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含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质、转基因载体及制备方法 
    【技术领域】

    本发明涉及一类新的含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质的合成及含该类阳离子脂质的转基因载体的制备方法。 

     背景技术

    基因治疗为先天性疾病和后天获得性疾病的治疗提供了一种富有前景的治疗方式。基因治疗的成功地关键是要把治疗基因高效地导入细胞内，然而裸DNA进入血清或细胞内会被血清内的的网状内皮系统所吞噬或被细胞内的核酸酶降解。另外单独用裸DNA进行转染，DNA难于被细胞吸收。因此发展安全有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。 

    基因载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。尽管病毒载体的转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性、宿主DNA插入整合等弊端，从而限制了它们的应用。非病毒载体(如阳离子脂质体)无免疫原性，便于大规模生产，但转染效率低于病毒载体。因此开发低毒，简单，稳定，转染效率高的非病毒载体具有重要意义。阳离子脂质体是一类非常具有开发前景的非病毒载体，已经引起了广泛的研究兴趣，然而目前的阳离子脂质体仍然存在毒性较大、转染效率不高的缺点。 

    传统的阳离子脂质结构中，都是以线型多胺(直链型或支链型)作为阳离子部分，我们认为以环状多胺代替线型多胺作为阳离子部分，将会增强阳离子脂质体与DNA的结合能力。我们的前期研究发现咪唑嗡盐桥链的环状多胺(1，4，7，10‑四氮杂环十二烷)‑长链烷烃缀合物在一定的氮磷比(N/P)时对DNA具有很强的包裹紧缩能力(Chem.Biol.Drug Des.，2008，71(3)，224‑229)。我们还发现咪唑嗡盐桥链的环状多胺‑甾体缀合物所形成的转基因载体在一定条件下超过市售的Lipofectamine 2000的转染效率，然而该阳离子脂质所形成的转基因载体对HEK293细胞的转染效率较差(专利申请号200910216462.6)。这些初步研究结果表明含环状多胺的阳离子脂质在基因转染方面具有潜在的应用价值，但其细胞毒性、转染效率、适用范围需要进一步提高。 

     发明内容

    本发明的目的在于提供一类新的阳离子脂质及其含该阳离子脂质的转基因载体，以促进基因治疗的发展。 

    本发明所述阳离子脂质为含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质，其结构式如下： 

    

    上述结构式中，R为胆固醇基或薯芋皂素基，胆固醇基的结构式如下： 

    

    薯芋皂素基的结构式如下： 

    

    本发明所述转基因载体由上述的阳离子脂质、胆固醇和高纯灭菌水制备。所述转基因载体中，阳离子脂质摩尔浓度为1mmol/L～4mmol/L，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为1～2∶1。 

    本发明所述含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质按照下面的反应路线合成： 

    

    

    说明：化合物1(1a或1b)为合成的目标化合物：含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质；化合物3按文献合成(Organometal.Chem.2008，22：243‑248)。合成路线的具体描述如下： 

    (1)化合物4(4a或4b)的合成 

    原料包括胆固醇或薯芋皂素、羰基咪唑、乙醇胺和溶剂，胆固醇或薯芋皂素∶羰基咪唑∶乙醇胺＝1∶1～2∶1～2，所述比例为摩尔比，溶剂为无水二氯甲烷，溶剂的量以胆固醇或薯芋皂素、羰基咪唑、乙醇胺三种物质能完全溶解为限； 

    在0℃、氮气保护条件下，滴加胆固醇或薯芋皂素的二氯甲烷溶液于羰基咪唑的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后在室温反应1～2小时，然后加入乙醇胺，继续反应6～12小时；反应结束后加入2～5倍于二氯甲烷体积比的乙酸乙酯，所得溶液依次用10％的盐酸，饱和食盐水洗涤、MgSO₄干燥、过滤，蒸出溶剂，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到化合物4(4a或4b)； 

    (2)化合物2(2a或2b)的合成 

    原料包括步骤(1)中得到的化合物4(4a或4b)、羰基咪唑、1‑(2‑氨基)乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷和溶剂，所述化合物4(4a或4b)∶羰基咪唑∶1‑(2‑氨基)乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷＝1∶1～1.5∶0.8‑1.2，所述比例为摩尔比，溶剂为无水二氯甲烷，溶剂的量以步骤(1)中得到的化合物4(4a或4b)、羰基咪唑、乙醇胺三种物质能完全溶解为限； 

