吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶.pdf

本发明涉及吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶。本发明提供了一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和结晶B，其用Cu-Kα射线衍射得到的X-射线粉末衍射图谱分别如图1和图5所示。本发明还提供了结晶A和结晶B的制备方法及其应用。本发明的结晶具有低吸湿性和高稳定性，具有优良的使用和储存性能，具有广泛的应用前景。

权利要求书一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A，其特征在于，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：9.6±0.2°、11.6±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、25.6±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°。
如权利要求1所述的二钠盐结晶A，其特征在于，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：9.2±0.2°、9.6±0.2°、11.6±0.2°、13.5±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.2±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、23.8±0.2°、25.6±0.2°、26.4±0.2°、27.3±0.2°、28.4±0.2°、30.7±0.2°、31.7±0.2°、32.4±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°。
如权利要求1所述的二钠盐结晶A，其特征在于，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱基本上如图1所示。
一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B，其特征在于，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：8.1±0.2°、9.0±0.2°、10.1±0.2°、13.7±0.2°、16.4±0.2°、17.6±0.2°、18.2±0.2°、23.9±0.2°、25.8±0.2°、27.2±0.2°、31.0±0.2°、39.5±0.2°。
如权利要求4所述的二钠盐结晶B，其特征在于，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱基本上如图5所示。
制备权利要求1～3中任一项所述的二钠盐结晶A的方法，其特征在于，所述制备方法选自下组：
(A)混悬结晶法：在20℃～60℃温度范围内，将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌至平衡得到混悬液，过滤得到所述二钠盐结晶A；
(B)缓慢挥发法：将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、混匀至溶解，并在20℃～60℃的条件下将溶剂挥干，得到所述二钠盐结晶A；
(C)反溶剂沉淀结晶法：在20～60℃的温度范围下，将吡咯并喹啉醌二钠盐溶解在高溶解度溶剂中，在所得体系中加入低溶解度反溶剂以析出所述二钠盐结晶A，
其中，25℃下，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述高溶解度溶剂中的溶解度≥0.35g/100g溶剂，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述低溶解度反溶剂中的溶解度≤0.15g/100g溶剂。
如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法(A)、(B)和(C)中所用的溶剂分别选自下组，其中的比例为体积比：
方法(A)：乙腈、甲醇、乙醇、水、乙烷、庚烷、甲醇:水、乙醇:水、丙酮:水、乙腈:水、四氢呋喃:水、甲醇:己烷、乙醇:己烷、乙腈:己烷、四氢呋喃:己烷、甲醇:甲基叔丁基醚、乙醇:甲基叔丁基醚、甲醇:甲苯、乙醇:甲苯、乙腈:甲苯、甲醇:甲基异丁基酮、甲苯:乙烷，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1；
方法(B)：甲醇:水、乙醇:水、异丙醇:水、丙酮:水、乙腈:水、四氢呋喃:水，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为10:1~1:10，优选5:1~1:5；
方法(C)中的高溶解度溶剂为水，低溶解度反溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈和四氢呋喃。
制备权利要求4～5中任一项所述的二钠盐结晶B的方法，其特征在于，所述制备方法选自下组：
(A')混悬结晶法：在20℃～60℃温度范围内，将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌至平衡得到混悬液，过滤得到所述二钠盐结晶B；或
(B')缓慢挥发法：将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、混匀至溶解，并在20℃～60℃的条件下将溶剂挥干，得到所述二钠盐结晶B。
如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法(A')和(B')中所用的溶剂分别选自下组，其中的比例为体积比：
方法(A')：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、己烷、庚烷、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷、甲乙酮:乙烷、硝基甲烷:乙烷、乙酸乙酯:乙烷、甲基叔丁基醚:乙烷、甲苯:乙烷、丙酮:甲基叔丁基醚、甲乙酮:甲基叔丁基醚、乙腈:甲基叔丁基醚、四氢呋喃:甲基叔丁基醚、硝基甲烷:甲基叔丁基醚、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、丙酮:甲苯、甲乙酮:甲苯、四氢呋喃:甲苯、硝基甲烷:甲苯、乙酸乙酯:甲苯、丙酮:甲基异丁基酮、甲乙酮:甲基异丁基酮、乙腈:甲基异丁基酮、四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲烷:甲基异丁基酮、乙酸乙酯:甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮、甲苯:甲基异丁基酮、四氢呋喃:乙烷，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1；
方法(B')：异丙醇:水、四氢呋喃:水，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为10:1~1:10，优选5:1~1:5，更优选4:1~1:4。
一种组合物或包装品，其包含：
