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1、(10)申请公布号 CN 102876637 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102876637 A *CN102876637A* (21)申请号 201210418849.1 (22)申请日 2012.10.26 CCTCC NO ： C201221 2012.07.05 C12N 5/20(2006.01) C12N 15/06(2006.01) C07K 16/18(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学第二 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区新桥正街 2 号 (72)发明人 蒲晓允 黄绍光 蒋栋能 刘飞 (74)专利代理机构 北京集佳。
2、知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 冯琼 (54) 发明名称 抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗 GLIPR-2 单克隆抗体 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 公开了抗GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗 GLIPR-2 单 克隆抗体。本发明所述抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂 交瘤细胞保藏编号为CCTCC NO ： C201221。 本发明 所述杂交瘤细胞能够稳定产生抗 GLIPR-2 单克隆 抗体， 且细胞染色体稳定、 抗体效价高， 完全能够 应用于 GLIPR-2 的分子作用机制的研究中。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl。
3、. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞， 其特征在于， 保藏编号为 CCTCCNO ： C201221。 2.根据权利要求1所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞， 其特征在于， 由以下方法制 备获得 ： GLIPR-2 蛋白免疫 BALB/C 小鼠， 然后取 BALB/C 小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞在 50% 聚乙 二醇作用下进行融合， 融合后进行HAT培养， 然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检 测， 筛选出阳性杂交瘤。
4、细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗 GLIPR-2 单克隆抗体， 即获 得抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞。 3. 根据权利要求 2 所述抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞， 其特征在于， 所述 GLIPR-2 蛋白免疫 BALB/C 小鼠具体为 ： 取 GLIPR-2 蛋白 100g 加等质量福氏完全佐剂对 BALB/C 小鼠进行第一次免疫注射， 3 周后取 GLIPR-2 蛋白 300g 加等质量福氏不完全佐剂对 BALB/C 小鼠进行第二次免疫注 射， 7 周后取 GLIPR-2 蛋白 500g 对 BALB/C 小鼠进行第三次免疫注射。 4.根据权利要求2所述抗GLIPR。
5、-2单克隆抗体杂交瘤细胞， 其特征在于， 所述HAT培养 具体操作为 ： 用含20%胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96 孔板中培养 2 周。 5.根据权利要求2所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞， 其特征在于， 所述ELISA检 测具体操作为 ： 杂交瘤细胞培养上清液加入到 GLIPR-2 蛋白包被的酶标板中于 37孵育 20min， 洗涤 后以工作浓度为 1:2000 的标准加 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 于 37孵育 20min， 然后加邻苯二 胺底物显色 15min 后终止反应。 6. 保藏编号为 CCTCC NO ： C201221 的杂交瘤。
6、细胞在制备抗 GLIPR-2 单克隆抗体中的应 用。 7. 抗 GLIPR-2 单克隆抗体， 其特征在于， 由保藏编号为 CCTCC NO ： C201221 的杂交瘤细 胞分泌产生。 权 利 要 求 书 CN 102876637 A 2 1/4 页 3 抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗 GLIPR-2 单克隆抗体 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗 GLIPR-2 单克隆抗体。 背景技术 0002 GLIPR-2（glioma pathogenesis related-2， GLIPR-2） 属于 。
7、PR-1（pathogenesis related-1） 家族， 普遍表达于哺乳动物外周血单核细胞和脾脏。 最近的研究发现， 肾脏纤维 化中 GLIPR-2 表达基因在肾小管上皮细胞中表达增加， 提示它在这一病理过程中具有重要 作用。 0003 肾脏纤维化是一种病理生理改变， 是肾脏的功能由健康到损伤， 再到损坏， 直至功 能丧失的渐进过程， 主要包括肾间质纤维化与肾小球硬化。以往认为肾功能减退是由于肾 小球病变所致， 然而自 1970 年 Schainuch 提出肾小管间质 （Tubuleinterstitium， TI） 损害 与肾功能减退呈显著相关的观点以来， TI 损害日益得到重视。 。
