相关申请
此申请是以37CFR1.53(b)(1)提交的非临时申请，以35USC119(e) 要求对2008年12月23日提交的临时申请号61/140565的优先权，其内容 在此处引入作为参考。
发明领域
本发明大体上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及具有改变 的生物学特性的IgG免疫球蛋白变体和使用其的方法。
发明背景
多年以来，免疫球蛋白作为治疗剂的使用已显著增加。构成免疫系统 的重要部分的免疫球蛋白(Ig)分子引起了人们的很大兴趣，因为它们(1) 与多种配体家族反应，(2)具有不同的效应子功能和(3)具有很大的生 物学重要性。目前基于抗体的药物的使用包括癌症、自身免疫性疾病和多 种全身性和感染性疾病的治疗。并且，免疫球蛋白作为体内诊断工具是有 用的，例如在诊断成像程序中。
IgG是在人和其他哺乳动物中最普遍存在的免疫球蛋白类型并应用于 多种免疫疗法和诊断程序中。人IgG1是用于治疗目的的使用最普遍的抗体。 活跃研究的一个领域是针对病原体包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗体。尽管具有潜力，靶向金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白疗法 的问题之一是抗体与金黄色葡萄球菌蛋白A的结合。已研究了IgG和蛋白 A的结合并已鉴定了IgG与蛋白A和FcRn二者结合相关的位置(见例如 Riechmann&Davies，J.BiomolecularNMR6：141-52(1995)，Artandi等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：94-98(1992)，WO93/22332)。展 示与蛋白A结合改变的修饰的免疫球蛋白将是有利的。本发明满足了这些 和其他需求，这在以下公开的综述中将是显而易见的。
发明概述
本发明提供了新的IgG变体及其用途。在本发明中提供了多种IgG变 体。
在一个方面，本发明提供了包含人IgGVH区的变体IgG，所述人IgGVH区包含相对野生型人IgGVH区在根据如Kabat中的EU索引编号的17，19， 57，66，70，79，81，82a，82b位氨基酸残基中的一个或多个上的一种或 多种氨基酸取代，其中所述变体IgG具有与金黄色葡萄球菌蛋白A的改变 的结合。在一些实施方案中，变体IgG具有与蛋白A的增强的结合，例如 具有包含相对野生型人IgGVH区在70，79和82b位氨基酸残基中的一个 或多个上的一种或多种氨基酸取代(例如S70A，Y79A或S82bA)的IgGVH区的变体IgG。在一些实施方案中，变体IgG具有与蛋白A的降低的结合， 例如具有包含相对野生型人IgGVH区在17，19，57，66，81和82a位氨 基酸残基中的一个或多个上的一种或多种氨基酸取代(例如S17A，R19A， T57A，T57K，R66A，Q81A或N82aA)的IgGVH区的变体IgG。在一些实施 方案中，变体IgG为人或人源化IgG。在一些实施方案中，变体IgG为IgG1， IgG2，IgG3或IgG4。在一些实施方案中，变体IgG与蛋白A以外的金黄色 葡萄球菌蛋白结合。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的变体 IgG和可药用的载体的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包 含在容器中的本发明的变体IgG及其使用说明的试剂盒。
通过以下详述、图和权利要求书，本发明的其他特征和优势将是显而 易见的。
本文描述的任意实施方案或其任意组合应用于本文描述的本发明的任 意和所有变体IgG和方法。
附图简述
图1和2显示了变体抗-Her2Fab与Her2的结合的ELISA。
图3和4显示了变体抗-Her2Fab与蛋白A的结合的ELISA。
发明详述
本发明涉及新的IgG结构域变体，包括在具有与金黄色葡萄球菌蛋白 A的改变的结合的抗体和融合蛋白中发现的那些。这些变体包含与蛋白A 结合的包含相对野生型人IgGVH区一种或多种氨基酸修饰的人IgGVH区或 其片段，所述修饰改变其对蛋白A的亲和力。
本文描述的或参考的技术和程序是本领域技术人员通常熟知的和使 用传统方法学普遍应用的，例如在Sambrook等人，MolecularCloning：A LaboratoryManual第三版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress， ColdSpringHarbor，N.Y.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F. M.Ausubel，等人eds.，(2003))；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY (AcademicPress，Inc.)：PCR2：APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson， B.D.HamesandG.R.Tayloreds.(1995))，HarlowandLane，eds.(1988) ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL，andANIMALCELLCULTURE(R.I. Freshney，ed.(1987))；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，ed.， 1984)；MethodsinMolecularBiology，HumanaPress；CellBiology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis，ed.，1998)AcademicPress；Animal CellCulture(R.I.Freshney)，ed.，1987)；IntroductiontoCelland TissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts，1998)PlenumPress； CellandTissueCulture：LaboratoryProcedures(A.Doyle，J.B. Griffiths，andD.G.Newell，eds.，1993-8)J.WileyandSons； HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandC.C.Blackwell， eds.)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Millerand M.P.Calos，eds.，1987)；PCR：ThePolymeraseChainReaction，(Mullis 等人，eds.，1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan 等人，eds.，1991)；ShortProtocolsinMolecularBiology(Wileyand Sons，1999)；Immunobiology(C.A.JanewayandP.Travers，1997)； Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：APracticalApproach(D. Catty.，ed.，IRLPress，1988-1989)；MonoclonalAntibodies：A PracticalApproach(P.ShepherdandC.Dean，eds.，OxfordUniversity Press，2000)；UsingAntibodies：ALaboratoryManual(E.Harlowand D.Lane(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999)；TheAntibodies (M.ZanettiandJ.D.Capra，eds.，HarwoodAcademicPublishers，1995)； 和Cancer：PrinciplesandPracticeofOncology(V.T.DeVita等人， eds.，J.B.LippincottCompany，1993)中描述的被广泛应用的方法学。
除非另外定义，本文使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域普 通技术人员通常理解的术语相同的含义。Singleton等人，Dictionaryof MicrobiologyandMolecularBiology第二版，J.Wiley&Sons(NewYork， N.Y.1994)，和March，AdvancedOrganicChemistryReactions， MechanismsandStructure第四版，JohnWiley&Sons(NewYork，N.Y. 1992)为本领域技术人员提供了在本申请中使用的许多术语的一般指导。
本文引用的所有参考包括专利申请和公开，以其整体引入作为参考。
定义
用于解释此说明书的目的将应用以下定义，在任何适当的情况下，以 单数使用的术语也包括其复数，反之亦然。应当理解本文使用的术语仅仅 是为了描述特定实施方案，而无意为限制性的。当以下阐明的任意定义与 本文引入作为参考的任意文件有矛盾时，应当采用以下阐明的定义。
在本说明书和权利要求书通篇中，在免疫球蛋白重链中的残基编号为 如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 五版PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda， Md.(1991)中的EU索引中的编号。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU 抗体的残基编号。
如此处描述的“亲本多肽”或“野生型多肽”是指未修饰的多肽，天 然存在的多肽或天然存在多肽的基因工程修饰版本，其缺乏本文公开的一 种或多种氨基酸修饰，且与本文公开的变体蛋白质相比在结合蛋白A中有 差异。亲本多肽可包含天然序列VH区或具有早已存在的氨基酸序列修饰(例 如添加、缺失和/或取代)的VH区。亲本多肽可还包含如下所述的非天然 氨基酸。亲本多肽可指多肽自身，包含亲本多肽的组合物，或编码其的氨 基酸序列。亲本多肽包括但不限于亲本免疫球蛋白、野生型免疫球蛋白、 亲本抗体和野生型抗体。
由此，如此处描述的“亲本免疫球蛋白”、“亲本IgG”、“野生型 免疫球蛋白”或“野生型IgG”是指未修饰的免疫球蛋白，天然存在的免 疫球蛋白，或缺乏本文公开的一种或多种氨基酸修饰的、与本文公开的变 体IgG相比在结合蛋白A中有差异的天然存在免疫球蛋白的基因工程修饰 版本。亲本免疫球蛋白包含天然序列VH区或具有早已存在的氨基酸序列修 饰(例如添加、缺失和/或取代)的VH区。亲本免疫球蛋白可还包含如下 所述的非天然氨基酸。亲本免疫球蛋白可指免疫球蛋白自身，包含亲本免 疫球蛋白的组合物，或编码其的氨基酸序列。
如此处描述的“亲本抗体”或“野生型抗体”是指未修饰的抗体，天 然存在的抗体或缺乏本文公开的一种或多种氨基酸修饰、与本文公开的变 体IgG相比在结合蛋白A中有差异的天然存在抗体的基因工程修饰版本。 亲本抗体包含天然序列VH区或具有早已存在的氨基酸序列修饰(例如添加、 缺失和/或取代)的VH区。亲本抗体可还包含如下所述的非天然氨基酸。 亲本抗体可指抗体自身，包含亲本抗体的组合物，或编码其的氨基酸序列。
如此处描述的“变体”、“变体蛋白质”或“蛋白质变体”是指由于 至少1个氨基酸修饰与亲本蛋白质有差异的蛋白质。蛋白质变体可指蛋白 质自身，包含蛋白质的组合物，或编码其的氨基酸序列。在某些实施方案 中，蛋白质变体与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如从约1个 至约10个氨基酸修饰。本文的蛋白质变体序列将优选地具有与亲本蛋白质 序列至少约80％的同源性，最优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％ 的同源性。蛋白质变体可还包含非天然氨基酸，如下所述。术语“蛋白质 变体”包括如此处描述的免疫球蛋白变体和抗体变体。
如此处描述的术语“免疫球蛋白变体”、“变体免疫球蛋白”、“变 体IgG”或“IgG变体”是指由于至少1个氨基酸修饰与亲本或野生型免疫 球蛋白序列有差异的免疫球蛋白序列。
如此处描述的“抗体变体”或“变体抗体”是指由于至少1个氨基酸 修饰与亲本抗体有差异的抗体。在某些实施方案中，变体抗体相对野生型 抗体在VH区中具有一个或多个氨基酸修饰。在某些实施方案中，变体抗体 为变体IgG。
如此处描述的“位置”是指在蛋白质序列中的位置。位置可顺序编号， 或根据已建立的格式，例如如Kabat中的EU索引。
“氨基酸修饰”指预先确定的氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。示 例性修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，氨基酸修 饰为取代。
“在”特定位置例如Fc区的“氨基酸修饰”指特定残基的取代或缺 失，或与特定残基相邻的至少一个氨基酸残基的插入。与特定残基“相邻 的”插入是指在其1个至2个残基中插入。插入可在特定残基的N-端或C- 端。
“氨基酸取代”指用另一个不同的“替换”氨基酸残基替换预先确定 的氨基酸序列中的至少一个现存的氨基酸残基。替换残基可为“天然存在 氨基酸残基”(即由遗传密码编码)和选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)； 天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸 (Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸 (Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸 (Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。本文的氨基酸取代定 义也包含用一个或多个非天然存在氨基酸残基的取代。
“非天然存在氨基酸残基”指除了上面所列的那些天然存在的氨基酸 残基以外的残基，其能够在多肽链中与相邻的氨基酸残基共价结合。非天 然存在氨基酸残基的示例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和 例如在Ellman等人Meth.Enzym.202：301-336(1991)；美国专利号 6,586,207；WO98/48032；WO03/073238；美国公开号2004-0214988A1；WO 05135727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人，(2002)，Journalofthe AmericanChemicalSociety124：9026-9027；J.W.Chin，&P.G.Schultz， (2002)，ChemBioChem11：1135-1137；和J.W.Chin，等人，(2002)，PICAS UnitedStatesofAmerica99：11020-11024中所描述的其他氨基酸残基 类似物。