    在0℃、氮气保护条件下，滴加化合物4(4a或4b)的二氯甲烷溶液于羰基咪唑的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后在室温反应1～2小时，然后加入1‑(2‑氨基)乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷的二氯甲烷溶液，继续反应1～4天，反应结束后，蒸出溶剂，分别以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1、2∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到化合 物2(2a或2b)； 

    (3)含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1(1a或1b)的合成 

    原料包括步骤(2)得到的化合物2(2a或2b)、无水二氯甲烷和三氟醋酸；化合物2(2a或2b)的浓度为0.2～0.5克/毫升，三氟醋酸与无水二氯甲烷的体积比为1∶1； 

    在室温、常压下将化合物2(2a或2b)、无水二氯甲烷加入反应容器中，当化合物2(2a或2b)完全溶解后，冰水冷却，加入三氟醋酸，加完后在室温下搅拌反应1～3小时，反应结束后减压蒸出二氯甲烷和过量的三氟醋酸，然后加甲醇溶解，在搅拌下向所述甲醇溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经过滤、干燥即得到含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1(1a或1b)。 

    本发明所述转基因载体的制备方法，其原料包括上述的含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1(1a或1b)、胆固醇和无水氯仿，阳离子脂质1(1a或1b)与胆固醇摩尔比为1∶1，阳离子脂质1(1a或1b)与胆固醇两种物质的总量与无水氯仿的配比为：两种物质的总质量∶无水氯仿体积＝1∶40～100，所述两种物质的质量单位为克、无水氯仿的体积单位为毫升； 

    在室温、常压下将本发明所述的含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1(1a或1b)、胆固醇和无水氯仿加入反应容器中，当阳离子脂质1(1a或1b)、胆固醇完全溶解后，蒸出氯仿得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留的氯仿得到干燥的脂质体膜，然后加入高纯灭菌水并搅拌至少3小时形成溶液，高纯灭菌水的加入量以含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1(1a或1b)的浓度为1mmol/L～4mmol/L为限，将所述溶液在4℃环境中放置8～12小时，再经‑15℃～‑20℃冷冻、40℃～60℃解冻，冷冻‑解冻至少循环4次后，于40℃～50℃超声0.5～1.5小时即得本发明所述的转基因载体。 

    本发明具有以下有益效果： 

    MTT法测试表明，本发明所述转基因载体细胞毒性非常低。电泳实验表明，本发明所述转基因载体与pEGFP‑N1质粒的复合物，当转基因载体中的阳离子脂质1(1a或1b)与pEGFP‑N1质粒的质量达到4∶1时，就能有效阻滞包裹pEGFP‑N1质粒，包裹能力较强，且本发明所述转基因载体与pEGFP‑N1质粒的复合物平均粒径在130nm～200nm之间，Zeta电位在10mv～40mv之间，非常适合于基因转染。用本发明所述转基因载体与pEGFP‑N1质粒形成的复合物转染A549细胞和HEK293细胞，都表现出较好的转染能力，在优化转染条件下转染能力还超过了市售转染试剂Lipofectamine 2000。 

     附图说明

    图1是本发明所述转基因载体T‑1a和T‑1b在HEK293细胞中的细胞毒性曲线。 

    图2是本发明所述转基因载体T‑1a与pEGFP‑N1质粒的复合物的电泳阻滞图片。 

    图3是本发明所述转基因载体T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物的电泳阻滞图片 

    图4是本发明所述转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒的不同质量比复合物的粒径曲线。 

    图5是本发明所述转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒的不同质量比复合物的Zeta电位曲线。 

    图6是本发明所述转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒质量比为8∶1的复合物在HECK293细胞中的转染图片。 

    图7是转基因载体Lipofectamine 2000与pEGFP‑N1质粒质量比为8∶1的复合物在A549细胞中的转染图片。 

    图8是本发明所述转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒质量比为8∶1的复合物在HECK293细胞细胞中的转染图片。 

    图9是转基因载体Lipofectamine 2000与pEGFP‑N1质粒质量比为8∶1的复合物在A549细胞中的转染图片。 

    【具体实施方式】

    以下通过实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容的技术方案均属于本发明的保护范围。 

    实施例1：化合物4a的合成 

    化合物4a由胆固醇、羰基咪唑、乙醇胺合成，化合物4a结构式如下： 

    