(I)权利要求1～3中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A、权利要求4～5中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B、通过权利要求6～7中任一项所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和/或通过权利要求8～9中任一项所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B；
(II)药学上、生理学上或制剂学上可接受的载体和/或辅料。
如权利要求10所述的组合物或包装品，其特征在于，所述组合物或包装品选自下组：药物组合物、功能性食品、饲料、添加剂、微生物生长抑制剂和防腐剂。
权利要求1～3中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A、权利要求4～5中任一项所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B、通过权利要求6～7中任一项所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和/或通过权利要求8～9中任一项所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B的用途，其特征在于，其用于制备用于预防、缓解或治疗选自下组的疾病或症状的药物组合物或功能性食品：
促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、老年痴呆、微生物感染。

说明书吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶
技术领域
本发明涉及吡咯并喹啉醌的二钠盐的新型结晶及其制备方法。
背景技术
吡咯并喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)是最早从微生物中发现的小分子化合物，它是细菌中多种重要酶类的辅基，在高等真核生物体内也有存在，并广泛分布于人体各组织器官。PQQ是一种无味无嗅的化合物，其分子式如结构式I所示：

结构式I
近年来，对于PQQ的研究表明，它是一种对人体健康非常有利的物质：PQQ缺乏的小鼠生长缓慢，生殖能力差，并且容易产生关节炎症，可能是体内必需的维生素之一；作为一种抗氧化剂，PQQ能够保护肝脏免受CCl4或酒精损伤；纯化的PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成；PQQ保护神经细胞免受NMDA毒性影响，从而防止脑部缺血缺氧，避免动物模型发生严重的休克；此外，PQQ还具有防治心肌缺血，心肌梗死，有效地预防和治疗动脉粥样硬化作用。
目前PQQ可以通过发酵法和化学合成的方法制备获得。但由这些方法获得的PQQ二钠盐结晶晶型不稳定，极具引湿性，在常温储存的温度范围内，湿度变化幅度大，固体状态不理想，从而对PQQ二钠盐的应用和储存造成了非常不利的影响。
日本三菱瓦斯化学株式会社已就PQQ二钠盐的晶体1(即本专利申请中所述结晶E)申请了专利(专利文献1，申请号CN201080031945，申请日2010年6月9日)。然而经本发明人研究发现，该晶体吸湿性高，不利于加工和储存。
因此，考虑到PQQ在药学、保健学、食品学等多种方面中的应用，本领域迫切需要在高纯度状态下获得在具有高稳定性、优异可加工性和可存储性的PQQ结晶及其制备方法。
发明内容
本发明的主要目的之一正是为了从结晶度、稳定性、吸湿性和/或加工性等方面出发，提供稳定的PQQ的二钠盐结晶及其制备方法。本发明的发明人通过设计PQQ二钠盐的结晶化条件，筛选并获得了适合医药、食品、保健等应用的晶型。
在本发明的第一方面中，提供了一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：9.6±0.2°、11.6±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、25.6±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°。
在一些实施方式中，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：9.2±0.2°、9.6±0.2°、11.6±0.2°、13.5±0.2°、14.9±0.2°、16.0±0.2°、18.2±0.2°、18.8±0.2°、19.4±0.2°、20.4±0.2°、21.9±0.2°、22.7±0.2°、23.2±0.2°、23.8±0.2°、25.6±0.2°、26.4±0.2°、27.3±0.2°、28.4±0.2°、30.7±0.2°、31.7±0.2°、32.4±0.2°、33.7±0.2°、35.0±0.2°、35.8±0.2°、36.7±0.2°、38.0±0.2°、38.6±0.2°。
在另一些实施方式中，所述结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱基本上如图1所示。
在一个优选例中，在25℃下，所述二钠盐结晶A 65～80%RH时的引湿性低于3%。
在另一个优选例中，在25℃下，所述二钠盐结晶A在从65%RH变化到80%RH时的引湿性变化小于1%，优选小于0.6%。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶A在30‑400℃范围内的热重分析曲线基本上如图2所示。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶A是二水合物。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶A在50‑280℃范围内、以10℃/min的扫描速率得到的差示扫描量热分析图谱基本上如图3所示。
在本发明的第二方面中，提供了一种吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在如下的2θ角度有衍射峰：8.1±0.2°、9.0±0.2°、10.1±0.2°、13.7±0.2°、16.4±0.2°、17.6±0.2°、18.2±0.2°、23.9±0.2°、25.8±0.2°、27.2±0.2°、31.0±0.2°、39.5±0.2°。
在一些实施方式中，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱中在如下2θ角度的峰强度均小于600。
在一个优选例中，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱中在如下2θ角度的峰强度为(2θ/峰强度)：9.0°/517、10.1°/366、16.4°/107、23.9°/582、27.2°/511(峰强因实验和样品条件等可存在一定差异，但该差异范围在本领域普通技术人员可预期的范围内)。
在25℃下，所述二钠盐结晶B在65～80%RH时的引湿性低于或等于12.0%。
在一个优选例中，在25℃下，所述二钠盐结晶B在从65%RH变化到80%RH时的引湿性变化小于1.5%，优选小于或等于1.0%。
在另一些实施方式中，所述结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱基本上如图5所示。