8、0004 研究发现， 表达 GLIPR-2 的肾小管上皮细胞明显向间质细胞转化， 是肾脏成纤维 细胞的主要来源之一。但目前对于 GLIPR-2 在纤维化中作用的分子机制尚不清楚， 主要原 因是缺乏有效的试验工具， 特别是抗 GLIPR-2 的特异性抗体。因此， 提供一种抗 GLIPR-2 的 单克隆抗体， 对进一步研究 GLIPR-2 的分子作用机制具有重要意义。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的 抗 GLIPR-2 单克隆抗体。 0006 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案 ： 0007 抗 GLIPR-2 单克隆抗。
9、体杂交瘤细胞， 保藏编号为 CCTCC NO ： C201221。 0008 本发明所述抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获 得 ： 0009 GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠， 然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚 乙二醇作用下进行融合， 融合后进行 HAT 培养， 然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行 ELISA 检测， 筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗 GLIPR-2 单克隆抗体， 即 获得抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞。 0010 其中， 所述 GLIPR-2 蛋白免疫 BALB/C 小鼠优选为 ： 0011 取 GL。
10、IPR-2 蛋白 100g 加等质量福氏完全佐剂对 BALB/C 小鼠进行第一次免疫注 射， 3周后取GLIPR-2蛋白300g加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次免疫 注射， 7 周后取 GLIPR-2 蛋白 500g 对 BALB/C 小鼠进行第三次免疫注射。本发明免疫所用 GLIPR-2 蛋白可参照文献 人 GLIPR-2 基因的克隆及在原核中可溶性表达 （黄绍光， 李强， 钮芹， 倪丹妮， 蒲晓允， 免疫学杂质， 2010 年 5 月第 26 卷第 5 期） 记载的内容获得。 0012 所述 HAT 培养具体操作优选为 ： 说 明 书 CN 102876637 A 3 2。
11、/4 页 4 0013 用含20%胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞 的 96 孔板中培养 2 周。 0014 所述 ELISA 检测具体操作优选为 ： 0015 杂交瘤细胞培养上清液加入到 GLIPR-2 蛋白包被的酶标板中于 37孵育 20min， 洗涤后以工作浓度为 1:2000 的标准加 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 于 37孵育 20min， 然后加邻 苯二胺底物显色 15min 后终止反应。 0016 经过上述方法制备后， 最终筛选出能够稳定分泌抗 GLIPR-2 单克隆抗体的杂交瘤 细胞， 命名为 1A11A11C9E2， 并于 2012 年 7 月。
12、 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址为 中国武汉大学。 0017 此外， 本发明还提供一种抗 GLIPR-2 单克隆抗体， 由保藏编号为 CCTCC NO ： C201221 的杂交瘤细胞分泌产生。 0018 制备抗 GLIPR-2 单克隆抗体可采用本技术领域常规方法， 如用杂交瘤细胞株诱导 小鼠腹水， 本发明优选为 ： 0019 将保藏编号为 CCTCC NO ： C201221 的杂交瘤细胞传代培养， 取对数生长期的细胞 计数， 小鼠腹腔接种 5105个 / 只， 诱导腹水， 离心， 收集上清， 用 DEAE-SephadexA50 离子 交换柱层析法纯化抗 GLIPR-2 单克隆。
13、抗体。 0020 本发明所述保藏编号为 CCTCC NO ： C201221 的杂交瘤细胞染色体稳定， 其分泌产 生的抗 GLIPR-2 单克隆抗体均为 IgG1 型， 效价较高， 直接培养的上清可达 1 ： 2000， 小鼠腹 水可达 10mg/mL， 效价可达 1 ： 10000， 完全能够应用于 GLIPR-2 的分子作用机制的研究中。 因此， 本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO ： C201221的杂交瘤细胞在制备抗GLIPR-2单克 隆抗体中的应用。 0021 由以上技术方案可知， 本发明提供了一株抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其 分泌产生的抗GLIPR-2单克隆抗。
14、体， 该杂交瘤细胞能够稳定产生抗GLIPR-2单克隆抗体， 且 细胞染色体稳定、 抗体效价高， 完全能够应用于 GLIPR-2 的分子作用机制的研究中。 0022 生物保藏信息说明 0023 杂交瘤细胞株 1A11A11C9E2 于 2012 年 7 月 5 日保藏在保藏于中国典型培养物保 藏中心， 地址为中国武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： C201221。 具体实施方式 ： 0024 本发明公开了抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗 GLIPR-2 单克隆 抗体， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所 有类似的替换和改动。