在某些实施方案中，术语“降低”、“降低蛋白A结合”、“减少” 或“减少蛋白A结合”指通过例如本文描述的标准本领域方法检测的相比 野生型IgG或具有野生型人IgGFc区的IgG，本发明的变体IgG与蛋白A 结合的25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，97％，或 99％的总体降低。在某些实施方案中这些术语可选地可指10倍(即1对数)， 100倍(2对数)，1,000倍(或3对数)，10,000倍(或4对数)，或100,000 倍(或5对数)的总体降低。类似的，术语“增加”、“增加蛋白A结合” 等等指通过例如本文描述的标准本领域方法检测的相比野生型IgG或具有 野生型人IgGFc区的IgG，本发明的变体IgG与蛋白A结合的2倍、3倍、 4倍、5倍、10倍、100倍或1,000倍的总体增加。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并具体包括单克隆抗体(包括 全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体) 和抗体片段，只要它们展示预期的生物学活性。
“分离的”抗体或其他多肽为已被鉴定的并从其天然环境成分中分离 和/或回收的抗体或多肽。其天然环境的污染成分为可能影响抗体的研究、 诊断或治疗用途的物质，并可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。 在某些实施方案中，将抗体或其他多肽纯化至(1)如通过例如Lowry法测 定的大于以重量计95％的抗体或其他多肽，在一些实施方案中，大于以重 量计99％；(2)通过使用例如自旋转杯式测序仪(spinningcupsequenator) 足够获得N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)通过 SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用例如考马斯亮蓝或银染为单一的。分 离的抗体或其他多肽包括在重组细胞中的原位抗体或多肽，因为其天然环 境的至少一种成分将不存在。然而通常通过至少一个纯化步骤制备分离的 抗体或其他多肽。
“天然抗体”通常为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由2条 相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链组成。每条轻链通过共价二硫键 与一条重链连接，然而在不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数目不 同。各条重链和轻链也具有有规律地间隔的链内二硫键。各条重链在一端 具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。各条轻链在一端具有可 变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的 第一个恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认 为特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”指相对免疫球蛋白的包含抗原结合位点的另一个 部分可变结构域具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定 结构域包含重链的CH1，CH2和CH3结构域和轻链的CHL结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基末端 结构域。重链的可变结构域可被称为“VH”。轻链的可变结构域可被称为 “VL”。这些结构域通常是抗体的最多变部分并包含抗原结合位点。
术语“可变”指下述事实，即在不同抗体中可变结构域的某些部分序 列差异很大，这些部分用于各个特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。 然而，可变性在抗体的整个可变结构域中不是平均分布的。在轻链和重链 可变结构域二者中其集中在3个被称为高变区(HVR)的区段。可变结构域 的高度保守部分被称为框架区(FR)。天然的重链和轻链的可变区分别包 含4个FR区，其大多采用β-片层构象，通过3个HVR连接，HVR形成环 连接β-片层结构并有时形成β-片层结构的部分。在各个链中的HVR通过 FR区紧密联系在一起，并且与来自其他链的HVR一起作用于抗体的抗原结 合位点的形成(见Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunological Interest，第五版，NationalInstituteofHealth，Bethesda，MD (1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展示了多种效应 子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性中的抗体的参与。
来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)“轻链”可基于其恒定 结构域的氨基酸序列被归为2种截然不同的被称为κ和λ的类型之一。
如此处描述的术语IgG“同种型”或“亚型”是指由其恒定区的化学 和抗原特征定义的免疫球蛋白的任意亚型。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可被归 为不同的类型。有5种主要的免疫球蛋白类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM， 它们中一些可进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应不同免疫球蛋白类型的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ 和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是熟知的并通常描述于 例如Abbas等人CellularandMol.Immunology，第四版(W.B.Saunders， Co.，2000)。抗体可为更大的融合分子的部分，所述融合分子通过抗体和 一种或多种蛋白质或肽的共价或非共价连接形成。
如此处描述的术语“IgG亚型修饰”是指将一种IgG同种型的一个氨 基酸转变为不同的对齐的IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如， 因为IgG1在EU296位包含酪氨酸，IgG2在EU296位包含苯丙氨酸，认为 在IgG2中的F296Y取代是IgG亚型修饰。
如此处描述的“非天然存在修饰”是指不是同种型的氨基酸修饰。例 如，因为没有一种IgG在332位包含谷氨酸，认为在IgG1，IgG2，IgG3或 IgG4中的332位使用谷氨酸(332E)的取代是非天然存在修饰。
本文中可互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体” 指以其基本上完整的形式的抗体。所述术语特别指具有包含Fc区的重链的 抗体。抗体的C-端赖氨酸(根据EU编号系统的447位残基)可能被去除， 例如在抗体的纯化中去除或通过编码抗体的核酸的重组改造。具有或不具 有此C-端赖氨酸的抗体为“全长”、“完整的”或“完全的”，或如本文 使用的这些术语。
用于本文的目的，“裸露的抗体”为不与细胞毒性部分或放射性标记 物缀合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选包含其抗原结合区。在某些 实施方案中，抗体片段包含Fc区或包含一个或多个本文公开的Fc区修饰 的Fc区的部分。抗体片段的示例包括Fab，Fab’，F(ab’)2和Fv片段； 双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段，将其称为“Fab” 片段，每个片段具有单抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了 其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有2个抗原结 合位点并仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中， 双链Fv种类由紧密非共价连接的一条重链和一条轻链的可变结构域二聚 体组成。在单链Fv(scFv)种类中，可通过易弯曲的肽接头共价连接一条 重链和一条轻链的可变结构域使轻链和重链可连接为与双链Fv种类中的 二聚体类似的“二聚体”结构。在此构象中各个可变结构域的3个HVR相 互作用以形成在VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。6个HVR共同赋予抗 体的抗原结合特异性。然而，仅单个可变结构域(或仅包含3个特异性针 对抗原的HVR的半个Hv)就具有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合 位点的亲和力较低。
Fab片段包含重链和轻链可变结构域并也包含轻链的恒定结构域和重 链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差异在于在重链 CH1结构域的羧基端加入少量残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或 多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对下述Fab’的名称，其中恒定结构域 的半胱氨酸残基具有游离的硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初由一对彼此间 具有铰链半胱氨酸的Fab’片段产生。其他抗体片段的化学偶联也是已知 的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些 结构域存在于单条多肽链中。通常scFv多肽另外包含在VH和VL结构域之 间的多肽接头，其使scFv形成用于抗原结合的期望结构。scFv的综述见 例如Pluckthün，inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol. 113，RosenburgandMooreeds.，(Springer-Verlag，NewYork，1994)， pp.269-315。
术语“双抗体”指具有2个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含 与在相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域 (VH)。通过使用太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对的接头， 结构域被强制与另一条链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点。双 抗体可为双价的或双特异性的。在例如EP404,097；WO1993/01161； Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)中更充分地描述了双抗体。 在Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中也描述了三链抗体和四 链抗体。
如此处描述的术语“单克隆抗体”指从基本上单一的抗体群体得到的 抗体，即组成群体的单个抗体除了可能的突变例如可能以极低量存在的天 然发生的突变以外为相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不 是不同抗体的混合物。在某些实施方案中，这些单克隆抗体通常包括包含 结合靶的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过包括从多种多肽序列 中选择单个靶结合多肽序列的方法得到。例如，选择方法可为从多个克隆 例如杂交瘤细胞克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆库中选择单一克隆。应 当理解选择的靶结合序列可进一步被改变，例如以改进对靶的亲和力，人 源化靶结合序列，改进其在细胞培养物中的生产，降低其体内免疫原性， 产生多特异性抗体等等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是此发明的 单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗 体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。 除了其特异性以外，单克隆抗体制剂的优势在于其通常不被其他免疫球蛋 白污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上单一的抗体群体得到， 不应被理解为需要通过任意特定方法产生抗体。例如，依照本发明使用的 单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如杂交瘤细胞方法(例如Kohler 和Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma，14 (3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies：ALaboratoryManual， (ColdSpringHarborLaboratoryPress，第二版1988)；Hammerling等 人，in：MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681 (Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA方法(见例如美国专利号4,816,567)， 噬菌体展示技术(见例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)； Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol. Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)： 1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)： 12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)： 119-132(2004))，和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫 球蛋白序列的基因的动物中产生人或类人抗体的技术(见例如WO 1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits等人， Nature362：255-258(1993)；Bruggemann等人，YearinImmunol.7：33 (1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126； 5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology10：779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnol.14：845-851 (1996)；Neuberger，NatureBiotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg 和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与来源于特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一种物种或属于另一种抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们展示预期的生物学活性(见例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用目的抗原免疫猕猴(macaquemonkey)产生的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白 的最少序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白 (受体抗体)，其中来自受体HVR的残基被具有预期特异性、亲和力和/ 或能力的来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的 HVR残基替换。有时，人免疫球蛋白的FR残基被对应的非人残基替换。此 外，人源化抗体可包含在受体抗体或在供体抗体中没有发现的残基。可进 行这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部 的至少一个和通常2个可变结构域，其中高变环的全部或基本上全部对应 非人免疫球蛋白的高变环，FR的全部或基本上全部为人免疫球蛋白序列的 FR。人源化抗体任选地将还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫 球蛋白Fc的至少一部分。进一步的详情见例如Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。又见例如Vaswani 和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)； Harris，Biochem.Soc.Transactions23：1035-1038(1995)；Hurle和 Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321 和7,087,409。
“人抗体”是具有对应人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用如 本文公开的任意产生人抗体的技术产生的抗体。人抗体的此定义特别地排 除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术包 括噬菌体展示文库产生人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.， 227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。用于制 备人单克隆抗体还可使用的方法为Cole等人，MonoclonalAntibodies andCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerner等人，J. Immunol.，147(1)：86-95(1991)中描述的方法。又见vanDijk和vande Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过对转基因 动物施用抗原制备人抗体，所述转基因动物已被改造为在响应抗原攻击下 产生这些抗体，但其内源基因座已失效，例如免疫的异种鼠(xenomice) (见例如有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。 又见例如有关通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体的Li等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时，指序列高变的 和/或形成结构确定的环的抗体可变结构域的区域。通常抗体包含6个HVR； 3个在VH(H1，H2，H3)中，3个在VL(L1，L2，L3)中。在天然抗体中，H3 和L3在6个HVR中展示最高的多样性，特别地认为H3在赋予抗体的精细 特异性中发挥独特的作用。见例如Xu等人，Immunity13：37-45(2000)； Johnson和Wu，inMethodsinMolecularBiology248：1-25(Lo，ed.， HumanPress，Totowa，NJ，2003)。实际上，天然存在的仅由2条重链组 成的骆驼科动物抗体在缺乏轻链的情况下是有功能和稳定的。见例如 Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)；Sheriff等人， NatureStruct.Biol.3：733-736(1996)。
目前正在使用的HVR描述有多种，在此处涉及这些描述。Kabat互补 决定区(CDR)是基于序列可变性，是使用最普遍的(Kabat等人，Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest，第五版PublicHealthService， NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))。而Chothia 涉及结构环的位置(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196：901-917 (1987))。AbMHVR体现了KabatHVR和Chothia结构环的折中，并被Oxford Molecular′sAbM抗体模型软件使用。“接触”HVR是基于现有的复合晶体 结构的分析。下面注释了这些HVR中每一种的残基。
Kabat编号
Chothia编号
HVR可包含如下“扩展的HVR”：在VL中的24-36或24-34(L1)，46-56 或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和在VH中的26-35(H1)，50-65或 49-65(H2)和93-102，94-102，或95-102(H3)。在这些定义中的每一个中， 可变结构域残基根据上文的Kabat等人编号。
“框架”或“FR”为如本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残 基。
术语“如Kabat中编号的可变结构域残基”或“如Kabat中编号的氨 基酸位置”及其变化形式指在上文的Kabat等人中用于抗体汇集的重链可 变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨 基酸序列可包含对应可变结构域FR或HVR的缩短或插入的较少或另外的氨 基酸。例如，重链可变结构域可包含在H2的52位残基后的单个氨基酸插 入(根据Kabat为52a位残基)和重链FR的82位残基后的插入残基(例 如根据Kabat为82a，82b和82c位残基)。对给定抗体，可通过在抗体序 列与“标准”Kabat编号序列的同源区的比对测定残基的Kabat编号。
当涉及在可变结构域(大约是轻链的1-107位残基和重链的1-113位 残基)中的残基时通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人，Sequences ofImmunologicalInterest.第五版PublicHealthService，National InstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991))。当涉及免疫球蛋白重 链恒定区中的残基时通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如在上文 中的Kabat等人中报导的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非在本文中另外说明，提及抗体可变结构域中的残 基编号指根据Kabat编号系统的残基编号。除非在本文中另外说明，提及 抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号(见例如PCT 公开号WO2006073941)。
“亲和力成熟的”抗体为在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变 的抗体，所述改变导致与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述抗体对抗 原的亲和力的改进。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有 纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。可使用本领域已知的特定程序制备亲和力 成熟的抗体。例如，Marks等人Bio/Technology10：779-783(1992)描 述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。例如Barbas等人ProcNat. Acad.Sci.USA91：3809-3813(1994)；Schier等人Gene169：147-155 (1995)；Yelton等人J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等 人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol. 226：889-896(1992)描述了HVR和/或框架残基的随机突变。
抗体“效应子功能”指由抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列 变体Fc区)导致的那些生物学活性，并随抗体同种型而变化。抗体效应子 功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合； 抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如 B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
本文中使用术语“Fc区”定义免疫球蛋白重链的C-端区，其包括天然 序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界线可能不同，通 常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226或从Pro230的氨基酸残基至其 羧基端的一段区域。Fc区的C-端赖氨酸(根据EU编号系统为447位残基) 可能被去除，例如在抗体的产生或纯化中，或通过编码抗体重链的核酸的 重组改造。由此，完整抗体的组合物可包含去除了所有K447残基的抗体群 体，K447残基未去除的抗体群体和具有去除了K447残基和未去除K447残 基的抗体的混合物的抗体群体。在某些实施方案中，免疫球蛋白的Fc区包 含2个恒定结构域，CH2和CH3。
人IgG的“VH结构域”通常包括从约1位氨基酸至约113位的氨基酸。
人IgG的“CH2结构域”通常包括从约231位氨基酸至约340位的氨基 酸。CH2结构域的独特之处在于其不与其他结构域严密配对。在完整的天然 IgG分子的2个CH2结构域之间插入2条N-连接的分支糖链。推测所述糖 可能是结构域-结构域配对的取代并帮助稳定CH2结构域。Burton，Molec. Immunol.22：161-206(1985)。
“CH3结构域”包含Fc区的C-端至CH2结构域的一段残基(即从IgG 的约341位氨基酸残基至约447位氨基酸残基)。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。“效应子功 能”的示例包括：C1q结合；CDC；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如 B细胞受体；BCR)的下调等等。这些效应子功能通常需要Fc区与结合结 构域组合(例如，抗体可变结构域)，并可使用多种测定评估这些效应子 功能。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰与天然序列Fc区有差异 的氨基酸序列。
“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcR为天然人FcR。在一些实施方案中，FcR为结合IgG抗体(γ受体)的FcR并包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII，还包括这些受体的等位基因变体和可选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，二者具有类似的氨基酸序列，主要在细胞质结构域中有差异。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(见例如Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。在例如RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods4：25-34(1994)；和deHaas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中综述了FcR。其他FcR，包括以后待鉴定的那些，都包括在本文的术语“FcR”中。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在补体存在下的靶细胞的裂解。 经典补体途径的活化通过补体系统的第一补体(C1q)与结合其同源抗原的 (合适亚型的)抗体结合起始。为评估补体活化，可进行CDC测定，例如 在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所描 述的。在例如美国专利号6,194,551B1和WO1999/51642中描述了具有提 高或降低的C1q结合能力和改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体 Fc区的多肽)。又见例如Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184 (2000)。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点和其结合对 象(例如抗原)之间的非共价相互作用的总体强度。除非另外说明，如此 处描述的，“结合亲和力”指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的 1：1相互作用的固有结合亲和力。通常可通过解离常数(Kd)，缔合常数 (Ka)的倒数表示分子X和其对象Y的亲和力。可通过本领域已知的普通 方法测量亲和力，包括本文中描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗 体和/或倾向于容易降解，而高亲和力抗体通常快速结合抗体和/或倾向于 保持较长的结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，用于本发 明的目的，可使用任意这些方法。以下描述了用于测量结合亲和力的特定 说明和示例性实施方案。