在一个优选例中，所述二钠盐结晶B在30‑400℃范围内的热重分析曲线基本上如图6所示。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶B是二水合物。
在另一个优选例中，所述二钠盐结晶B在50‑280℃范围内、以10℃/min的扫描速率得到的差示扫描量热分析图谱基本上如图7所示。
在本发明的第三方面中，提供了制备本发明所述的二钠盐结晶A的方法，所述制备方法选自下组：
(A)混悬结晶法：在20℃～60℃温度范围内，将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌至平衡得到混悬液，过滤得到所述二钠盐结晶A；
(B)缓慢挥发法：将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、混匀至溶解，并在20℃～60℃的条件下将溶剂挥干，得到所述二钠盐结晶A；
(C)反溶剂沉淀结晶法：在20～60℃的温度范围下，将吡咯并喹啉醌二钠盐溶解在高溶解度溶剂中，在所得体系中加入低溶解度反溶剂以析出所述二钠盐结晶A，
其中，25℃下，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述高溶解度溶剂中的溶解度≥0.35g/100g溶剂，吡咯并喹啉醌二钠盐在所述低溶解度反溶剂中的溶解度≤0.15g/100g溶剂。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐通过化学合成或发酵生产制备。
在另一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐含或不含结晶。
在另一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐可含或不含杂质，其纯度为98%~100%，优选99%~100%。
在另一个优选例中，在方法(A)～(C)中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为100:1~1:100。在方法(A)中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为100:1~1:50，优选100:1~1:1。在方法(B)中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为50:1~1:100，优选10:1~1:100。
在另一个优选例中，方法(A)～(C)在室温～55℃，优选25～50℃，更优选室温、25℃或50℃下进行。
在另一个优选例中，方法(A)和(B)中的搅拌时间至少为2小时，优选2小时～10天，更优选2小时～7天。
在另一个优选例中，方法(B)中的挥发时间至少为2小时，优选2小时～14天，更优选2小时～10天；所述挥发可在真空条件下进行。
在另一个优选例中，由高效液相色谱法测定通过方法(A)～(C)中任一种所述方法获得的PQQ二钠盐的纯度高于99.0%，优选高于99.5%，更优选高于99.8%。
在一些实施方式中，所述方法(A)、(B)和(C)中所用的溶剂分别选自下组，其中的比例为体积比：
方法(A)：乙腈、甲醇、乙醇、水、乙烷、庚烷、甲醇:水、乙醇:水、丙酮:水、乙腈:水、四氢呋喃:水、甲醇:己烷、乙醇:己烷、乙腈:己烷、四氢呋喃:己烷、甲醇:甲基叔丁基醚、乙醇:甲基叔丁基醚、甲醇:甲苯、乙醇:甲苯、乙腈:甲苯、甲醇:甲基异丁基酮、甲苯:乙烷，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1；
方法(B)：甲醇:水、乙醇:水、异丙醇:水、丙酮:水、乙腈:水、四氢呋喃:水，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为10:1~1:10，优选5:1~1:5；
方法(C)中的高溶解度溶剂为水，低溶解度反溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈和四氢呋喃。
在一个优选例中，在25℃下进行方法(A)时的溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、水、甲醇:水、乙醇:水、丙酮:水、乙腈:水、四氢呋喃:水、甲醇:己烷、乙醇:己烷、乙腈:己烷、四氢呋喃:己烷、甲醇:甲基叔丁基醚、乙醇:甲基叔丁基醚、甲醇:甲苯、乙醇:甲苯、乙腈:甲苯、甲醇:甲基异丁基酮，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1。
在另一个优选例中，在50℃下进行方法(A)时的溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、乙烷、庚烷、甲醇:水、乙醇:水、乙腈:水、四氢呋喃:水、甲醇:己烷、乙醇:己烷、乙腈:己烷、甲苯:己烷、甲醇:甲基叔丁基醚、乙醇:甲基叔丁基醚、甲醇:甲苯、乙醇:甲苯、乙腈:甲苯、甲醇:甲基异丁基酮，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1。
在另一个优选例中，在25℃下进行方法(B)时所用溶剂选自下组：甲醇:水(1:2～1:6)、乙醇:水(1:2～1:6)、异丙醇:水(1:2)、丙酮:水(2:9～1:4)、乙腈:水(2:5～1:4)、四氢呋喃:水(2:5～1:4)。
在另一个优选例中，在50℃下进行方法(B)时的溶剂选自下组：甲醇:水(1:6)、乙醇:水(1:2)、异丙醇:水(1:2)、丙酮:水(2:9)、乙腈:水(2:5～1:4)、四氢呋喃:水(2:5)。
在本发明的第四方面中，提供了制备本发明所述的二钠盐结晶B的方法，所述制备方法选自下组：
(A')混悬结晶法：在20℃～60℃温度范围内，将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌至平衡得到混悬液，过滤得到所述二钠盐结晶B；或
(B')缓慢挥发法：将吡咯并喹啉醌二钠盐与溶剂搅拌、混匀至溶解，并在20℃～60℃的条件下将溶剂挥干，得到所述二钠盐结晶B。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐通过化学合成或发酵生产制备。
在另一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐含或不含结晶。
在另一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌二钠盐可含或不含杂质，其纯度为98%~100%，优选98%~100%。
在另一个优选例中，在方法(A')～(B')中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为100:1~1:100。在方法(A')中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为100:1~1:50，优选100:1~1:1。在方法(B')中，吡咯并喹啉醌二钠盐与最初使用的溶剂之间的质量体积比g/L为50:1~1:100，优选10:1~1:100。
在另一个优选例中，方法(A')～(B')在室温～55℃，优选25～50℃，更优选室温、25℃或50℃下进行。
在另一个优选例中，方法(A')中的搅拌时间至少为2小时，优选2小时～10天，更优选2小时～7天。
在另一个优选例中，方法(B')中的挥发时间至少为2小时，优选2小时～14天，更优选2小时～10天；所述挥发可在真空条件下进行。
