一步分离纯化得到的试验用菌株。 0036 2、方法：将第一步分离纯化得到的试验用菌株在 TSB 液体培养基上扩大培养， 28 培养 48 h 后，将液体培养物涂布于 TSA 平板上，适当干燥后贴药敏纸片， 28 培养 24 h 后测定抑菌圈直径，按药敏纸片产品说明书判定药物的敏感度。药物敏感试验结果见表 3 表 3 药物敏感性试验结果药品名敏感性药品名敏感性庆大霉素 GentamycinR利。

23、福平 RifampicinI 环丙沙星 CiprofloxacinS红霉素 ErythromycinR 复方新诺明 CotrimoxazoleS新霉素 NeomycinS 左氧氟沙星 OfloxacinS链霉素 StreptomycinR 卡那霉素 KanamycinR氟哌酸 NorfloxacinI 头孢拉定 CeftazidimeS洛美沙星 CiprofloxzcinS 阿莫西林 AmoxicillinR头孢噻吩 CefalothinI 氨苄青霉素 AmpicillinS先锋 IV CefalexinS 林可霉素 LincomycinR菌必治 RocephinS 依诺沙星 Enoxacin。

24、S妥布霉素 TobramycinR 呋喃唑酮 FurazolidoneS强力霉素 DoxycyclineS 说明书 CN 102936285 A 6 5/8 页 7 注： S 敏感 sensitive ； R 耐药 resistant ； I 中度敏感 mid-sensitive. 试验结果表明，该菌株对环丙沙星、复方新诺明、左氧氟沙星、头孢拉定、氨苄青霉素、依诺沙星、呋喃唑酮、新霉素、洛美沙星、先锋、菌必治、强力霉素敏感；对试验药物中的庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林、林可霉素、红霉素、链霉素、妥布霉素不敏感；对利福平、氟哌酸、头孢噻吩。

25、中度敏感。该菌株对抗生素的敏感特征与鮰爱德华氏菌标准菌株相似。 0037 综合以上五个实施例的试验结果，可以确定从自然发病的 “红头病” 黄颡鱼中分离纯化所得的试验用菌株为鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ。因 “红头病”是由鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 引起的，所以此病又叫做鮰爱德华氏菌病。 0038 申请人于 2012 年 2 月 19 日将从自然发病的 “红头病” 黄颡鱼中分离纯化所得的试验用菌株鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO: M 2012024。 0039 第三步：获取含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ。

26、的抗体的免疫蛋首先，制备灭活的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌苗。具体操作如下：在无菌条件下，取 -80条件下保存的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌种，用接种环从菌种管中挑取少量细菌接种到10 mlTSB肉汤中，将接种后的肉汤放入水浴振荡器中， 28 振荡培养 24 h。 0040 把复苏培养的菌液 10 ml 再次接种至 500 mlTSB 肉汤中，接种后的肉汤于水浴振荡器中28继续振荡培养48h。将次级培养的TSB肉汤均匀涂布在制备好的TSA平板上，将涂布好的 TSA 平板放入 28恒温培养箱中，培养 48h，直至细菌菌苔长满整个平板。用灭过菌的。

27、生理盐水无菌操作冲洗平板上生长的菌苔，将洗下的菌悬液置于灭过菌的输液瓶中。 0041 将从平板上洗脱的菌液按每 10 ml 菌液接种到 200 mlTSB 肉汤培养基的比例，进行菌液的扩大培养。28 条件下振荡培养 48 h，从而得到高浓度细菌悬液。对扩大培养得到的高浓度细菌悬液，按体积比例添加5-6的甲醛，放入水浴振荡器中， 28 振荡48 h 灭活。 0042 将灭活完全的菌苗，无菌操作分装于 500 ml 灭菌高温瓶中，并进行石蜡封闭。分装好的灭活菌苗置于 4 保存，备用。 0043 将制备的灭活菌苗接种到绵羊鲜血 TSA 琼脂平板上， 28恒温培养 24-48h 。

28、后，观察平板上是否有病原菌生长，以确定菌苗中是否含有未灭活完全的病原菌。 0044 然后，制备含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋。具体操作如下：选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，采用上述制备的灭活后的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌苗与适当的佐剂接种产蛋禽。在第一次接种后间隔7 d，再以同样剂量、方法接种第二次，第二次接种后再间隔60 d以相同剂量接种第3次。第一次接种后从第20 d开始拣取高免疫蛋，该免疫蛋中含有抗鮰爱德华氏菌BRK-ADHSJ的抗体。 0045 用上述制备方法获得的抗体，可以应用到预防及治疗。

29、鱼类鮰爱德华氏菌病的药物中。该抗体作为有效成分，再添加药学上可接受的辅料或者载体，制成各种制剂使用。 0046 作为一种优选的方案，用水做辅料，水可以是生理盐水也可以是蒸馏水，将抗体制成水剂或者专用的浸浴剂使用。可在小范围内直接浸泡健康鱼或者病鱼，也可以全池泼洒，方便使用。说明书 CN 102936285 A 7 6/8 页 8 0047 作为一种优选的方案，采用海藻糖作为载体，将抗体制成粉剂，该粉剂作为饲料添加剂或者预配料直接投喂。具体制作方法如下：首先用0.5%新洁而灭溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡消毒，然后用无菌水冲洗、晾干。将蛋黄或整个。