在某些实施方案中，通过使用表面等离子共振测定使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃与固定化的抗原CM5芯片在-10响应单位(RU)下测量根据此发明的“KD，”“Kd，”“Kd”或“Kd值”。简言之，用碳化二亚胺(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride)(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)根据供应商的说明书活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。用10mM醋酸钠，pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(-0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射以得到约10响应单位(RU)的偶联蛋白。抗原注射完后，注射1M乙醇胺以阻塞未反应基团。用于动力学测量，在含0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中以约25μl/min的流速注射多肽例如全长抗体的连续稀释物。使用简单的一对一Langmuir结合模型(评估软件版本3.2)通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)计算缔合速度(kon)和解离速度(koff)。以koff/kon的比率计算平衡解离常数(Kd)。见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过上面的表面等离子共振测定得到的缔合速度(on-rate)超过106M-1s-1，则可通过使用荧光猝灭技术测定缔合速度，在25℃测量20nM在PBS，pH7.2中的抗-抗原的抗体在增加浓度的抗原存在下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低，在具有搅拌的样品池的分光计例如装备停流的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列的SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量。
也可使用-2000或-3000系统(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)如上述测定根据此发明的“缔合速度”或“kon”。
如此处描述的术语“基本上相似”或“基本上相同”表示2个数值之 间的相似程度足够高以致本领域技术人员认为2个数值之间的差异很少或 在通过所述值(例如Kd值)测量的生物学特征范围内没有生物学和/或统 计学显著性。在某些实施方案中，作为参考/比较值的函数，所述2个值之 间的差异为例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％和/或小 于约10％。
如此处描述的，词语“基本上减少的”或“基本上有差异的”表示2 个数值之间的差异程度足够高以致本领域技术人员认为2个数值之间的差 异在通过所述值(例如Kd值)测量的生物学特征范围内具有统计学显著性。 作为参考/比较分子的值的函数，所述2个值之间的差异为例如大于约10％， 大于约20％，大于约30％，大于约40％和/或大于约50％。
“纯化的”指分子以占包含其的样品的至少以重量计95％或至少以重 量计98％的浓度存在于样品中。
“分离的”核酸分子为从与其通常相关的，例如在其天然环境中的至 少一种其他核酸分子中分离的核酸分子。分离的核酸分子还包括在通常表 达核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子在染色体外或在与 其天然染色体位置不同的染色体位置上存在。
如此处描述的术语“载体”旨在指能够运输与其连接的另一种核酸的 核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其指其中可连接另外的DNA区段 的环形双链DNA。载体的另一种类型是噬菌体载体。载体的另一种类型是 病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接进病毒基因组。某些载体能够在 其被引入的宿主细胞中自我复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游 离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿 主细胞后可整合至宿主细胞的基因组，由此与宿主基因组一起复制。此外， 某些载体能够引导与其有效连接的基因的表达。这些载体在本文中被称为 “重组表达载体”，或简单地“表达载体”。通常在重组DNA技术中有用 的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和载体可互换使用， 因为质粒是载体的最普遍使用形式。
如此处描述的“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物， 包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核酸，核糖核酸，修饰的核酸或碱 基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反正参入聚合物 的任意底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似 物。如果存在，可在聚合物聚合以前或以后赋予对核苷酸结构的修饰。核 苷酸序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸可包含在合成后的修饰，例如 标记物的缀合。其他类型的修饰包括例如“帽子”，用类似物取代一个或 多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰例如具有无电荷键(例如甲基磷 酸盐、磷酸三酯、phosphoamidates，氨基甲酸盐等等)和带电荷键(例如 磷硫酰、二硫代磷酸酯，等等)的修饰，包含附属部分例如蛋白质(例如 核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等等)的修饰，具有嵌入剂 (例如吖啶、补骨脂素等等)的修饰，包含螯合剂(例如金属、放射性 金属、硼、氧化金属等等)的修饰，包含alkylator的修饰，具有修饰的 键(例如α-异头核酸等等)的修饰，以及多核苷酸的未修饰形式。此外， 原来在糖中存在的任意羟基可被例如膦酸盐基团、磷酸盐基团替换，被标 准保护基团保护，或被活化以制备与其他核苷酸的另外的连接，或可与固 体或半固体支持物结合。5′和3′-端OH可被磷酸化或用胺或1至20个碳 原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可被衍生为标准保护基团。多 核苷酸也可包含核糖或脱氧核糖的本领域通常已知的类似形式，包括例如 2’-O-甲基化，2’-O-烯丙基，2’-氟代或2’-叠氮核糖，碳环形糖类似 物，α-异头糖，差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃 糖、景天庚糖、脂肪族类似物和碱性核苷酸类似物例如甲基核苷。一个或 多个磷酸二酯键可被可选连接基团替换。这些可选连接基团包括但不限于 下述实施方案，其中磷酸被P(O)S(“硫代”)，P(S)S(“二硫代”)，(O)NR2(“amidate”)，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(“formacetal”)替换，其 中每个R或R′是独立的H或任选包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、 环烯基或araldyl的取代的或未取代的烷基(1-20C)。多核苷酸中的所有 键不需要是相同的。以上描述适用于本文中涉及的所有多核苷酸，包括RNA 和DNA。
如此处描述的“寡核苷酸”通常指短的，通常是单链的，通常是合成 的多核苷酸，其长度通常但不一定少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸” 和“多核苷酸”不是互相排斥的。上面的对多核苷酸的描述同样和完全适 用于寡核苷酸。
措辞“控制序列”指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必 需的DNA序列。例如适合原核生物的控制序列包括启动子，任选地操纵子 序列和核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、多聚腺苷酸化信号 和增强子。
当核酸被置于与另一个核酸序列的功能性关系中时，其为“有效连接 的”。例如，前序列或分泌前导DNA与多肽DNA是有效连接的，如果其表 达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列是有效连接的， 如果其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列是有效连接的，如 果其被置于促进转录的位置。通常，“有效连接的”指连接的DNA序列是 连续的，在分泌前导的情况下，其为连续的且依读框的。但是，增强子不 需要是连续的。通过在便利的限制位点连接实现连接。如果这些位点不存 在，依照传统做法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
如此处描述的措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使 用且所有这些名称包括后代。因此，词“转化体”和“转化细胞”包括原 代所述细胞和来源于其的培养物，不考虑转移次数。应当理解由于故意或 无意突变，所有后代的DNA内含物可能不完全相同。包括与筛选的初始转 化细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。当意指不同的名称时，其 含义从上下文中是显而易见的。
如此处描述的“密码子组”指用于编码预期变体氨基酸的一组不同的 核苷酸三联子序列。可通过例如固相合成合成一组寡核苷酸，其包括代表 密码子组提供的所有可能的核苷酸三联子组合和编码预期氨基酸组的序 列。密码子名称的标准形式是IUB编码，这是本领域已知的并在此处描述。 密码子组通常由3个斜体大写字母代表，例如NNK，NNS，XYZ，DVK等等。 因此如此处描述的“非随机密码子组”指编码部分优选完全满足如此处描 述的氨基酸选择标准的选定的氨基酸的密码子组。在特定位置具有选定的 核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域熟知的，例如TRIM方法 (Knappek等人(1999)J.Mol.Biol.296：57-86)；Garrard&Henner (1993)Gene128：103)。可使用商业核酸合成仪(可从例如Applied Biosystems，FosterCity，CA获得)合成这些具有特定密码子组的寡核 苷酸组，或可购买(例如从LifeTechnologies，Rockville，MD)所述寡 核苷酸组。因此合成的具有特定密码子组的寡核苷酸组通常将包括多种具 有不同序列的寡核苷酸，由全部序列中的密码子组决定差异。根据本发明 使用的寡核苷酸具有允许和可变结构域核酸模板杂交的序列并可但不一定 包括用于例如克隆目的的限制酶位点。
措辞“线性抗体”指在Zapata等人(1995ProteinEng， 8(10)：1057-1062)中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段 (VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体 可为双特异性或单特异性的。
如此处描述的“文库”指多种抗体或抗体片段序列(例如，本发明的 变体IgG)或编码这些序列的核酸，所述序列的差异在于根据本发明的方 法引入这些序列的变体氨基酸组合。
在序列比对和如果需要，为获得最大百分比序列同一性引入缺口后， 将与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分 比定义为相对参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，不认为 任何保守取代是序列同一性的一部分。用于测定百分比氨基酸序列同一性 目的的比对可通过本领域技术范围内的多种方法获得，例如使用可公开获 得的计算机软件例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。 本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在比较的序列全长 上获得最大比对所需要的任意算法。然而用于本文的目的，使用序列比较 计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机 程序的著作权属于Genentech，Inc.，源代码与用户文档已提交至美国著 作权署(U.S.CopyrightOffice)，WashingtonD.C.，20559，其在美国著 作权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South SanFrancisco，California公开获得，或可从源代码编译得到。ALIGN-2 程序在UNIX操作系统，优选数字UNIXV4.0D下应该编译后使用。所有序 列比较参数通过ALIGN-2程序设定并没有更改。