在一些实施方式中，所述方法(A')和(B')中所用的溶剂分别选自下组，其中的比例为体积比：
方法(A')：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、己烷、庚烷、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷、甲乙酮:乙烷、硝基甲烷:乙烷、乙酸乙酯:乙烷、甲基叔丁基醚:乙烷、甲苯:乙烷、丙酮:甲基叔丁基醚、甲乙酮:甲基叔丁基醚、乙腈:甲基叔丁基醚、四氢呋喃:甲基叔丁基醚、硝基甲烷:甲基叔丁基醚、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、丙酮:甲苯、甲乙酮:甲苯、四氢呋喃:甲苯、硝基甲烷:甲苯、乙酸乙酯:甲苯、丙酮:甲基异丁基酮、甲乙酮:甲基异丁基酮、乙腈:甲基异丁基酮、四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲烷:甲基异丁基酮、乙酸乙酯:甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮、甲苯:甲基异丁基酮、四氢呋喃:乙烷，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1；
方法(B')：异丙醇:水、四氢呋喃:水，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为10:1~1:10，优选5:1~1:5，更优选4:1~1:4。
在一个优选例中，在25℃下进行方法(A')时的溶剂选自下组：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、己烷、庚烷、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷、甲乙酮:乙烷、硝基甲烷:乙烷、乙酸乙酯:乙烷、甲基叔丁基醚:乙烷、甲苯:乙烷、丙酮:甲基叔丁基醚、甲乙酮:甲基叔丁基醚、乙腈:甲基叔丁基醚、四氢呋喃:甲基叔丁基醚、硝基甲烷:甲基叔丁基醚、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、丙酮:甲苯、甲乙酮:甲苯、四氢呋喃:甲苯、硝基甲烷:甲苯、乙酸乙酯:甲苯、丙酮:甲基异丁基酮、甲乙酮:甲基异丁基酮、乙腈:甲基异丁基酮、四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲烷:甲基异丁基酮、乙酸乙酯:甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮、甲苯:甲基异丁基酮，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1。
在另一个优选例中，在50℃下进行方法(A')时的溶剂选自下组：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷、甲乙酮:乙烷、四氢呋喃:乙烷、硝基甲烷:乙烷、乙酸乙酯:乙烷、甲基叔丁基醚:乙烷、丙酮:甲基叔丁基醚、甲乙酮:甲基叔丁基醚、四氢呋喃:甲基叔丁基醚、硝基甲烷:甲基叔丁基醚、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚、丙酮:甲苯、甲乙酮:甲苯、四氢呋喃:甲苯、硝基甲烷:甲苯、乙酸乙酯:甲苯、丙酮:甲基异丁基酮、甲乙酮:甲基异丁基酮、乙腈:甲基异丁基酮、四氢呋喃:甲基异丁基酮、硝基甲烷:甲基异丁基酮、乙酸乙酯:甲基异丁基酮、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮、甲苯:甲基异丁基酮，其中各混合溶剂中各溶剂的体积比为5:1~1:5，优选2:1~1:2，更优选1:1。
在另一个优选例中，在25℃下进行方法(B')时所用溶剂为异丙醇:水(1:4)。
在另一个优选例中，在50℃下进行方法(B')时的溶剂选自下组：四氢呋喃:水(1:4)。
在另一个优选例中，由高效液相色谱法测定通过方法(A')～(B')中任一种所述方法获得的PQQ钠盐的纯度高于98.0%，优选高于99%，更优选高于99.5%。
在本发明的第五方面中，提供了一种组合物或包装品，其包含：
(I)本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A、本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B、通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和/或通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B；
(II)药学上、生理学上或制剂学上可接受的载体和/或辅料。
在一些实施方式中，所述组合物或包装品选自下组：药物组合物、功能性食品、饲料、添加剂、微生物生长抑制剂和防腐剂。
在一个优选例中，所述二钠盐结晶的加入量为所述组合物重量的0.001wt%至99.99wt%，优选0.01wt%至99.0wt%，更优选0.1wt%至90wt%。
在另一优选例中，所述二钠盐结晶在组合物或包装品中的形式选自：粉末、颗粒、或微丸，优选粉末形式。
在另一个优选例中，所述组合物或包装品用于选自下组的一种或多种用途：促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、预防/缓解或治疗老年痴呆、抑制微生物生长、延长食物保存时间。
在另一个优选例中，所述组合物或包装品还可包含具有选自下组的活性的一种或多种其它活性物质：促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、预防/缓解或治疗老年痴呆、抑制微生物生长或延长食物保存时间。
在本发明的第六方面中，提供了本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A、本发明所述的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B、通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶A和/或通过本发明所述的方法制备的吡咯并喹啉醌的二钠盐结晶B的用途，其用于制备用于预防、缓解或治疗选自下组的疾病或症状的药物组合物或功能性食品：促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、老年痴呆、微生物感染。
在另一个优选例中，所述药物组合物或功能性食品还可包含具有选自下组的活性的一种或多种其它活性物质：促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、预防/缓解或治疗老年痴呆、抑制微生物生长或延长食物保存时间。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。并且，本领域普通技术人员可对本文中所述的各种特征和方面进行有效的组合，这些组合仍然在本申请所要求保护的范围之内。
附图说明
图1：实施例1中得到的结晶A的X‑射线粉末衍射(XRPD)图；
图2：实施例1中得到的结晶A的热失重分析(TG)图；
图3：实施例1中得到的结晶A的差示扫描量热分析(DSC)图；
图4：实施例1中得到的结晶A的吸湿性分析(DVS)图；