30、鸡蛋收集并匀浆以形成免疫蛋液，并用海藻糖微包膜后喷雾干燥，制得含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋粉，其中，海藻糖的重量为免疫蛋液重量的 10%-20%。 0048 将预防及治疗鱼类鮰爱德华氏菌病的抗体制成粉剂，作为饲料添加剂或者预配料直接投喂，也可以全池泼洒，克服了其他抗体药物只能注射或浸泡才能有效的缺点，使用十分方便，而且大大降低了劳动强度。 0049 以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。 0050 实施例六：预防及治疗鮰爱德华氏菌病的免疫蛋粉中抗体的含量检测 1、材料：按以上工艺制取的免疫蛋粉 2、方法：应用 SDS-PAGE。

31、（十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶）电泳测定法，对按以上工艺制取的免疫蛋粉进行检测，检测结果为：抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体中纯 IgY 含量为 85.98%。 0051 实施例七：检测抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的免疫蛋粉的抗体效价 1、材料：检测用抗原 - 以本发明所述方案制备分离纯化并经灭活的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌苗作为检测抗原。 0052 2、方法：用 “ELSA” 方法检测所制备的抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的免疫蛋粉的抗体效价，以未经免疫的普通禽蛋所制备的蛋粉作为对照，结果如表 4 ：表 4 抗体效价检测结果。

32、以上检测结果表明，抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的免疫蛋粉可以与分离纯化所得的灭活后的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌苗蛋白特异性结合，并且具有很高的抗体结合效价，而未免疫产蛋禽所产蛋制备的蛋粉仅表现了与该菌苗蛋白很低的结合效价。试验结果证明，本发明所述方案制备的免疫蛋粉可以特异性与鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌苗蛋白结合，并具有很高的结合能力。 0053 实施例八：含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼患 “红头病” 的预防效果。 0054 1、材料：健康黄颡鱼，取自苏州吴江某养殖场；按以上工艺制取的免疫蛋粉；未免。

33、疫蛋所得蛋粉。 0055 2、方法：健康黄颡鱼分为实验组和对照组，其中实验组以本发明所述免疫蛋粉以 0.2% 的添加量投喂 2 周或 2mg/L 养殖水体泼洒 3 天，而对照组则采取同样的手段处理后，用鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 对两组黄颡鱼进行人工感染实验：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为 355g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂说明书 CN 102936285 A 8 7/8 页 9 养，暂养期间不投饵，试验水体经连续充氧循环过滤，确保溶解氧在 5mg/L 以上；使用自动控温仪控制试验水温 (281)，试。

34、验用鱼肌肉注射 2.0107CFU/ml 浓度的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌液 0.2ml/ 尾。14 d 后的试验结果如表 5 ：表 5 含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼 “红头病” 的预防情况上述试验表明：经本发明所制备的免疫蛋粉投喂或泼洒的实验组黄颡鱼能产生显著抵抗 “红头病” 的能力，而对照组的发病率则接近 100%。 0056 实施例九：含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋粉对感染 “红头病” 黄颡鱼的治疗效果。 0057 1、材料：健康黄颡鱼，取自苏州吴江某养殖场；按以上工艺制取的免疫蛋粉；未免。

35、疫蛋所得蛋粉。 0058 2、方法：首先用鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 对健康黄颡鱼进行人工感染试验：试验用健康黄颡鱼为取自苏州吴江某养殖场的健康黄颡鱼鱼种，规格为 355g，塑料袋充氧运回实验室，于水族缸内暂养，暂养期间不投饵，试验水体经连续充氧循环过滤，确保溶解氧在 5mg/L 以上；使用自动控温仪控制试验水温 (281)，试验用鱼肌肉注射 2.0107CFU/ ml 浓度的鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 菌液 0.2ml/ 尾。 0059 然后，于感染后的第 2 天，将发病的黄颡鱼随机分为两组，其中实验组取饲料 0.2% 的量添加投喂本发明。

36、所述免疫蛋粉 2 周或以 2mg/L 的量连续泼洒 5d，而对照组则采取同样的方法给未免疫蛋粉。治疗情况如表 6 ：表 6 含抗鮰爱德华氏菌 BRK-ADHSJ 的抗体的免疫蛋粉对黄颡鱼 “红头病” 的治疗情况说明书 CN 102936285 A 9 8/8 页 10 试验结果表明：本发明所述免疫蛋粉投喂或泼洒的实施能够很好的治疗实验组感染 “红头病” 黄颡鱼，其治愈率可达 70%，而对照组感染 “红头病” 黄颡鱼病情几乎没有得到任何改善。 0060 本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员将它作为饲料添加剂以已知的任何方法施用于黄颡鱼、鮰鱼、鲶鱼等无鳞鱼的养殖中。 0061 需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。说明书 CN 102936285 A 10 1/1 页 11 图 1 说明书附图 CN 102936285 A 11 。

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