在应用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相 对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可将其表述为 给定氨基酸序列A具有或包含相对、与或针对给定氨基酸序列B的特定％ 氨基酸序列同一性)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在A和B的程序比对中得分为相 同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解当氨 基酸序列A的长度和氨基酸序列B的长度不一样时，A相对B的％氨基酸序 列同一性不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，本文 使用的所有％氨基酸序列同一性数值如上一个段落中所描述的使用 ALIGN-2计算机程序得到。
术语“药物组合物”指以允许活性成分的生物学活性有效的形式的制 剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成 分。这些制剂可为无菌的。
“无菌的”制剂是经消毒的或不含所有活微生物及其孢子。
如此处描述的“载体”包括在应用剂量和浓度下，对其将要暴露的细 胞或哺乳动物无毒的可药用的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载 体通常是水性pH缓冲溶液。生理上可接受的载体示例包括缓冲液例如磷酸 盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约 10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚 合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精 氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚 糖；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；盐形成反离子例如钠； 和/或非离子表面活性剂例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。
抗体
本申请涉及包含改变IgG生物学性能的氨基酸修饰的变体IgG免疫球 蛋白。本申请的变体免疫球蛋白包括展示与野生型抗体相比与蛋白A结合 改变的抗体。
抗体是展示对特定抗原的结合特异性的蛋白质。天然抗体通常是约 150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由2条相同的轻(L)链和2条相同的 重(H)链组成。每条轻链通过共价二硫键与一条重链连接，然而在不同免疫 球蛋白同种型的重链中二硫键的数目不同。各条重链和轻链也具有有规律 地间隔的链内二硫键。各条重链在一端具有可变结构域(VH)，接着是多 个恒定结构域。各条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒 定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，轻链的可 变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可 变结构域之间形成界面。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可被归为 不同的类型。有5种主要的免疫球蛋白类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM， 它们中一些可进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4； IgA1和IgA2。已经描述了多种人IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4同种异型(M.-P. LeFranc和G.LeFranc在″TheHumanIgGSubclasses，″F.Shakib(ed.)， pp.43-78，PergamonPress，Oxford(1990)中进行了综述)。IgG类型 的不同亚型包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4具有独特的物理、生物学和临床 性能。人IgG1是用于治疗目的的最普遍使用的抗体，大部分基因工程研究 在此背景下建立。
抗体片段
本发明包括抗体片段。特别引人关注的是包含重链和轻链可变区的抗 体。在某些实施方案中，抗体片段是包含Fc区的变体免疫球蛋白(IgG) 片段。抗体片段可通过传统方法产生，例如酶消化或通过重组技术。
已发展了多种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗 体的蛋白水解消化得到(见例如Morimoto等人，JournalofBiochemical andBiophysicalMethods24：107-117(1992)；和Brennan等人，Science， 229：81(1985))。然而，现在可通过重组的宿主细胞直接产生这些片段。 Fab，Fv和ScFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和分泌，因此允许容易的 产生大量的这些片段。抗体片段可从抗体噬菌体文库中分离。在某些实施 方案中，Fab′-SH片段可从大肠杆菌中直接回收并经化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology10：163-167(1992))。根据另一种方 法，可从重组的宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。产生抗体片段 的其他技术对专业技术人员是显而易见的。抗体片段也可为“线性抗体”， 例如在美国专利号5,641,870中描述的。这些线性抗体可为单特异性或双 特异性。
人源化抗体
本发明包括人源化抗体。在某些实施方案中人源化抗体为相对野生型 IgG在Fc区具有一个或多个氨基酸修饰的人源化变体IgG。用于人源化非 人抗体的多种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有从非人来源 引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为“输入” 残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可主要根据Winter及其同 事的方法(Jones等人(1986)Nature321：522-525；Riechmann等人 (1988)Nature332：323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536)进行，通过将高变区序列取代为人抗体的对应序列。由此， 这些“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上 不足1个完整的人可变结构域已被非人物种的对应序列取代。实际上，人 源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能一些FR残基被啮齿类 抗体的类似位点处的残基取代。
用于产生人源化抗体的人轻链和重链二者的可变结构域的选择对降低 抗原性可能是重要的。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，在已知人 可变结构域序列的整个文库中筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。然后接 受最接近啮齿类序列的人序列作为用于人源化抗体的人框架。见例如Sims 等人(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol. 196：901。另一种方法使用来源于轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的共 有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。见例如 Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等 人(1993)J.Immunol.，151：2623。
通常还希望人源化的抗体保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学 性能。为实现此目的，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维 模型分析亲本序列和不同概念性人源化产物的方法制备人源化抗体。三维 免疫球蛋白模型是通常可得到的并且是本领域技术人员熟悉的。说明和展 示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可得 到的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能 作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从 受体中选择FR残基并组合，输入序列以得到预期的抗体特征，例如对靶抗 原的增加的亲和力。通常，高变区残基直接和最多地参与影响抗原结合。
人抗体
在某些实施方案中，本发明的人抗体为相对野生型IgG在VH区具有一 个或多个氨基酸修饰的人变体IgG。可通过组合如上述从人来源的噬菌体 展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列与已知人恒定结构域序列构建 人抗体。可选地，可通过杂交瘤方法产生人单克隆抗体。例如KozborJ. Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibody ProductionTechniquesandApplications，pp.51-63(MarcelDekker， Inc.，NewYork，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991) 已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。
现在可以产生在免疫后能够产生人抗体全部谱型，而没有内源免疫球 蛋白产生的转基因动物(例如小鼠)。例如，在嵌合和胚系突变小鼠中的 抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在 这些胚系突变小鼠中转移人胚系免疫球蛋白基因阵列在抗原攻击后将导致 人抗体的产生。见例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA，90： 2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255(1993)；Bruggermann 等人，YearinImmunol.，7：33(1993)。
也可使用基因改组从非人例如啮齿类抗体得到人抗体，其中人抗体与 起始非人抗体具有类似的亲和力和特异性。根据又称“表位印迹”的此方 法，用人V结构域基因谱型替换如本文描述的通过噬菌体展示技术得到的 非人抗体片段的重链或轻链可变区，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体 群体。使用抗原的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人 链恢复了在初步噬菌体展示克隆中去除对应非人链时破坏的抗原结合位 点，即控制(压印)人链配偶体选择的表位。当重复所述过程以替换剩余 的非人链时得到人抗体(见1993年4月1日公布的PCTWO93/06213)。 与通过CDR移植的传统非人抗体的人源化不同，此技术提供了没有非人来 源的FR或CDR残基的完全人抗体。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少2个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。 在某些实施方案中，双特异性抗体是相对野生型抗体在VH区中具有1个或 多个氨基酸修饰的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体为人 或人源化抗体。也可使用双特异性抗体将细胞毒性剂定位于表达靶抗原的 细胞。这些抗体具有靶抗原结合臂和结合细胞毒性剂例如皂草素、抗-干扰 素α、长春花生物碱、篦麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原的 臂。在某些实施方案中，结合特异性针对IL-4和IL-3。可将双特异性抗 体制备为全长抗体或抗体片段。
产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的 重组制备是基于2个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中2条重链具有 不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537(1983))。因为免 疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤细胞(quadromas)产生10 种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通 常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化十分困难，且产量低。类似的 程序在1993年5月13日公布的WO93/08829和Traunecker等人，EMBOJ.， 10：3655(1991)中公开。
根据不同的方法，将具有预期结合特异性的抗体可变结构域(抗体- 抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。例如，与包含铰链、 CH2和CH3区的至少部分的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在某些实施方 案中，在至少一个融合中存在包含轻链结合必需位点的第一个重链恒定区 (CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA 插入各个表达载体并共转染至合适的宿主生物。当在构建中使用不同比例 的3种多肽链提供最佳产量时，这为调节3种多肽片段的相互比例提供了 良好的灵活性。然后当相同比例的至少2条多肽链的表达导致高产量或当 所述比例不是特别重要时，有可能在一个表达载体中插入2个或所有3个 多肽链的编码序列。
在此方法的一个实施方案中，双特异性抗体由在一个臂具有第一个结 合特异性和在另一个臂具有杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二个结合 特异性)的杂交免疫球蛋白重链组成。发现此不对称结构便于从不需要的 免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物，因为在双特异性分子的 仅一半中存在的免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方法。此方法在WO 94/04690中公开。产生双特异性抗体的进一步详情见例如Suresh等人， MethodsinEnzymology，121：210(1986)。