图5：实施例4中得到的结晶B的X‑射线粉末衍射(XRPD)图；
图6：实施例4中得到的结晶B的热失重分析(TG)图；
图7：实施例4中得到的结晶B的差示扫描量热分析(DSC)图；
图8：实施例4中得到的结晶B的吸湿性分析(DVS)图；
图9：比较实施例1中得到的结晶C的X‑射线粉末衍射(XRPD)图；
图10：比较实施例1中得到的结晶C的热失重分析(TG)图；
图11：比较实施例1中得到的结晶C的差示扫描量热分析(DSC)图；
图12：比较实施例1中得到的结晶C的吸湿性分析(DVS)图；
图13A：结晶A、B以及结晶C的XRPD谱图叠加比较；
图13B：结晶A、B以及结晶C的XRPD谱图叠加放大比较1；
图13C：结晶A、B以及结晶C的XRPD谱图叠加放大比较2；
图14：结晶A、B以及结晶C的TG谱图叠加比较；
图15：结晶A、B以及结晶C的DSC谱图叠加比较；
图16：结晶A、B以及结晶C的DVS谱图叠加比较；
图17A：结晶A、B以及结晶C的拉曼光谱(Raman)谱图叠加比较；
图17B：结晶A、B以及结晶C的Raman谱图叠加放大比较1；
图17C：结晶A、B以及结晶C的Raman谱图叠加放大比较2；
图18A：结晶A、B以及结晶C的红外光谱(IR)谱图叠加比较；
图18B：结晶A、B以及结晶C的IR谱图叠加放大比较1；
图18C：结晶A、B以及结晶C的IR谱图叠加放大比较2；
图19：结晶A、B、结晶C与结晶D(JACS，Journal of the American Chemical Society，1989年8月，111卷，17期，6822‑6828中显示为单晶的PQQ钠盐结晶)的XRPD谱图叠加比较。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究制得了PQQ二钠盐晶体A和B，并出乎意料地发现该晶体具有纯度高、吸湿度低、稳定性佳等优良特性，其存放和使用均较已知的PQQ二钠盐固体更为方便，特别适合用作制备包含PQQ二钠盐的组合物或包装物。在此基础上，发明人完成了本发明。
PQQ二钠盐晶体的制备
如本文所用，术语“晶体”具有本领域中常规知晓的含义，即由结晶物质构成的、其内部的构造质点(如原子、分子)呈平移周期性规律排列的固体。
如本文所用，术语“吡咯并喹啉醌”与“PQQ”可互换使用，均是指结构式如上文结构式I所示的化合物。作为获得本发明晶体A和晶体B的原料化合物，所使用的PQQ二钠盐可以本领域中常规方法获得，例如通过发酵法(例如，专利文献CN 101228963B)和有机化学合成法(J.Am.Chem.Soc.,1981,103,5599～5600)等制备。原料中使用的PQQ二钠盐可以是结晶也可以是非晶质的。此外，所用原料也可以含有杂质。
在结晶制备前，可通过常规方法测定PQQ二钠盐在不同溶剂中的溶解度，并随后选用适当的溶剂制备本发明的结晶。例如，可采用如下方法测定PQQ二钠盐在多种溶剂中的溶解度：
(1)取大约25mg PQQ二钠盐，分别在25℃和50℃条件下与1ml溶剂搅拌平衡至少24h，随后，分别过滤溶液，液体部分在真空中将溶剂挥干。利用重量分析法测定原料药在溶剂中的近似溶解度。
重量分析法：准确取一定体积(一般为0.5mL)的滤液放入干燥且已称好重量的容器中，记为M空，随即称量容器加滤液的总重量，记为M0，则滤液重量为M0‑M空。于真空中挥干溶剂后再准确称量其总重量(记为M1)，则析出的固体质量为M1－M空，溶剂的质量为M0－M1，据此原料在该溶剂中的近似溶解度为：
X(g)=[(M1‑M空)/(M0‑M1)]×100(g)
【表1】PQQ二钠盐在各种溶剂中的溶解度
  溶剂  溶解度@25℃(g/100g)  溶解度@50℃(g/100g)  丙酮  0.13  0.05  乙腈  0.01  0.05  甲醇  0.09  0.11  乙醇  0.08  0.11  异丙醇  0.09  0.08  异戊醇  0.02  0.00  乙酸乙酯  0.11  0.09  乙酸异丙酯  0.36  0.03  己烷  0.06  0.02  庚烷  0.02  0.11  甲基叔丁基醚  0.05  0.03  甲基异丁基酮  0.05  0.07  二氯甲烷  0.02  0.04  氯仿  0.02  0.03  四氢呋喃  0.15  0.24  甲苯  0.02  0.05  硝基甲烷  0.01  0.02  乙醚  0.06  0.01  甲基乙基酮  0.16  0.06  水  0.37  0.89
  甲醇:水(1:1)  0.15  0.13  乙醇:水(1:1)  0.10  0.10  丙酮:水(1:1)  0.53  1.36  乙腈:水(1:1)  0.22  0.14  四氢呋喃:水(1:1)  0.24  0.29  乙腈:甲基叔丁基醚(1:1)  0.10  0.04  乙腈:甲基叔丁基醚(1:1)  0.03  0.02  乙腈:甲苯(1:1)  0.04  0.00  乙腈:甲基异丁基甲酮(1:1)  0.09  0.04
PQQ二钠盐结晶A的制备
PQQ二钠盐结晶A可通过方法(A)混悬结晶法、方法(B)缓慢挥发法或方法(C)反溶剂沉淀结晶法制得。
方法(A)混悬结晶法、方法(B)缓慢挥发法或方法(C)反溶剂沉淀结晶法的示例如下。本领域普通技术人员可根据常识对这些方法中的条件进行调整：
方法(A)：25℃和50℃混悬结晶法：将PQQ二钠盐在25℃和50℃条件下与溶剂搅拌平衡至少24h，过滤得到结晶。方法(B)缓慢挥发法：将PQQ二钠盐与溶剂搅拌、混匀、溶解，并在25℃和50℃条件下将溶剂挥干得到结晶。方法(C)反溶剂沉淀结晶法：根据上述(1)测得近似溶解度，取两种在室温条件下溶解度相差很大的溶剂作为一组相结合。取大约5‑200mg PQQ二钠盐溶解在0.5~5ml溶解度很高的溶剂中，随后，加入4‑20ml对PQQ二钠盐高度不溶的溶剂(反溶剂)，析出沉淀，获得结晶。
在25℃进行方法(A)操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：乙腈、甲醇、乙醇、水、甲醇：水(1:1)、乙醇：水(1:1)、丙酮：水(1:1)、乙腈：水(1:1)、四氢呋喃：水(1:1)、甲醇：己烷(1:1)、乙醇：己烷(1:1)、乙腈：己烷(1:1)、四氢呋喃：己烷(1:1)、甲醇:甲基叔丁基醚(1:1)、乙醇:甲基叔丁基醚(1:1)、甲醇：甲苯(1:1)、乙醇：甲苯(1:1)、乙腈：甲苯(1:1)、甲醇：甲基异丁基酮(1:1)；
在50℃进行方法(A)操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：乙腈、甲醇、乙醇、乙烷、庚烷、甲醇:水(1:1)、乙醇:水(1:1)、乙腈:水(1:1)、四氢呋喃:水(1:1)、甲醇:己烷(1:1)、乙醇:己烷(1:1)、乙腈:己烷(1:1)、甲苯:己烷(1:1)、甲醇:甲基叔丁基醚(1:1)、乙醇:甲基叔丁基醚(1:1)、甲醇:甲苯(1:1)、乙醇:甲苯(1:1)、乙腈:甲苯(1:1)、甲醇:甲基异丁基酮(1:1)。其中原料与溶剂的质量体积比(g/L)为100:1～1:1。
方法(A)中所述在25℃和50℃条件下的搅拌平衡时，优选根据需要进行搅拌，然后在真空条件下挥干溶剂，搅拌时间优选2h~7d。
在25℃进行方法(B)操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：甲醇:水(1:2；1:6)、乙醇:水(1:2；1:6)、异丙醇:水(1:2)、丙酮:水(2:9；1:4)、乙腈:水(2:5；1:4)、四氢呋喃:水(2:5；1:4)；若列举(3)50℃缓慢挥发法中使用溶剂的例子、包括甲醇:水(1:6)、乙醇:水(1:2)、异丙醇:水(1:2)、丙酮:水(2:9)、乙腈:水(2:5；1:4)、四氢呋喃:水(2:5)。其中原料与溶剂的质量体积比(g/L)为10:1~1:100。