15、对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内 容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本 发明技术。 0025 下面就本发明提供的抗 GLIPR-2 单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗 GLIPR-2 单克隆抗体做进一步说明。 0026 实施例 1 ： 免疫小鼠 0027 1、 材料 说 明 书 CN 102876637 A 4 3/4 页 5 0028 抗原 ： GLIPR-2 蛋白， 根据文献 人 GLIPR-2 基因的克隆及在原核中可溶性表达 （黄绍。
16、光， 李强， 钮芹， 倪丹妮， 蒲晓允， 免疫学杂质， 2010年5月第26卷第5期） 的方法制备 ； 0029 试验动物 ： 6 周龄、 17g 左右 BALB/C 小鼠 （由第三军医大学实验动物中心提供） ； 0030 试剂 ： 福氏完全佐剂和不完全佐剂 （购自 Promega 公司） ； 0031 2、 方法 0032 BALB/C 小鼠后腿肌肉及背部皮内注射抗原免疫， 第一次 100g 加等量福氏完全 佐剂， 3 周后用 100g 加等量福氏不完全佐剂， 7 周后 500g 不加佐剂腹腔注射， 腹腔注射 后第 4 天准备进行细胞融合。 0033 实施例 2 ： 细胞融合 0034 1、。
17、 材料 0035 骨髓瘤细胞 ： SP2/0 细胞 （由中国典型培养物保藏中心提供） ； 0036 培养基 ： 胎牛血清 （购自 Invitrogen 公司） ； HAT 选择性培养基 （购自 Sigma 公司） ； 0037 饲养细胞 ： 0038 2、 方法 0039 腹腔注射后第 4 天取 BALB/C 小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞在 50% 聚乙二醇作用下融 合。融合后的杂交瘤细胞用含 20% 进口胎牛血清的 HAT 选择性培养基混均加入种有饲养细 胞的 96 孔板中培养， 2 周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。 0040 接种 96 孔细胞培养板 7 块共 660 孔 （对照孔除外） 。
18、， 其中 420 孔有克隆生长， 融合 率为 64%（420/660） 。 0041 实施例 3 ： ELISA 检测 0042 GLIPR-2 蛋白包被酶标板， 封闭后加杂交瘤细胞培养上清液 37孵育 20min， 洗 涤后加 HRP 标记的羊抗鼠 IgG（工作浓度 1 2000） ， 37孵育 20min 后洗涤， 加邻苯二胺 （OPD） 底物显色 15min 后终止反应。同时设阴性、 阳性和空白对照， 筛选出能分泌抗体的杂 交瘤细胞。结果显示， 抗体阳性有 16 孔， 阳性率为 2.4%（16/660)。 0043 实施例 3 ： 克隆化培养及染色体鉴定 0044 将前述筛选出的阳性杂交。
19、瘤细胞用有限稀释法进行多次克隆化培养， 至克隆细胞 抗体阳性率为 100%， 获得 10 株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞， 选择其中一株活性最 强的杂交瘤细胞， 命名为 1A11A11C9E2。 0045 秋水仙素处理传代培养的 1A11A11C9E2 杂交瘤细胞， 0.075mol/LKCl 溶液低渗处 定、 铺片， 10%Giemsa 染色， 镜检。结果显示， 正常 BALB/C 小鼠脾细胞染色体的数目恒定为 40 对， 同品系的 SP2/0 细胞的染色体众数目为 68 对， 1A11A11C9E2 杂交瘤细胞的染色体数 目约为两种亲本染色体数目的总合， 染色后计数为 102 对。 0。
20、046 实施例 4 ： 腹水诱导抗 GLIPR-2 单克隆抗体及抗体亚型检测 0047 1A11A11C9E2 杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数， 小鼠腹腔接种 5105 个 / 只， 诱导腹水 , 离心， 收集上清， 用 DEAE-SephadexA50 离子交换柱层析法纯化单克隆抗 体。 0048 用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒 （购自于 Sigma） 鉴定， 结果显示， 制备的单克 隆抗体均为 IgG1 型。 0049 实施例 5 ： 抗 GLIPR-2 单克隆抗体特异性及效价检测 说 明 书 CN 102876637 A 5 4/4 页 6 0050 1、 特异性检测 0051。
21、 采用常规的 Western Blot 印迹测定抗体纯度， 操作步骤参见 分子生物学基本实 验技术 （赵亚力， 马学斌， 韩为东主编） ， 一抗为本发 明腹水纯化后的抗 GLIPR-2 单克隆抗 体， 二抗为羊抗鼠 IgG/HRP， ECL 试剂盒。 0052 结果显示， 抗 GLIPR-2 单克隆抗体可特异性识别分子量为 17KD 的抗 GLIPR-2 蛋 白。 0053 2、 ELISA 法效价检测 0054 按照常规 ELISA 法进行检测， 结果显示， 直接培养的上清可达 1 ： 2000， 小鼠腹水可 达 10mg/mL， 效价可达 1 ： 10000。 0055 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102876637 A 6 。