根据另一个方法，可改造一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细 胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。所述界面包含抗体恒定结构域的 CH3结构域的至少一部分。在此方法中，将第一个抗体分子界面中的一个或 多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。将第二个 抗体分子界面上通过将大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏 氨酸)产生于大侧链大小相同或相似的补偿性“空穴”。这提供了提高异 源二聚体而不是其他不需要的终产物例如同源二聚体的产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合抗体之 一可偶联抗生物素蛋白，另一个偶联生物素。例如，已提议用这些抗体将 免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，和治疗HIV 感染(WO91/00360，WO92/00373和EP03089)。可使用任意方便的交联方 法产生异源缀合抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，并在美国专利号 4,676,980中与多种交联技术一同公开。
Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993) 描述的“双抗体”技术提供了产生双特异性抗体片段的另一种机制。所述 片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述 接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对。由此，一个片段的 VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，因此形成2个 抗原结合位点。也报导了另一种通过使用单链Fv(sFv)二聚体产生双特异 性抗体片段的策略。见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994)。
考虑了具有多于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人 J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
多价抗体可比二价抗体更快的被表达所述抗体结合的抗原的细胞内化 (和/或分解代谢)。本发明的抗体可为具有3个或多个抗原结合位点(例 如四价抗体)的多价抗体(除了IgM类型以外)，其可通过编码抗体多肽 链的核酸的重组表达容易的产生。多价抗体可包含二聚化结构域和3个或 多个抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含Fc区或铰链区 (或由Fc区或铰链区组成)。在此情况下，抗体将包含Fc区和在Fc区氨 基端包含3个或多个抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含3 个至约8个抗原结合位点(或由3个至约8个抗原结合位点组成)。在一 个这样的实施方案中，多价抗体包含4个抗原结合位点(或由4个抗原结 合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，2条多肽链)，其 中所述多肽链包含2个或多个可变结构域。例如，所述多肽链可包含 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变 结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n为0或1。 例如，所述多肽链可包含：VH-CH1-易弯曲的接头-VH-CH1-Fc区链；或 VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。此处的多价抗体可还包含至少2种(例如4种)轻 链可变结构域多肽。此处的多价抗体可包含例如从约2种至约8种轻链可 变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域和任 选地还包含CL结构域。
单结构域抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体为包含Fc区的单结构域抗体。在某 些实施方案中，单结构域抗体相对野生型IgG在Fc区具有1个或多个氨基 酸修饰。单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链 可变结构域的全部或部分的单个多肽链。
抗体修饰
在某些实施方案中，考虑本文描述的免疫球蛋白的氨基酸序列修饰。 在某些实施方案中，修饰包含对本发明的变体IgG的一个或多个氨基酸修 饰。在某些实施方案中，可能希望进一步改变本发明的变体IgG的结合亲 和力、体内半衰期和/或其他生物学性质。在某些实施方案中，氨基酸修饰 包含在本文中未描述的Fc区中的一个或多个氨基酸修饰。可通过将合适的 改变引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备变体IgG的修饰的氨基 酸序列。这些修饰包括例如在抗体的氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入 和/或取代。只要最终构建体具有期望的特征，可进行缺失、插入和取代的 任意组合以获得最终构建体。可在产生序列时将氨基酸改变引入对象抗体 的氨基酸序列。
鉴定抗体的某些残基或区域是用于突变的优选位置的一种有用方法名 叫“丙氨酸扫描突变”，如CunninghamandWells(1989)Science， 244：1081-1085描述。其中，鉴定靶残基或靶残基组(例如带电荷的残基 例如arg，asp，his，lys和glu)并用中性或负电荷氨基酸(例如丙氨酸 或多聚丙氨酸)替换以影响氨基酸和抗原的相互作用。然后通过在取代位 点引入进一步或其他修饰完善这些证明对取代在功能上敏感的氨基酸位 置。因此，尽管引入氨基酸序列修饰的位点是预先确定的，突变本身的性 质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点的突变的表现，在靶密码 子或区域进行ala扫描或随机突变，筛选表达的免疫球蛋白以获得预期活 性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的长度范围从1个残基至含 有上百个或更多残基的多肽的融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内 插入。末端插入的示例包括具有N-端蛋氨酰残基的抗体。其他抗体分子的 插入修饰包括抗体的N-或C-端与酶(例如ADEPT)或与延长抗体的血清半 衰期的多肽的融合。
在某些实施方案中，改变本发明的变体IgG以增加或降低抗体的糖基 化程度。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合 物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰 胺-X-苏氨酸(其中X为除了脯氨酸以外的任意氨基酸)是碳水化合物部分 和天冬酰胺侧链酶连接的识别序列。因此，在多肽中的这些三肽序列中任 一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖 胺、半乳糖或木糖与羟基氨基酸的连接，最常见地是丝氨酸或苏氨酸，尽 管也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基 化位点)产生或去除可方便地实现对抗体糖基化位点的加入或缺失。也可 通过在原始抗体的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸的加入、缺失或取 代(用于O-连接的糖基化位点)进行改变。
与变体IgG的Fc区连接的碳水化合物可被改变。哺乳动物细胞产生的 天然抗体通常包含分支的、二分支寡糖，其通常通过N连接与Fc区的CH2 结构域连接。见例如Wright等人(1997)TIBTECH15：26-32。寡糖可包 括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾 液酸，以及在GlcNAc的二分支寡糖结构的“茎”上连接的岩藻糖。在某些 实施方案中，可对本发明的变体IgG中的寡糖进行修饰以产生具有某些另 外改进性质的变体IgG。
例如，提供了具有缺乏与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化 合物结构的抗体修饰。这些修饰可能具有改进的ADCC功能。见例如美国专 利公开号US2003/0157108(Presta，L.)；US2004/0093621(KyowaHakko KogyoCo.，Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏的”抗体修饰相关的 出版物示例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742； WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)； Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩 藻糖化抗体的细胞系示例包括在蛋白质岩藻糖化中有缺陷的Lec13CHO细 胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；USPat ApplNoUS2003/0157108A1，Presta，L；和WO2004/056312A1，Adams 等人，特别见Example11)，和敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶 基因FUT8敲除的CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng. 87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688 (2006)；和WO2003/085107)。
还提供了具有二等分(bisected)寡糖的抗体修饰，例如，其中与抗体的Fc区连接的二分支寡糖由GlcNAc等分。这些抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。这些抗体修饰的示例在例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；US专利号6,602,684(等人)；和US2005/0123546(等人)中描述。也提供了在Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体修饰。这些抗体修饰可具有改进的CDC功能。这些抗体修饰在例如WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju，S.)；和WO1999/22764(Raju，S.)中描述。
在某些实施方案中，本发明考虑了具有部分但不是全部的效应子功能的抗体修饰，使抗体在许多应用中成为理想的候选物，在这些应用中抗体的体内半衰期很重要而某些效应子功能(例如补体和ADCC)不是必需的或是有害的。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以保证仅保留期望的性质。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以保证抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI，Fc(RIIandFc(RIII。在RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)的第464页的表3中总结了在造血细胞上表达的FcR。在美国专利号5,500,362(见例如Hellstrom，I.，等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82：1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中描述了评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性示例。可选地，可应用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞仪的ACTI非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这些测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可在体内例如在动物模型中评估目的分子的ADCC活性，例如在Clynes等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95：652-656(1998)中公开的。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。为评估补体激活可进行CDC测定(见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood101：1045-1052(2003)；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004))。也可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
提供了具有一个或多个氨基酸取代的其他抗体修饰。取代突变的目的 位点包括高变区，但也考虑FR改变。保守取代在表1中的标题“优选取代” 下显示。更多实质改变，名为“示例性取代”在表1中提供，或在下面有 关氨基酸类型中进一步描述。可将氨基酸取代引入目的抗体并筛选产物的 例如预期活性，例如改进的抗原结合，降低的免疫原性，改进的ADCC或 CDC等。
表1
可通过选择影响(a)在取代的区域中的多肽骨架结构，例如片层或螺 旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的取代 实现对抗体的生物学性质的修饰。可根据其侧链的性质的相似性将氨基酸 分组(在A.L.Lehninger，inBiochemistry，第二版，pp.73-75，Worth Publishers，NewYork(1975)中)：
(1)非极性：Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)， Trp(W)，Met(M)