方法(B)中所述的搅拌平衡，优选根据需要进行搅拌，然后在25℃和50℃条件下挥干溶剂，挥干时间优选2h~10d。
方法(C)反溶剂沉淀结晶法中所述两种在室温条件下溶解度相差很大的溶剂组合(溶剂/反溶剂)，包括水/甲醇，水/乙醇，水/异丙醇，水/丙酮，水/乙腈，水/四氢呋喃，等。其中原料与溶剂的质量体积比(g/L)为10:1～1:100。
方法(C)中所述的加入反溶剂后析出沉淀的时间，设为2h~2d。
通过本发明方法(A)、(B)或(C)可获得极高纯度的结晶A，由高效液相色谱法确定其纯度可大于99.8%。
PQQ二钠盐结晶B的制备
PQQ二钠盐结晶B可通过方法(A')混悬结晶法或方法(B')缓慢挥发法制得。例如，可通过在25℃和50℃进行方法(A')或(B')来制备结晶B。本领域普通技术人员可根据常识对这些方法中的条件进行调整：
在25℃进行方法(A')操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、己烷、庚烷、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷(1:1)、甲乙酮:乙烷(1:1)、硝基甲烷:乙烷(1:1)、乙酸乙酯:乙烷(1:1)、甲基叔丁基醚:乙烷(1:1)、甲苯:乙烷(1:1)、丙酮:甲基叔丁基醚(1:1)、甲乙酮:甲基叔丁基醚(1:1)、乙腈:甲基叔丁基醚(1:1)、四氢呋喃:甲基叔丁基醚(1:1)、硝基甲烷:甲基叔丁基醚(1:1)、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚(1:1)、丙酮:甲苯(1:1)、甲乙酮:甲苯(1:1)、四氢呋喃:甲苯(1:1)、硝基甲烷:甲苯(1:1)、乙酸乙酯:甲苯(1:1)、丙酮:甲基异丁基酮(1:1)、甲乙酮:甲基异丁基酮(1:1)、乙腈:甲基异丁基酮(1:1)、四氢呋喃:甲基异丁基酮(1:1)、硝基甲烷:甲基异丁基酮(1:1)、乙酸乙酯:甲基异丁基酮(1:1)、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮(1:1)、甲苯:甲基异丁基酮(1:1)。
在50℃进行方法(A')操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：丙酮、异丙醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、甲苯、硝基甲烷、乙醚、甲乙酮、丙酮:乙烷(1:1)、甲乙酮:乙烷(1:1)、四氢呋喃:乙烷(1:1)、硝基甲烷:乙烷(1:1)、乙酸乙酯:乙烷(1:1)、甲基叔丁基醚:乙烷(1:1)、丙酮:甲基叔丁基醚(1:1)、甲乙酮:甲基叔丁基醚(1:1)、四氢呋喃:甲基叔丁基醚(1:1)、硝基甲烷:甲基叔丁基醚(1:1)、乙酸乙酯:甲基叔丁基醚(1:1)、丙酮:甲苯(1:1)、甲乙酮:甲苯(1:1)、四氢呋喃:甲苯(1:1)、硝基甲烷:甲苯(1:1)、乙酸乙酯:甲苯(1:1)、丙酮:甲基异丁基酮(1:1)、甲乙酮:甲基异丁基酮(1:1)、乙腈:甲基异丁基酮(1:1)、四氢呋喃:甲基异丁基酮(1:1)、硝基甲烷:甲基异丁基酮(1:1)、乙酸乙酯:甲基异丁基酮(1:1)、甲基叔丁基醚:甲基异丁基酮(1:1)、甲苯:甲基异丁基酮(1:1)。其中原料与溶剂的质量体积比(g/L)为100:1~1:1。
结晶B用方法(A')制备，在25℃和50℃条件下的搅拌平衡时，优选根据需要进行搅拌，然后在真空条件下挥干溶剂，搅拌时间优选2h~7d。
在25℃进行方法(B')操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：异丙醇：水(1:4)等；在50℃进行方法(B')操作中可使用的溶剂的例子，包括但不限于：四氢呋喃：水(1:4)。其中原料与溶剂的质量体积比(g/L)为10:1~1:100。
方法(B')操作中搅拌平衡时，优选根据需要进行搅拌，然后在25℃和50℃条件下挥干溶剂，挥干时间优选2h~10d。
PQQ二钠盐晶体的鉴定和性质
本发明人在获得PQQ二钠盐晶体后进一步采用多种方式和仪器对其性质进行了研究。
“X射线粉末衍射”，又称“X射线多晶衍射(XRD或SRPD)”是目前用于测定晶体构造(即晶型)的常用试验方法。采用X射线粉末衍射仪，在X射线透过晶体时产生一系列衍射图谱，该图谱中不同的衍射线及其强度由一定结构的原子团所决定，由此确定晶体的具体晶型结构。
本发明的PQQ二钠盐晶体具有特定的晶体形态，其在X射线衍射图谱中具有特定的特征峰。
结晶A用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在约如下的2θ角度有衍射峰：9.2°、9.6°、11.6°、13.5°、14.9°、16.0°、18.2°、18.8°、19.4°、20.4°、21.9°、22.7°、23.2°、23.8°、25.6°、26.4°、27.3°、28.4°、30.7°、31.7°、32.4°、33.7°、35.0°、35.8°、36.7°、38.0°、38.6°(均为±0.2°)的PQQ二钠盐结晶。
结晶B用Cu‑K α射线衍射得到的X‑射线粉末衍射图谱在约如下的2θ角度有衍射峰：8.1°、9.0°、10.1°、13.7°、16.4°、17.6°、18.2°、23.9°、25.8°、27.2°、31.0°、39.5°(均为±0.2°)的PQQ二钠盐结晶。
以上X射线粉末衍射的衍射角2θ的测定，在以下的测定条件进行。
仪器型号：Bruker D8 advance
靶：Cu‑Kα(40kV，40mA)
样品到检测器距离：30cm
扫描范围：3°‑40°(2θ值)
扫描步径：0.1s
应理解，以上峰值也可以由其它安装有单色器的一般的X射线粉末衍射仪器观测到。此外，上述对于本发明中规定的结晶形状可能含有测定误差，因此，峰值只要在测定误差范围内，即认为合理。
也可采用差示量热扫描分析(DSC)、热重分析(TG)、红外扫描(IR)等常规方法对本发明的晶体进行表征和研究。
经研究，本发明的晶体A和晶体B可以是含水物(如二水合物)，其熔点在其分解温度以上，只要具有上述X射线粉末衍射的衍射角2θ的测定峰即可。
与已知结晶相比，本发明的晶体A和晶体B具有显著降低的吸湿性，使得本发明的晶体在应用和储存中不易吸湿形成诸如团块等不良形态，从而具有良好的稳定性和可加工性。
本发明晶体的应用
根据本领域中的现有常识，PQQ具有促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗和动脉粥样硬化的药理作用，同时，PQQ还可抑制食品中微生物生长，可以延长食物的保存时间。
因此，本发明的PQQ结晶A和结晶B能够与“药学上或生理学上或制剂学上可接受的载体”组合使用，作为多种组合物的有效成分，通过口服、喷涂、鼻腔内、或透皮等途径给予所需的对象。
本发明的组合物中PQQ二钠盐晶体A和/或B有效成分占组合物总重量的0.001～99.9wt%；优选为组合物总重量的1～95wt%，较优选为5～90wt%，更优选10～80wt%。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
