技术领域
本发明属于环境检测领域，具体涉及一种应用贻贝检测水体污染物的方法。
背景技术
水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物的统称，如鱼类、虾类、蟹类等。 我国既是水产品生产大国，同时也是消费大国。水产品的质量安全不仅关系着 我国人民的生活健康，也影响着水产品行业的发展，因此对水产品的质量安全 检测具有重要意义。随着农、兽药的滥用及环境污染的日益加剧，生物体持续 暴露在多种污染物交叉的环境中，造成了其同时遭受多种污染的现象。目前， 对水产品中有毒有害物质的常规检测是各种化学手段，但其只能针对部分有毒 有害物质进行检测，并且对被生物体吸收代谢转化成的次级代谢产物无法检测， 同时还可能由于漏检某种有毒有害物质而产生严重后果。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用贻贝检测养殖水体中污染物的方法，即采用贻 贝体内谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。
本发明的检测养殖水体中污染物的方法，包括如下的步骤：
1)从贻贝肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成 cDNA；
2)用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，所述的引物 为引物的序列信息如下：
正向引物Y1：atagagcaacctagactggac(SEQ ID NO:1)、
反向引物Y2：gaaccagtgtgttactctctt(SEQ ID NO:2)、
设计的内参的序列信息如下：
内参正向引物YG1：cagaaggaaatcacagcacttg(SEQ ID NO:3)、
内参反向引物YG2：gtccatgttaccaagcacga(SEQ ID NO:4)；
为了提高检测的灵敏度，正向引物的序列改造为ctagagcatgctagactgcag(SEQ ID NO:5)；
3)通过对谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。
所述的污染物，可以是农兽药、PAH、PCB、毒素、重金属、环境内分泌物。
更具体的，所述的污染物为孔雀石绿、溴氰菊酯、多氯联苯。
本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。 且验证实验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒 的有机溶剂和标准品，对操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染； 缩短了检测时间，降低了检测成本，有效地提升了实验室的检测能力。通过该 项目的深入研究，可建立与国际接轨的食品安全生物检测体系。
附图说明
图1：贻贝在受到孔雀石绿污染时GSTs基因表达量随孔雀石绿浓度变化的 表达图。经查阅文献得知，水中孔雀石绿在0.03mg/L就就有较好的杀菌效果， 因此，本实验组的给药浓度依次设定为5、10、20、30和40μg/L，对照组为同 样条件下不添加孔雀石绿养殖的贻贝。由图可知，随着给药浓度的增大，贻贝 GSTs基因相对表达量也随之明显增加，仅在5μg/L浓度时其相对表达量就达 1.3倍，变化明显；其在在30μg/L和40μg/L浓度时相对表达量持平，说明酶 的表达在高浓度孔雀石绿中可能会受到抑制。
图2：贻贝在受到溴氰菊酯污染时GSTs基因表达量随溴氰菊酯浓度变化的 表达图。经查阅相关资料，实验组在溴氰菊酯经口给药浓度10mg/L时，72h后， 鲢鱼死亡，本实验选定在养殖水体中溴氰菊酯的给药浓度分别选择了1、2、4、 6和8mg/L，对照组为同样条件下不添加溴氰菊酯养殖的贻贝。由图看出：随着 给药浓度的增大，贻贝GSTs基因相对表达量也随之增加，并表现出对溴氰菊酯 敏感，其GSTs基因相对表达量在8mg/L时高了1.8倍多；其在4mg/L、6mg/L 和8mg/L浓度时表达量趋于平稳，说明该酶在这个浓度下开始趋于饱和。
图3：贻贝在受到多氯联苯污染时GSTs基因表达量随多氯联苯浓度变化的 表达图。经过文献查阅，鱼的LD50为PCBs 1-10μg/kg，96h；5μg/L，45d。 本实验选定了在养殖水体中的给药浓度分别为0.1、0.5、1和2μg/L，对照组为 同样条件下不添加多氯联苯养殖的贻贝。由图看出：随着给药浓度的增大，GSTs 基因相对表达量也随之增加，其中，在PCBs浓度达2μg/L时，贻贝高了2.2倍； 尤其值得一提的是，在PCBs浓度为0.1μg/L时，鲢鱼中GSTs基因相对表达量 时就高了1.3倍，这说明鲢鱼的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感，GSTs非常适 合作为一种生物标志物来监测环境中PCBs存在情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述
实施例1
1、从贻贝肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成 cDNA；