    在250mL的三颈瓶中，加入10mmol羰基咪唑，30mL无水二氯甲烷，然后在0℃、氮气保护条件下，滴加胆固醇(10mmol)的无水二氯甲烷溶液(60mL)，滴加完毕后于室温反应1小时。再滴加乙醇胺(10mmol)溶于10mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续室温反应12小时。然后在反应液中加入120mL乙酸乙酯，先用10％的盐酸洗涤两次(2x50mL)，再用饱和食盐水洗涤两次(2x50mL)，收集有机层，用无水硫酸镁干燥。过滤，蒸出溶剂，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离，得无定形白色固体4a，产 率：67％。IR(KBr，cm^‑1)：3450，3338，2943，1676，1558，1464，1377，1279，1152，1074，955，768，620.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝0.71(s，3H)，0.89‑2.39(m，40H)，3.37(t，J＝4.8，2H)，3.76(t，J＝4.8，2H)，4.50(m，1H)，5.05(s，1H)，5.41(s，1H).¹³C NMR(150MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝11.8，18.7，19.3，21.0，22.5，22.8，23.8，24.2，28.0，28.1，28.2，31.8，31.9，35.7，36.1，36.5，36.9，38.5，39.5，39.7，42.3，43.4，50.0，56.1，56.6，62.6，74.7，122.5，139.7，156.5.HRMS‑ESI ofC₃₀H₅₁NO₃：496.3767[M+Na]⁺.Found：496.4298[M+Na]⁺. 

    实施例2：化合物4b的合成 

    化合物4b由薯芋皂素、羰基咪唑、乙醇胺合成，化合物4b结构式如下： 

    

    在250mL的三颈瓶中，加入10mmol羰基咪唑，30mL无水二氯甲烷，然后在0℃、氮气保护条件下，滴加化合物5b(10mmol)溶于60mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后恢复室温反应1小时。然后滴加乙醇胺(10mmol)溶于10mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续室温反应12小时。然后在反应液中加入120mL乙酸乙酯，先用10％的盐酸洗涤两次(2x50mL)，再用饱和食盐水洗涤两次(2x50mL)，收集有机层，用无水硫酸镁干燥。过滤，蒸出溶剂，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离，得无定形白色固体4b，产率：65％。IR(KBr，cm^‑1)：3523，3354，2948，1698，1536，1455，1372，1256，1160，1002，984，897，781，613，531.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃TMS)：δ＝0.79(d，6H)，0.96‑2.45(m，36H)，3.33‑3.40(m，3H)，3.46(t，1H)，3.74(t，2H)，4.37(m，1H)，4.52(m，1H)，5.05(s，1H)，5.41(s，1H).¹³CNMR(150MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝14.5，16.2，17.1，19.3，20.8，28.1，28.7，30.2，31.3，31.4，31.8，32.0，36.6，36.9，38.5，39.7，40.2，41.6，43.4，49.9，56.4，62.0，62.5，66.8，74.6，80.8，109.2，122.2，139.7，157.0.HRMS‑ESI of C₃₀H₄₇NO₅：524.3346[M+Na]⁺.Found：524.3413[M+Na]⁺. 

    实施例3：化合物2a的合成 

    化合物2a由实施例1中得到的化合物4a、羰基咪唑、1‑(2‑氨基)‑乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷合成，化合物2a结构式如下： 

    

    在250mL的三颈瓶中，加入10mmol羰基咪唑，30mL无水二氯甲烷，然后在0℃、氮气保护条件下，滴加化合物4a(10mmol)溶于60mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后恢复室温反应1小时。然后滴加化合物1‑(2‑氨基)‑乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷(10mmol)溶于10mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续室温反应4天。蒸出溶剂，以乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到无定形白色固体2a，产率：75％。IR(KBr，cm^‑1)：3359，2939，1697，1470，1411，1368，1248，1164，1047，969，855，777，593.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃TMS)：δ＝0.67(s，3H)，0.85‑2.40(m，67H)，3.39‑3.60(m，18H)，3.99(s，2H)，4.14(t，2H)，4.50(m，1H)，5.00(br，1H)，5.37(d，1H)，5.65(br，1H).¹³C NMR(150MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝11.8，14.1，18.6，19.3，21.0，22.5，22.8，23.7，24.2，27.9，28.1，28.2，28.4，31.8，35.7，36.1，36.5，36.9，38.5，39.4，39.7，40.3，42.3，49.4，49.9，56.0，56.6，60.3，64.2，74.4，80.4，122.4，139.7，156.0，171.0.HRMS‑ESI of C₅₆H₉₆N₆O₁₁：1067.6769[M+K]⁺.Found：1067.6719[M+K]⁺. 