如本文所用，术语“药学上或生理学上或制剂学上可接受的载体”指用于保健品或药物制剂的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有或没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。例如，药学上可接受的载体详细记载于《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
在组合物中可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5‑8，较佳地，pH约为6‑8。本发明的组合物可选自：药物组合物、功能性食品、饲料、添加剂、微生物生长抑制剂和防腐剂。
另外，PQQ结晶A或结晶B能够单独或与其它材料组合使用，所述其它材料包括但不限于：维生素类、氨基酸类、类胡萝卜素类、ω3脂肪酸类、ω6脂肪酸类、虾青素等。
可将本发明的结晶或组合物按照具体需要制成包装品，例如药盒、功能性食品套盒等，其中可包含：本发明的PQQ二钠盐晶体；任选的，其它活性物质、指导用户或医师使用该药盒的说明书、容器、赋形剂等，本领域技术人员可根据具体需要来确定其中的任选组分。
本发明的组合物或包装品还可包含具有选自下组的活性的一种或多种其它活性物质：促生长、抗炎、增锌降铅、防治肝脏疾病、减少白内障形成、抗癌、促进神经再生、防治心梗、动脉粥样硬化、解酒、预防/缓解或治疗老年痴呆、抑制微生物生长或延长食物保存时间。这些其它活性物质包括但不限于：维生素类、氨基酸类、类胡萝卜素类、ω3脂肪酸类、ω6脂肪酸类、虾青素等。
本发明的优点
本发明的优点主要在于：
1.本发明中提供了PQQ二钠盐的两种新晶型，即结晶A和结晶B；
2.本发明的结晶A、B在结晶度、稳定性、吸湿性以及可加工性方面与已知PQQ二钠盐晶体或固体相比具有明显的优越性，因此在工业、医药和功能性食品等领域具有广泛的应用前景。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《晶型药物》(吕扬、杜冠华主编，人民卫生出版社，2009年)或按照供应商所建议的条件，也可由商业公司提供测试。以下实施例中所有试剂都可来源于市售。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
参考例.PQQ二钠盐的制备
通过如下操作得到PQQ二钠盐：
在Corey等人1981年报道的化学合成文献(J.Am.Chem.Soc.,1981,103,5599～5600)的基础上，对合成工艺路线和条件进行优化改进，经九步反应得到PQQ二钠盐。
与Corey的文献相比，本发明所用方法优化改进之处主要在于：1)将催化氢化反应文献用的催化剂贵金属铂改为钯；2)将文献中重氮化偶联反应中的偶联试剂2‑甲基乙酰乙酸甲酯改为2‑甲基乙酰乙酸乙酯；3)将文献中酯水解反应先与原甲酸酯反应得到单缩酮再在碱性条件下水解得到最终产物，改进为直接在碱性条件下水解后调pH得到产物。
具体合成过程如下：
(1)甲酰化反应：原料2‑甲氧基‑5‑硝基苯胺在甲酸和乙酸酐作用下氨基被甲酰化保护得到N‑(2‑甲氧基‑5‑硝基苯基)甲酰胺；
(2)催化氢化反应：氨基被甲酰化保护后的化合物在乙醇作溶剂，钯/炭作催化剂的条件下，芳环硝基被还原为氨基得到N‑(5‑氨基‑2‑甲氧基苯基)甲酰胺；
(3)重氮化偶联反应：在亚硝酸钠作用下氨基重氮化后形成氟硼酸重氮盐，氟硼酸重氮盐直接与2‑甲基乙酰乙酸乙酯偶联得到2‑{[(3‑甲酰胺基‑4‑甲氧基)芳基]亚肼基}‑丙酸乙酯；
(4)成吡咯环反应：前一步产物在甲酸作用下形成吡咯环得到6‑甲酰氨基‑5‑甲氧基‑1氢‑吲哚‑2‑羧酸乙酯；
(5)甲酰胺水解反应：将第一步保护的甲酰胺基在酸性条件下酰胺键打开游离出氨基得到6‑氨基‑5‑甲氧基‑1氢‑吲哚‑2‑羧酸乙酯；
(6)成环反应：前一步游离出氨基的产物和2‑氧代戊烯二酸二甲酯反应成环得到9‑羟基‑5‑甲氧基‑6,7,8,9‑四氢‑1氢‑吡咯[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸‑2‑乙酯‑7,9‑二甲酯；
(7)喹啉环的形成：前一步产物在醋酸铜和酸性条件下形成喹啉环得到5‑甲氧基‑1氢‑吡咯[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸‑2‑乙酯‑7,9‑二甲酯；
(8)氧化反应：前一步产物在氧化剂作用下形成醌环得到4,5‑二氧‑4,5‑二氢化‑1氢‑吡咯[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸‑2‑乙酯‑7,9‑二甲酯；
(9)酯水解反应：PQQ酯在碱性条件下三个酯基水解，水解完成后用6mol/L的盐酸将溶液pH调到3.0，保持3小时后分离出固体即为PQQ二钠盐。
所得PQQ二钠盐原料即为结晶C。
所得PQQ二钠盐用高效液相色谱法在如下所示条件下可测得纯度大于99.0%：
仪器型号：UlTiMate3000，美国戴安
色谱柱：YMC‑C18250×4.6mm I.D.
流动相：乙腈：100mM磷酸二氢钾=12：88，用磷酸调整pH为2.0
检测波长：249nm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
进样量：10μl
实施例1.用混悬结晶法制备PQQ二钠盐结晶A及所得结晶的性质研究
取按如上参考例方法制备的10mg PQQ二钠盐(纯度≥98，也可采用市购sigma公司PQQ二钠盐，货号：80198‑10MG‑F)，在25℃和50℃条件下与1mL乙腈搅拌平衡5d，随后分别过滤溶液，固体部分在空气中干燥10min，得到PQQ二钠盐结晶A。
对所得PQQ二钠盐结晶A进行X射线粉末衍射分析(XRPD，图1)、热重分析(TG，图2)、差示扫描量热分析(DSC，图3)和吸湿性分析(DVS，图4)
1.X射线粉末衍射谱图
在下面所示的条件下测定所得结晶的X射线粉末衍射谱图。在图1中表示结果。通过X射线粉末衍射使用Cu‑K α放射线得到的2θ的峰在约：9.2°、9.6°、11.6°、13.5°、14.9°、16.0°、18.2°、18.8°、19.4°、20.4°、21.9°、22.7°、23.2°、23.8°、25.6°、26.4°、27.3°、28.4°、30.7°、31.7°、32.4°、33.7°、35.0°、35.8°、36.7°、38.0°、38.6°(均为±0.2°)。
仪器型号：Bruker D8 advance
靶：Cu‑K α(40kV，40mA)
样品到检测器距离：30cm
扫描范围：3°‑40°(2θ值)
扫描步径：0.1s
得到的固体是结晶性的。
2.热重分析
TG(图2)显示，结晶A在30~200℃有1.33%、6.02%两个失重(一个水分子的理论失重值为4.6%)，可能是水合物，分解峰值温度312.5℃。
仪器型号：Netzsch TG 209F3
温度范围：30‑400℃
扫描速率：10K/min
吹扫气：25mL/min
保护气：15mL/min
3.差示扫描量热分析
对应的DSC(图3)在该温度区间(30~200℃)有吸热峰出现，表明该晶体含水。并且，在升温范围内没有发现熔融现象，这表明其熔点可能在药物分解温度以上。
仪器型号：Perkin Elmer DSC 8500
温度范围：50‑280℃
扫描速率：10℃/min
氮气流速：50ml/min
4.吸湿性分析
DVS(图4)显示，晶体A在40%RH吸收水分1.6%，在65%RH吸收水分2.3%，在80%RH吸收水分2.8%。在常规存储环境中，40‑80RH,吸湿性变化小于2%，仅略有吸湿性。