材料：
贻贝肝脏；RNA提取试剂盒，RNAprep pure Tissue Kit，Tiangen；反转录 Prime Script RT试剂盒：TaKaRa，日本；移液器；一次性注射器；方盘；镊子； 手术剪；培养皿；1.5mL离心管。
试剂材料
95％的RNase-free乙醇；0.1％DEPC处理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNA dilution Buffer；SV RNA Wash Solution；Yellow core Buffer；MnCl20.09M；DNase Ⅰ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water；琼脂糖；10×TAE电泳缓冲液 (40m MTris，20mM NaAc，1mM EDTA PH 8.0)；载体缓冲液(0.25％溴酚蓝， 30％甘油)；溴化乙锭水溶液(10mg/mL)。
由于RNA容易被降解，整个提取过程中要严格防止RNA酶的污染。提取 过程用到的玻璃容器、EP管等样品需要用0.1％(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC: diethypyrocarbonate)浸泡处理。实验中用的微量移液器需要用75％的消毒酒精 对表面进行消毒，超净台也要擦拭干净，用消毒酒精消毒后，进行紫外灭菌30 min以上。提取过程中，要带口罩和一次性PE手套，实验过程需要勤换手套， 严防RNA酶污染。
肝脏中RNA的提取
本次实验采用天根生化科技有限公司的RNAprep pure动物组织总RNA提 取试剂盒，对贻贝的肝脏RNA提取。
具体步骤如下：
(1)分离贻贝的肝脏组织，分别取50mg样品于离心管中，加入175μl SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器将组织压碎、反复抽打混匀。#
(2)加350μl SV RNA Dilution Buffer(蓝色)，翻转管子3-4次混匀，置 70℃水浴3min。
(3)冰上冷却1-2秒，14000rpm离心10min，上清液移入一新离心管。
(4)加入200μl 95％的乙醇，枪头混匀。
(5)将上述混合液移入Spin Basket Assembly，14000rpm离心1min，弃滤 液。
(6)加入600μl SV RNA Wash Solution(with ethand added)，14000rpm离 心1min，弃滤液。
(7)在一新离心管中配制DNase incubation mix：
Yellow Core Buffer 40μl
MnCl20.09M 5μl
DNase Ⅰ 5μl
(8)将上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上，室温(20-25℃)保 育15min。
(9)加200μl SV DNase Stop Solution(with ethand added)至Spin Basket 14000rpm，离心1min。
(10)加600μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。
(11)加250μl SV RNA Wash Solution，14000rpm离心2min，将Spin Basket 转移到一新离心管中。
(12)加50μl Nuclease-Free Water至膜上，14000rpm离心1min，溶解RNA， -80℃保存。
(13)取5μl RNA样品，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
2、RNA质量检测
琼脂糖凝胶电泳测定
(1)将制胶用具用70％乙醇冲冼一遍，晾干备用。
(2)配制琼脂糖凝胶：
称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉 内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70℃，依次向其中加入9mL甲醛、 5ml 10x MOPS缓冲液和0.5μL溴化乙锭，混合均匀。
(3)准备RNA样品
取DEPC处理过的500μL小离心管，依次加入如下试剂：10x MOPS缓冲 液2uL，甲醛3.5μL,甲酰胺(去离子)10μL，RNA样品4.5μL,混匀。将离心 管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。向管中加入3μL上样染料， 混匀。
(3)上样，电泳；电泳条件为0.5×TAE电泳缓冲液、琼脂糖1.2％、150V， 15min。因为细胞中的RNA主要是rRNA，其含量为70％～80％，所以电泳检 测到的主要是rRNA条带。电泳结果表明rRNA条带非常明显，28S rRNA条带 和18S rRNA条带亮度很清楚，而5.8S rRNA条带则相对较弱，且在18S和28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型 RNA组成。电泳检测说明提取的RNA完整性较好。