(2)无电荷极性：Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn (N)，Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)，Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)，Arg(R)，His(H)
或者，可基于普通侧链性质将天然存在的残基分组：
(1)疏水：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性疏水：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要将这些类型之一的成员交换为另一种类型。也可将这 些取代的残基引入保守取代位点或引入其余(非保守)位点。
取代修饰的一种类型涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一 个或多个高变区残基。在某些实施方案中，亲本抗体为野生型对应物变体 IgG(例如在其氨基酸序列中没有任何另外的改变的本发明的变体IgG)。 通常选定的用于进一步开发所产生的抗体与生成其的亲本抗体相比将具有 修饰的生物学性质。示例性取代修饰是亲和成熟的抗体，其可通过基于噬 菌体展示的亲和成熟技术方便地产生。简言之，在一些高变区位点(例如 6-7个位点)进行突变以在各个位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产 生的抗体以与包装进各个颗粒中的噬菌体衣壳蛋白(例如M13的基因III 产物)的至少一部分融合的形式在丝状噬菌体颗粒上展示。然后筛选噬菌 体展示抗体以选择其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰 的候选高变区位点，可进行扫描突变(例如丙氨酸扫描)以鉴定在抗原结 合中起重要作用的高变区残基。可选地或另外地，分析抗原-抗体复合物的 晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有利的。根据本领域已知 的技术(包括此处详细描述的)这些接触残基和相邻残基是用于取代的候 选物。一旦生成了这些修饰的抗体，使用本领域已知的技术(包括此处详 细描述的)筛选抗体组，可选择在一个或多个相关测定中具有较高性能的 抗体用于进一步开发。
通过本领域已知的多种方法制备编码修饰抗体(例如修饰的变体IgG) 的氨基酸序列的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天 然存在的氨基酸序列修饰的情况下)或通过较早制备的修饰抗体或抗体的 非修饰形式的寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变和盒式突变制备。
依照本领域的此描述和教导，考虑在某些实施方案中本发明的抗体修 饰可包含与野生型对应变体IgG(例如在其氨基酸序列中没有任何另外的 改变的本发明的变体IgG)相比的一个或多个改变。然而这些包含另外改 变的抗体修饰基本上保留与野生型对应变体IgG相比相同的发挥治疗效用 所需的特征。
在另一个方面，本发明提供了包含在含有Fc区的Fc多肽界面中的修 饰的抗体修饰，其中所述修饰便于和/或促进异源二聚体化。这些修饰包含 在第一种Fc多肽中引入突起和在第二种Fc多肽中引入空穴，其中突出可 置于空穴中从而促进第一种和第二种Fc多肽的复合物的形成。生成具有这 些修饰的方法是本领域已知的，例如在美国专利号5,731,168中描述的。
在另一个方面，可能希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“含硫Mab (thioMAb)”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在某些 实施方案中，取代的残基位于抗体的易接近位点。通过用半胱氨酸取代这 些残基，活性巯基因此定位于抗体的易接近位点并可能用于缀合抗体与其 他部分，例如药物部分或接头药物部分，如此处进一步描述的。在某些实 施方案中，可用半胱氨酸取代以下残基中的任意一种或多种：轻链的V205 (Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
抗体衍生物
在某些实施方案中，本发明的变体IgG可被进一步修饰以包含本领域 已知的和易于获得的另外的非蛋白质部分。在某些实施方案中，变体IgG 可与细胞毒性剂缀合。在某些实施方案中，结合细胞毒性剂的变体IgG被 细胞内化，导致缀合物杀伤其结合的细胞的治疗效力增加。
在某些实施方案中，适于抗体衍生化的部分为水溶性聚合物。水溶性 聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的 共聚物，羟甲基化纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯酮，聚1，3-二 二恶烷，聚-1，3，6-三恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(同聚物或 随机共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯酮)聚乙二醇，丙二醇 (propropyleneglycol)同聚物，聚环氧丙烷(prolypropyleneoxide)/环 氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多醇(例如甘油)，聚乙烯醇，和其混合物。 聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势，因为其在水中的稳定性。聚合物可 为任意分子量，和可为分支的或不分支的。与抗体连接的聚合物数目可变 化，如果连接了超过一种聚合物，它们可为相同的或不同的分子。通常可 基于以下考虑确定用于衍生化的聚合物数目和/或种类，所述考虑包括但不 限于待改进的抗体的特定性能或功能，抗体衍生物是否将在确定的条件下 用于治疗等。
在另一个实施方案中，提供了可通过暴露于放射下被选择性加热的抗 体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分为碳纳米 管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：11600-11605(2005))。 放射可为任意波长的放射，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质部 分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分邻近细胞的温度的波长。
制备变体IgG
可通过本领域任意已知的方法制备变体IgG。在某些实施方案中，使用 变体IgG序列产生编码成员序列的核酸，如果需要的话，之后将所述核酸 克隆至宿主细胞，表达和测定。使用熟知的程序进行这些实施，Molecular Cloning--ALaboratoryManual，第三版(Maniatis，ColdSpringHarbor LaboratoryPress，NewYork，2001)，和CurrentProtocolsinMolecular Biology(JohnWiley&Sons)中描述了可使用的多种方法。编码变体IgG 的核酸可掺入表达载体以表达蛋白质。表达载体通常包括与控制或调控序 列、可选择标记、任意融合对象和/或另外的元件有效连接(即置于功能性 关系中)的蛋白质。可通过在诱导或引起蛋白质表达的合适条件下培养转 化了核酸，优选含有编码变体IgG的核酸的表达载体的宿主细胞产生变体 IgG。可使用多种广泛的合适宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、 昆虫细胞和酵母。例如，在可从美国典型培养物保藏所(AmericanType CultureCollection)获得的ATCC细胞系目录中描述了可使用的多种细胞 系。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域熟知的，并将根据使用的宿 主细胞而变化。
在某些实施方案中，在表达后纯化或分离变体IgG。可以本领域技术人 员已知的多种方法分离或纯化抗体。标准纯化方法包括层析技术、电泳、 免疫学、沉淀、透析、过滤、浓缩和层析聚焦技术。如本领域熟知的，多 种天然蛋白质与抗体结合，例如某些细菌蛋白质，这些蛋白质可用于纯化。 通常纯化可通过特定的融合对象进行。例如，如果应用GST融合可使用谷 胱甘肽树脂，如果应用His标签可使用Ni+2亲和层析或如果使用flag标签 可使用固化的抗flag抗体纯化蛋白质。合适纯化技术的一般指导见 AntibodyPurification：PrinciplesandPractice，第三版，Scopes， Springer-Verlag，NY，1994。
筛选变体IgG
可使用多种方法筛选本发明的变体IgG，包括但不限于在体外测定、体 内测定和基于细胞的测定中使用的方法和选择技术。可在筛选程序中使用 自动和高通量筛选技术。筛选可利用融合对象或标签，例如免疫标签、同 位素标签或小分子标签例如荧光或量热染料的使用。
在某些实施方案中，在体外测定中筛选变体IgG的功能和/或生物物理 性质。在某些实施方案中，筛选蛋白质的功能性，例如其催化反应的能力 或其与其靶的结合亲和力。
筛选方法中的一类是选择文库中的合适成员的筛选方法。所述方法在 此处被称为“选择方法”，且这些方法可在本发明中使用，用于筛选变体 IgG。当使用一种选择方法筛选蛋白质文库时，只有那些合适的(即满足一 定选择标准的)文库成员被繁殖、分离和/或观察。在本发明中可用于筛选 蛋白质文库的多种选择方法是本领域已知的。其他可用于本发明的选择方 法包括不依赖于展示的方法，例如体内方法。一类被称为“定向进化”的 选择方法是这样的方法，其在选择过程中包括合适序列的匹配或培育，有 时候参入新的突变。
在某些实施方案中，使用一种或多种基于细胞的或体内测定筛选变体 IgG。在这些测定中，通常外源加入纯化或未纯化的蛋白质使细胞暴露于文 库中的各个变体或变体库中。这些测定通常但不都是基于变体IgG的功能； 即变体IgG结合其靶和介导某些生化事件的能力，例如效应子功能，配体/ 受体结合抑制，凋亡等等。这些测定经常涉及监测细胞对IgG的反应，例 如细胞增殖、细胞迁移、血管生成、细胞存活、细胞死亡、细胞形态学的 改变或转录激活例如天然基因或报告基因的细胞表达。例如，这些测定可 测量IgG变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。在某些测定中可能需要加入 除了靶细胞以外的另外细胞或成分，例如血清补体或效应细胞例如外周血 单核细胞(PBMCs)、NK细胞、巨噬细胞等等。这些另外的细胞可来自任意 生物，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。在某些实施方案中，抗体可抑制血 管生成，监测这些活性的方法是本领域熟知的。在另一个实施方案中，抗 体可引起表达靶的特定细胞系的凋亡，或其可通过在测定中加入的免疫细 胞介导对靶细胞的攻击。监测细胞死亡或存活的方法是本领域已知的，包 括染料、免疫化学剂、细胞化学剂和放射性试剂的使用。转录激活在基于 细胞的测定中也可作为测定功能的方法。可选地，使用已用编码变体的核 酸转化或转染的细胞进行基于细胞的筛选。即变体IgG不是外源加入细胞 的。
可在细胞、组织和全生物实验中表征变体IgG的生物学性质。经常在 包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴的动物中检测药物以测量 药物在治疗疾病或疾病模型中的效力，或测量药物的药物动力学、毒性和 其他性质。可将所述动物称为疾病模型。经常在小鼠中检测治疗，包括但 不限于裸小鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。 这些实验可为确定蛋白质用于治疗的潜力提供有意义的数据。可使用任意 生物优选哺乳动物用于检测。例如由于猴子与人的遗传相似性，猴子可作 为合适的治疗模型因此可用于检测变体IgG的效力、毒性、药物动力学或 其他性质。批准作为药物最终需要在人中的检测，因此理所当然地考虑这 些实验。因此变体IgG可在人中检测以确定其治疗效力、毒性、免疫原性、 药物动力学和/或其他临床性质。
变体IgG的治疗用途
变体IgG可用于广泛范围的产品。在某些实施方案中，IgG变体为治疗、 诊断或研究试剂。变体IgG可用于单克隆或多克隆抗体组合物。
变体IgG可用于多种治疗目的，包括但不限于治疗患有金黄色葡萄球 菌感染的患者。
剂量、制剂和持续时间
以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用变体IgG组合物。在此 上下文中考虑的因素包括但不限于待治疗的特定疾病，待治疗的特定哺乳 动物，个体患者的临床条件，疾病的原因，试剂的递送位点，施用的方法， 施用的时间表和医疗人员已知的其他因素。为了预防或治疗疾病，本发明 的变体IgG例如抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他治疗剂 组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重度 和阶段，施用抗体是为了预防还是治疗的目的，前期治疗，患者的临床病 史和对抗体的反应，和主治医师的决定。在1次或多次治疗中对患者合适 地施用变体IgG。
此处的药物组合物也可包含一种以上用于治疗的特定病症 (indication)所必需的活性化合物，优选具有不会有害地影响彼此的补 充活性的化合物。这些分子以用于计划目的的有效量合适地存在于组合物 中。
为了预防或治疗疾病，本发明的变体IgG的合适剂量(当单独使用或 与一种或多种其他治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，抗 体的类型，疾病的严重度和阶段，施用抗体是为了预防还是治疗的目的， 前期治疗，患者的临床病史和对变体IgG的反应，和主治医师的决定。在 某些实施方案中，在1次或多次治疗中对患者合适地施用变体IgG。取决 于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg) 的变体IgG可为对患者施用的初始候选剂量，例如通过一次或多次单独的 施用或通过连续输注。取决于上述因素，通常的1日剂量可从约1μg/kg 至100mg/kg或更多的范围。在持续几天或更长的重复施用中，根据情况， 通常维持治疗直到出现预期的疾病症状的抑制。在一个实施方案中，根据 情况，维持治疗直到疾病被治愈，通过本文描述的或本领域已知的方法测 量。变体IgG的示例剂量为从约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围。因此， 可对患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，7.5mg/kg，10mg/kg 或15mg/kg(或其任意组合)的1次或多次剂量。这些剂量可间歇地施用， 例如每3周，每8周或每12周(例如使患者接受从约2至约20次或例如 约6次抗体剂量)施用1次。在某些实施方案中，可施用初始较高的负荷 剂量，接着施用一次或多次较低的剂量。在某些实施方案中，给药方案包 含施用约4mg/kg的初始负荷剂量，接着施用每周的约2mg/kg抗体的维 持剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过传统技术和测定容易监测此 治疗的进展。