仪器型号：SMS DVS Intrinsic，0~95%RH，
温度：25℃
实施例2.用缓慢挥发法制备PQQ二钠盐结晶A及所得结晶的性质研究
准备3mg PQQ二钠盐两份(参考例中所制备)，分别与含160μL无水乙醇+560μL水和含160μL无水乙醇+320μL水的溶剂混匀，溶解，分别在25℃和50℃缓慢挥发至干，溶剂挥干后减压干燥得到PQQ二钠盐结晶A。
在实施例1所述条件下检测所得结晶的X射线粉末衍射谱图，并进行热重分析、差示扫描量热分析和吸湿性分析，所得结果同实施例1。
实施例3.用反溶剂沉淀结晶法制备PQQ二钠盐结晶A及所得结晶的性质研究
取10mg PQQ二钠盐(参考例中所制备)，溶解在2mL水中，并搅拌平衡。随后放入含有6mL无水乙醇的棕色玻璃瓶中，12h后将析出沉淀。对过滤得到的固体进行加压干燥，得到PQQ二钠盐结晶A。
在实施例1所述条件下检测所得结晶的X射线粉末衍射谱图，并进行热重分析、差示扫描量热分析和吸湿性分析，所得结果同实施例1。
实施例4.用混悬结晶法制备PQQ二钠盐结晶B及所得结晶的性质研究
取10mg PQQ二钠盐(参考例中所制备)，在25℃和50℃条件下与1mL乙酸乙酯搅拌平衡5d，随后分别过滤溶液，固体部分减压干燥得到PQQ二钠盐结晶B。
采用实施例1所示条件，对所得PQQ二钠盐结晶B进行X射线粉末衍射分析(XRPD，图5)、热重分析(TG，图6)、差示扫描量热分析(DSC，图7)和吸湿性分析(DVS，图8)：
1.X射线粉末衍射分析
测定所得结晶B的X射线粉末衍射谱图。在图5中表示结果。通过X射线粉末衍射使用Cu‑Kα放射线得到的2θ的峰出现8.1°、9.0°、10.1°、13.7°、16.4°、17.6°、18.2°、23.9°、25.8°、27.2°、31.0°、39.5°(均为±0.2°)。
2.热重分析
TG(图6)显示，结晶B在30~200℃有5.98%、6.21%两个失重区间(一个水分子的理论失重值4.6%，一个乙酸乙酯的理论失重值19.1%)，可能是水合物。分解峰值温度303.3℃。
3.差示扫描量热分析
对应的DSC(图7)在该温度区间有吸热峰出现，表明该晶体含水。并且，在升温范围内没有发现熔融现象，这表明晶体B的熔点可能在药物分解温度以上。
4.吸湿性分析
DVS(图8)显示，结晶B在40%RH吸收水分7.3%，在65%RH吸收水分11.0%，在80%RH吸收水分12.0%。在相对湿度20‑40范围内，形成一水合物；在相对湿度大于50范围内，形成二水合物；湿度进一步增加，可形成多水合物。
实施例5.用缓慢挥发法制备PQQ二钠盐结晶B及所得结晶的性质研究
准备3mg PQQ二钠盐两份，一份与含160μL异丙醇+960μL水溶剂混匀，溶解，在25℃挥发至干；一份与含160μL四氢呋喃+640μL水溶剂混匀，溶解，在50℃挥发。溶剂挥干之后减压干燥，得到PQQ二钠盐结晶B。
在实施例1所述条件下检测所得结晶的X射线粉末衍射谱图，并进行热重分析、差示扫描量热分析和吸湿性分析，所得结果同实施例4。
比较实施例1.PQQ二钠盐结晶C的制备及所得结晶的性质研究
PQQ二钠盐结晶C的获得方法详见<参考例>。
采用实施例1所示条件，对所得PQQ二钠盐结晶C进行X射线粉末衍射分析(XRPD，图9)、热重分析(TG，图10)、差示扫描量热分析(DSC，图11)和吸湿性分析(DVS，图12)：
1.X射线粉末衍射谱图
结晶C的X射线粉末衍射谱图，在图9中表示结果，通过X射线粉末衍射使用Cu‑K α射线得到的2θ的峰出现8.2°、8.6°、9.0°、10.1°、13.7°、17.6°、18.2°、23.9°、26.9°、27.3°、28.3°、31.0°、31.6°、32.6°、39.4°、45.3°(为±0.2°)。
2.热重分析
TG(图10)显示，实验开始阶段就已经有明显失重，表面水分较多，另外，结晶C在30~180℃有4.37%、7.06%两个失重(一个水分子的理论失重值4.6%)，可能是水合物。
3.差示扫描量热分析
对应的DSC(图11)在该温度区间有吸热峰出现，表明该晶体含水。
4.吸湿性分析
DVS(图12)显示，结晶C极具引湿性，在常规储存湿度范围内，湿度变化幅度大，在5‑15%。在40%RH含水分7.8%，在65%RH吸收水分13.8%，在80%RH吸收水分15.7%。初步推断：在相对湿度20‑40范围内，形成一水合物；在相对湿度大于50范围内，形成二水合物；湿度进一步增加，可形成多水合物。
比较实施例2.单晶数据向X射线粉末衍射结果转换
将非专利文献1(JACS，111卷，6822‑6828)中报道的单晶的X射线接近结构解析的数据，对该结晶（结晶D）引起的X射线粉末衍射的峰进行模拟。使用origin作图软件，在图19中表示结果。结果表明，其峰值与本发明的结晶位置不同(详见表2)。
比较实施例3.专利文献1所述结晶
将专利文献1所述结晶1（本发明所述结晶E）的X射线粉末衍射与本发明结晶A、B比较。结果表明，其峰值与本发明的结晶位置不同（详见表2）。
比较例.PQQ二钠盐结晶A和B与结晶C、D和E的比较
通过XRPD、TG、DSC、DVS、拉曼光谱(Raman)和红外光谱(IR)的方法比较实施例中所得的三种晶体(即结晶A、B和C)，其中XRPD、TG、DSC、DVS测试方法如实施例1所述。
Raman光谱
仪器型号：Thermo DXR Raman Microscope
曝光时间(秒)：2.0
激光：780nm
激光功率：50mW
激光：25μm狭缝
IR
仪器型号：Nicolet FTIR 6700
解析：4.000
样品获得：2.0
光学速度：0.6329
光圈：100.00
检测器：DTGS KBr
分光镜：KBr
表2、表3和叠加图(图13‑18)中总结了实施例1所得结晶A、实施例4所得结晶B、比较实施例1所得结晶C、比较实施例2所得结晶D，比较实施例3所述结晶E(专利文献1，申请号CN201080031945)的比较结果。
1.【表2】(其中粗体表示与结晶C相比的特征峰)


2.【表3】

3.各种晶型固体表征的叠加图分析
XRPD叠加图(图13A‑C)显示：结晶A在9.2°、9.6°、14.9°、16.0°等与结晶B和结晶C有明显差别，结晶B在9.0°、10.1°、16.4°、23.9°、27.2°与结晶C峰强有明显差别。
TG叠加图(图14)显示：结晶A、B、C均有溶剂失重。
DSC叠加图(图15)显示：结晶A、B、C均有吸热峰出现，结晶A、B、C的熔点在药物分解温度以上。
DVS叠加图(图16)显示：三种晶型的引湿性不同，其中，结晶A的引湿性最小，在80%RH吸收水分2.8%；结晶B引湿性中等，在80%RH吸收水分12.0%；结晶C引湿性最大，在80%RH吸收水分15.7%。
拉曼(Raman)光谱谱图叠加(图17A‑C)结果显示：结晶A在1579.70cm‑1、1539.20cm‑1、1327.07cm‑1等处与结晶B、结晶C有差别。
红外光谱(IR)谱图叠加(图18A‑C)：结晶A在3072.05cm‑1、1577.49cm‑1、1295.93cm‑1等处与结晶B、结晶C有差别。
上述结果表明：
本发明的结晶A、B通过X射线粉末衍射使用Cu‑Kα放射线得到的2θ值是全新的，提示本发明的结晶型是新型的。
并且，本发明的结晶A、B在结晶度、稳定性、吸湿性以及可加工性方面具有明显的优越性，因此在工业、医药和功能性食品等领域具有广泛的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改或对本文所描述的特征进行组合，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。