利用紫外分光光度计检测了提取RNA的纯度。一般来讲，检测RNA的纯 度可以通过OD260nm/OD280nm比值来反映，高质量RNA的OD260nm/OD280nm比值在 1.8～2.1之间，而比值较小则提取的RNA不纯，表明有蛋白质的污染。测定结 果表明，提取的RNA的OD260nm/OD280nm为1.9，表明RNA纯度较好。
3、反转录合成cDNA
1)以提取的mRNA为模板，利用反转录Prime Script RT试剂盒反转录合 成cDNA。
构建10μL的反应体系：
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
反转录程序为：37℃，15min进行反转录，85℃，5s灭活酶反应。制备 的cDNA放置于-80℃冰箱保存。
2)引物设计
通过NCBI获得不同来源贻贝的谷胱甘肽S转移酶(GSTs)基因序列，利用 序列分析软件Clustal X进行同源性比较，在同源性最高的区域设计PCR扩增用 引物，并利用Primer Premier 5.0生物软件中的引物分析功能对所设计引物进行各 项参数的具体分析，最终确定本发明扩增用的引物组，并进一步以其为核心制 备检测试剂盒。而且，为了防止假阴性，选用基因表达水平受环境因素影响较 小的β-actin基因作为内参。β-actin基因在个体各个生长阶段的大多数几乎全部 组织中持续表达或变化很小，这种管家基因的表达只受启动序列或启动子与 RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。所以，选择β-actin的基因 作为荧光定量PCR的内参。
所设计的引物的序列信息如下：
GSTs正向引物L1：ccgttaggacgtcatgtaacgtc(SEQ ID NO:1)、
GSTs反向引物L2ccaggtgagtgtgccttca(SEQ ID NO:2)、
设计的内参的序列信息如下：
LG1：gagaggtatcctgactctg(SEQ ID NO:3)、
LG2：gacttagcactgtgtgtacc(SEQ ID NO:4)。
3)荧光定量PCR检测引物的效果
利用SYBR Green PCR Master Mix(Tiangen)试剂盒，在ABI 7500System上 进行荧光定量PCR。
反应体系为：
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
PCR反应条件
将配制好的β-actin内参和待测样品的PCR反应溶液置于PCR仪上进行扩增反 应。每个样品放3个孔，目的基因和内参基因同时扩增。采用两步法进行荧光定 量PCR：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s，40个循环。反应结束后进 行溶解曲线分析，从而检验退火温度是否适宜，产物中是否含有引物二聚体。得 到扩增曲线。结果表明扩增曲线的整体平行性较好，曲线拐点清楚，基线平而无 上扬现象。各管的扩增曲线平行性较好，表明扩增效率相近，可以用来进行荧光 定量PCR，分析基因的表达水平。
扩增溶解曲线反映出实时荧光定量PCR的扩增特异性，如果每条溶解曲线只 有一个峰，表明扩增的特异性较好，如果有两个或者多个峰，则表明荧光定量PCR 过程中存在非特异扩增。扩增结果表明基因的溶解曲线的只有一个峰，这表明基 因的特异性扩增效果较好，可以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。
对引物的灵敏度进行了检测，具体步骤如下：
1)将制备好的cDNA分别稀释成100ng/μL、50ng/μl和10ng/μL。
2)构建50μL PCR反应体系，分别以100ng、50ng和10ng为模板进行反应， 电泳检测。
3)电泳结果发现：cDNA模板浓度为100ng、50ng和10ng的电泳扩增条带 清晰，且电泳图下方没有二聚体出现，说明该实验设计的引物灵敏度和特异性都 很好，能够很好的满足实验要求。
4)引物的优化
为了提高检测的灵敏度，将GSTs正向引物L1的个别碱基进行修改优化后， 得到了新的引物序列ctagagcatgctagactgcag(SEQ ID NO:5)；按照上述的特异性和 灵敏性检测步骤进行对比分析，结果发现：相比于未优化前的引物扩增10ng cDNA模板，扩增条带更清晰明显。而且，在同样条件下，优化前的引物并不能 从浓度7ng的cDNA样品中扩增出产物，而优化后的产物能扩增出最低浓度为7ng 的cDNA样品，且没有引物二聚体的出现，说明优化后的引物能够显著提高灵敏 度，且特异性没有收到任何影响。
实施例2对孔雀石绿的检测
孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，在动物体 内能长期残留，通过代谢进入人和动物的机体后，可以通过生物转化，还原代 谢成为脂溶性的无色孔雀石绿，严重危害人类健康。许多国家都将孔雀石绿列 为水产养殖禁用药物。1992年，加拿大就禁止其作为渔场杀菌剂。美国规定在 食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿。2002年6月，欧盟颁布法令 禁止在渔场中使用孔雀石绿。英国食品标准局认为孔雀石绿是一种对人体有极 大副作用的化学制剂，任何鱼类都不允许含有此类物质，并且这种化学物质不 应该出现在任何食品中。2002年5月，我国农业部已将孔雀石绿列入《食品动 物禁用的兽药及其化合物清单》，孔雀石绿在水生食品动物中被禁止使用。