在某些实施方案中，使用变体IgG和一种或多种其他治疗剂治疗患者。 组合施用包括使用单独的制剂或单个药物制剂共施用或同时施用，和以任 意顺序连续施用，其中任选地在一段时期中2种(或所有)活性剂同时施 加其生物学活性。与变体IgG组合施用的治疗剂的有效量将由医师或兽医 决定。进行剂量施用和调节以实现对待治疗的病症的最大处理。剂量将另 外取决于这些因素，如待使用的治疗剂的类型和待治疗的特定患者。在某 些实施方案中，抑制剂的组合增强单个抑制剂的效力。术语“增强”指在 其普通或认可的剂量上治疗剂效力的改进。
本发明的变体IgG(和任意其他治疗剂)可以任意合适的方式施用，包 括胃肠外、皮下、腹膜内、脑脊髓内、肺内和鼻内，和如果希望用于局部 治疗可通过损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜 内或皮下施用。在某些实施方案中，变体IgG例如抗体通过脉冲输注合适 地施用，特别是使用变体IgG的逐减剂量。给药可通过任意合适的途径， 例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短期的还是长 期的。在某些实施方案中，对受试者静脉内施用变体IgG，例如作为团注 或通过一段时期的连续输注。
在变体IgG的制备和施用中可能需要考虑本发明的变体IgG例如抗体 的结合靶的位置。当变体IgG的结合靶位于脑中时，本发明的某些实施方 案提供了变体IgG穿过血脑屏障的方法。用于运输分子穿过血脑屏障的一 些本领域已知的方法是现有的，包括但不限于物理方法、基于脂的方法、 基于干细胞的方法和基于受体和通道的方法。
运输变体IgG例如抗体穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于彻底绕 过血脑屏障或通过在血脑屏障中制造开口。绕行方法包括但不限于直接注 射至脑(见例如Papanastassiou等人，GeneTherapy9：398-406(2002))， 间质输注/增强对流的递送(见例如Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA91：2076-2080(1994))，和在脑中植入递送装置(见例如Gill等 人，NatureMed.9：589-595(2003)；和GliadelWafers，Guildford Pharmaceutical)。在血脑屏障中制造开口的方法包括但不限于超声波(见 例如美国专利公开号2002/0038086)，渗透压(例如通过施用高渗甘露醇 (Neuwelt，E.A.，ImplicationoftheBlood-BrainBarrierandits Manipulation，Vols1&2，PlenumPress，N.Y.(1989))，通过例如缓 激肽或渗透剂A-7增加渗透性(见例如美国专利号5,112,596，5,268,164， 5,506,206和5,686,416)，和用含有编码变体IgG基因的载体转染跨越血 脑屏障的神经元(见例如美国专利公开号2003/0083299)。
运输变体IgG例如抗体穿过血脑屏障的基于脂的方法包括但不限于将 变体IgG包装在联接与血脑屏障的血管内皮细胞上的受体结合的抗体结合 片段的脂质体中(见例如美国专利申请公开号20020025313)，和将变体 IgG覆盖在低密度脂蛋白颗粒(见例如美国专利申请公开号20040204354) 或载脂蛋白E(见例如美国专利申请公开号20040131692)上。
运输变体IgG例如抗体穿过血脑屏障的基于干细胞的方法需要使用基 因工程改造的神经祖细胞(NPC)表达目的抗体，然后将干细胞植入待治疗 个体的脑中。见Behrstock等人(2005)GeneTher.在2005年12月15 日的提前在线发表(报导了经基因工程改造以表达神经营养因子GDNF的 NPC当植入啮齿类和灵长类模型的脑中时减轻了帕金森病的症状)。
运输变体IgG例如抗体穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但 不限于使用糖皮质激素阻断剂以提高血脑屏障的渗透性(见例如美国专利 申请公开号2002/0065259，2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通 道(见例如美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物转运蛋白 (见例如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白覆盖抗体并调 节一个或多个转铁蛋白受体的活性(见例如美国专利申请公开号 2003/0129186)和阳离子化抗体(见例如美国专利号5,004,697)。
通过混合具有预期纯度的变体IgG和任选的生理上可接受的载体、赋 形剂或稳定剂(Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy20th edition(2000))制备用于储存的包含本发明的变体IgG例如抗体的药物制 剂，以水溶液、冻干或其他干燥制剂形式。可接受的载体、赋形剂或稳定 剂在使用的剂量和浓度上对接受者无毒，包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸、 组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十 八烷基二甲基苄基氯化铵；氧化六烃季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；酚 基、丁基或苄基醇；烷基苯甲酸酯例如甲基或丙基苯甲酸酯；儿茶酚；间 苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多 肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨 酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖； 螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子 例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂 例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在制备的微胶囊中也可包含活性成分，例如通过凝聚技术或通过界面 聚合，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳 液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲纤维素或明胶-微胶囊和聚 (甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。在Remington：TheScienceandPracticeof Pharmacy20thedition(2000)中公开了这些技术。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过例如经无菌滤膜过滤容 易地实现。
可制备持续释放的制剂。持续释放制剂的合适示例包括包含本发明的 免疫球蛋白的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质为成形物品的形式， 例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括聚酯，水凝胶(例如聚(2- 羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号 3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋 酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙 醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。 尽管例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，某些 水凝胶释放蛋白质的时期较短。当胶囊化的免疫球蛋白在体内长时间存在 时，作为暴露于37℃和潮湿下的结果它们可能变性或聚集，导致生物学活 性的丧失和免疫原性的可能改变。根据涉及的机制可设计合理的策略以进 行稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫键互换的分子间S-S 键形成，可通过修饰含巯基的残基、在酸性溶液下冻干、控制水分含量、 使用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物实现稳定化。
组合治疗
此处描述的治疗可与其他治疗共同施用，即此处描述的治疗可与其他 治疗或疗法包括例如小分子、其他生物制剂、放射疗法、手术等共施用。
制剂
在本发明的另一个方面，提供了包含在治疗、预防和/或诊断上述疾病 中有用的材料的制剂。所述制剂包含容器和在容器表面的或与容器相连的 标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可 由多种材料例如玻璃或塑料构成。容器内含有单独的组合物或与另一种对 治疗、预防和/或诊断病症有效的组合物组合的组合物，并可具有无菌接入 口(例如容器可为具有塞子的静脉内溶液带或小管，塞子可被皮下注射针 刺破)。标签或包装说明书指示组合物用于治疗特别的病症。在某些实施 方案中，制剂可包含(a)其中包含组合物的第一个容器，其中所述组合物 包含本发明的变体IgG；和(b)其中包含组合物的第二个容器，其中所述 组合物包含另一种治疗剂。制剂可还包含指示组合物可用于治疗特定病症 的包装说明书。可选地或另外地，制剂可还包含第二(或第三)个容器， 其中包含可药用的缓冲液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲液、林 格氏溶液和葡萄糖溶液。其可还包括其他在商业和用户立场上希望的材料， 包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
在某些实施方案中，变体IgG可单独包装或与其他治疗化合物组合包 装为试剂盒。试剂盒可包括对患者施用单位剂量有帮助的任选成分，例如 用于重建粉末形式的小管，用于注射的注射器，定制的IV递送系统，吸入 器等等。另外，单位剂量试剂盒可包含制备和施用组合物的说明书。可将 试剂盒制造为用于一位患者的单次使用单位剂量，用于特定患者的多次使 用(以恒定剂量或随着治疗的进展，其中各个化合物的效能可变化)；或 试剂盒可包含适于对多位患者施用的多次剂量(“大包装”)。试剂盒成 分可组装在纸盒、罩板包装、瓶子、管子等中。
实施例
以下为本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，考虑到上面提供 的一般描述可实施多种其他实施方案。
实施例1：抗-Her2变体的产生
将人源化抗-Her2(在美国专利号5,821,337中描述的4D5或 huMAb4D5-8)IgG1重链和轻链的Fab区分别克隆至2个基于pRK的包含人 IgG1恒定结构域的瞬时转染质粒中。然后使用基于Kunkel的定点突变以生 成抗-Her2IgG1变体，其中在VH结构域中的残基发生突变。在此研究中生 成的抗-Her2变体为S17A，R19A，S21A，T57A，T57K，R66A，T68A，S70A， Y79A，Q81A，N82aA和S82bA(都根据如Kabat中的EU索引编号)。
将包含变体重链和野生型轻链的质粒共转染至腺病毒转化的人胚肾细胞系293，根据制造商的方案使用(Roche，Basel，Switzerland)。在与转染复合物孵育24小时后，用含5mM谷氨酰胺的无血清培养基1.3xGEMNMedium培养转染的细胞。收集上清并用1MTRISpH8.0和5M氯化钠(NaCl)调节以得到30mMTRIS和50mMNaCl的终浓度。然后将调节后的上清上样至用蛋白质L树脂填充的柱(Thermoscientific，Rockford，IL)中。上样后，用包含30mMTRIS和150mMNaClpH8的缓冲液洗柱。用0.1M甘氨酸缓冲液pH3.0洗脱结合的Fab。下一步浓缩纯化的Fab并注入-200尺寸排阻层析柱(GEhealthcare，ChalfontSt.Giles，UnitedKingdom)以去除任何聚集物。将单体部分汇集在一起并用于结合研究。使用在280nM处读取的吸光度计算抗-HER2野生型和抗-HER2变体Fab的浓度，将1.5的吸光度估算为1mg/ml的Fab。
实施例2：蛋白A结合研究
通过ELISA研究了抗-Her2变体与蛋白A的结合。用1μg/ml蛋白 A(Thermoscientific，Rockford，IL)或Her2的细胞外结构域(Genentech， SouthSanFrancisco，CA)过夜包被MaxiSorpTMELISA板(Thermo scientific，Rockford，IL)。用PBS，0.5％BSA，10ppmProclin，pH7.2 封闭板，室温1小时，然后用清洗缓冲液(PBS/0.05％TweenTM20/pH7.2) 清洗。将在测定缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween20，10ppm Proclin)中4倍连续稀释(从1000nM开始)的野生型Fab和变体加入用蛋 白A包被的96孔板中。同时，将在测定缓冲液中4倍连续稀释(从50nM 开始)的野生型Fab和变体加入用Her2包被的96孔板中。在摇晃下室温 孵育3小时后，洗板4次，并用在测定缓冲液中以1∶10,000稀释的山羊抗 人IgG(F(ab’)2特异性)-HRP(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA) 检测结合的抗体，在摇晃下室温孵育0.5小时。然后再次洗板4次，接着 加入四甲基联苯胺底物(Moss，Pasadena，MD)用于显色。2分钟后加入1M 磷酸(H3PO4)终止反应。在MolecularDevices微板读数仪上在450-620nm 波长处读板。
结果显示所有变体保留与野生型相同的与Her2的结合亲和力(图1和 2)。图3-4中的结果显示，与野生型相比，某些变体显示了与蛋白A的降 低的结合[S17A，R19A，T57A，T57K，R66A，Q81A和N82aA]，而另一些显 示了基本上相同的结合水平[S21A和T68A]，还有一些显示了增强的结合 [S70A，Y79A和S82bA]。估计WTFab的EC50为约15nM。对这些变体的 每一个的EC50的估值显示于表2。
表2.变体与蛋白A的结合
尽管为了清晰理解的目的已通过说明和实施例相当详细地描述了上述 发明，不应将描述和实施例理解为限制本发明的范围。