将贻贝暴露于5、10、20、30和40μg/L不同浓度的孔雀石绿中，其在72h内 GSTs相对表达量增长较快，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能与孔 雀石绿已经降解有关。
本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与液相色谱质谱检测孔雀石绿含量 的结果比较。
在5μg/L孔雀石绿浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着孔雀石绿浓 度增高，GSTs表达量也随之增高，而在5μg/L这个浓度下，采用液相色谱-质谱 的检测方法(《GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》)结果 显示，在同样条件下，贻贝中并未检测到孔雀石绿的存在，原因是孔雀石绿残留 在体内的含量不足以检出(孔雀石绿的液相色谱-质谱检测限为0.1μg/L)。在20 μg/L孔雀石绿浓度下，贻贝肉中孔雀石绿的含量检测结果仅为3.5ppb，而GSTs 基因的表达显著提高，增量接近1.7倍(如图1)。由此看见，针对水产品中的孔 雀石绿来讲，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。
实施例3：暴露于溴氰菊酯中的检测
以溴氰菊酯为代表的拟除虫菊酯类农药对鱼高毒，因此在我国有相关的规 定，菊酯类农药禁止在水田中使用，但菊酯类农药的使用，通过环境的转移， 水环境不可避免地受到农药的影响和危害，对水产品造成污染。
将贻贝暴露于1、2、4、6和8mg/L不同浓度的溴氰菊酯中，其在72h内GSTs 相对表达量急剧增多，而在72h之后表达量增长缓慢，相对平稳，可能在溴氰菊 酯的诱导下该酶和底物的结合开始趋于饱和。
本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测溴氰菊酯含量 的结果比较。
在1mg/L溴氰菊酯浓度下，其GSTs基因表达已有显著增高，随着溴氰菊酯浓 度增高，GSTs表达量也随之增高，在8mg/L时其相对表达量已高达1.8倍之多(如 图2)；而在1mg/L这个浓度下，采用《SFB/T 0120-2006食品中251种农药残留测 定方法气相色谱法-质谱检测法》结果显示，在同样条件下，贻贝中并未检测到 溴氰菊酯的存在，原因是溴氰菊酯残留在体内的含量不足以检出(溴氰菊酯的气 相色谱-质谱检测限为10μg/L)。在4mg/L溴氰菊酯浓度下，贻贝肉中溴氰菊酯 的检测含量仅为35.9μg/L，而GSTs基因的表达显著提高，增量约为1.6倍。由此 看见，针对水产品中的溴氰菊酯来讲，本发明方法的灵敏度要高于化学检测方法。
实施例4对多氯联苯的检测
多氯联苯是首批列入“关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约“(简称《斯 德哥尔摩公约》或《POPs公约》)受控名单的12种持久性有机污染物(POPs) 之一。自上世纪70年代起世界各国规定禁止生产和使用PCBs，但它与常规污 染物不同，其化学性质很稳定，在自然界中难于降解，多存在于土壤、河流底 泥中，其持久性的存在长期对水产品造成污染，对人类的主要危害是会引起癌 变或畸变。
将贻贝暴露于0.1、0.5、1和2μg/L不同浓度的多氯联苯中，其在120h之内一 直呈现上升趋势，说明PCBs一直在诱导GSTs表达，其在体内蓄积并难以代谢， 导致其GSTs酶一直处于超表达状态。
本例实施了其GSTs基因转录表达的情况与气相色谱质谱检测多氯联苯含量 的结果比较。
在0.1μg/L多氯联苯浓度下，其GSTs基因表达已有显著提高至1.3倍，随 着多氯联苯浓度增高，GSTs表达量也随之增高，在2μg/L时其相对表达量已高 达2.2倍之多(如图3)；而在0.1μg/L这个浓度下，采用《GB/T 5009.190-2006 食品中指示性多氯联苯含量的测定》结果显示，以PCB180为例，在同样条件下， 贻贝肉中PCB180也有检出，但浓度很低(多氯联苯的气相色谱-质谱检测限为 0.05μg/L)；在1μg/L的PCBs浓度下，贻贝肉中PCB180的检测含量仅为0.67 μg/L，而GSTs基因的表达显著提高，增量为1.8倍。
由此可见，贻贝的GSTs对PCBs的诱导反应很敏感，GSTs非常适合作为一种 生物标志物来监测环境中PCBs存在情况，本发明方法的灵敏度要高于化学检测 方法。
在送检蛤蜊样品中，实验室按照SFB/T 0120-2006方法检测，检出蛤蜊肉中 溴氰菊酯含量为29.7ppb；采用GSTs基因转录表达差异的方法，发现其GSTs基因 的表达量是阴性样品GSTs基因的1.7倍，差异显著，判断为受污染样品。本方法 应用于实验室的实际检测完全可行，且灵敏度更高，不会受到基质的干扰。