    实施例4：化合物2b的合成 

    化合物2b由实施例2中得到的化合物4b、羰基咪唑、1‑(2‑氨基)‑乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷合成，化合物2b结构式如下： 

    

    在250mL的三颈瓶中，加入10mmol羰基咪唑，30mL无水二氯甲烷，然后在0℃、氮气保护条件下，滴加化合物4b(10mmol)溶于60mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后恢复室温反应1小时。然后滴加1‑(2‑氨基)‑乙酰基‑4，7，10‑三(叔丁氧羰基)‑1，4，7，10‑四氮杂环十二烷(10mmol)溶于10mL的无水二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续室温反应4天。蒸 出溶剂，以乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到无定形白色固体2b，产率：79％。IR(KBr，cm^‑1)：3365，2948，1697，1468，1410，1369，1246，1164，1050，979，859，777.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃TMS)：δ＝0.79(m，6H)，0.86‑2.40(m，57H)，3.34‑3.62(m，20H)，3.99(m，3H)，4.14(t，2H)，4.50(m，1H)，5.00(br，1H)，5.37(d，1H)，5.65(br，1H).¹³C NMR(150MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝14.1，14.4，16.2，17.1，19.3，20.7，20.9，28.0，28.4，28.7，30.2，31.3，31.7，32.0，36.6，36.9，38.4，39.6，40.2，40.3，41.5，49.4，49.8，56.3，60.3，62.0，62.5，64.1，66.7，74.3，80.5，109.2，122.2，139.8，156.0，171.0.HRMS‑ESI of C₅₆H₉₂N₆O₁₃：1095.6354[M+K]⁺.Found：1095.6364[M+K]⁺. 

    实施例5：阳离子脂质1a的合成 

    阳离子脂质1a由化合物2a、无水二氯甲烷和三氟醋酸合成，阳离子脂质1a的结构式如下： 

    

    在室温(25℃)、常压下将化合物2a(1.00g)、无水二氯甲烷(2mL)加入反应容器中，当化合物2a完全溶解后将反应容器置于冰水浴中，然后向反应液内滴加三氟醋酸(2mL)，三氟醋酸滴加完后，在室温、常压下搅拌反应1.5小时，反应结束后蒸出无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇1mL溶解，继后在搅拌下向所述甲醇溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经离心过滤得到固体，真空干燥(真空度0.095Mpa，干燥时间12小时，温度25℃)即得到含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1a，产率95％。IR(KBr，cm^‑1)：3418，2950，1679，1524，1464，1376，1202，1131，1050，835，799，721.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝0.67(s，3H)，0.85‑2.40(m，39H)，3.15‑3.90(m，18H)，4.02‑4.08(m，4H)，4.45(m，1H)，5.37(s，1H)，5.45(s，1H)，6.25(s，1H)，8.10‑9.10(br，4H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝18.7，19.3，21.0，22.5，22.8，23.9，24.2，28.0，28.2，31.8，35.8，36.2，36.5，36.9，37.0，38.5，39.5，39.7，42.3，50.0，56.2，74.6，115.2，118.1，122.5，156.9，161.8，162.1.RMS‑ESI of C₄₇H₇₅F₉N₆O₁₁：1069.5350[M‑H]^‑.Found：1069.5269[M‑H]^‑. 

    实施例6：阳离子脂质1b的合成 

    阳离子脂质1b由化合物6b、无水二氯甲烷和三氟醋酸合成，阳离子脂质1b的结构式如下： 

    

    在室温(25℃)、常压下将化合物2b(1.00g)、无水二氯甲烷(2mL)加入反应容器中，当化合物2b完全溶解后将反应容器置于冰水浴中，然后向反应液内滴加三氟醋酸(2mL)，三氟醋酸滴加完后，在室温、常压下搅拌反应1.5小时，反应结束后蒸干无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇1mL溶解，继后在搅拌下向所述甲醇溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经离心过滤得到固体，真空干燥(真空度0.095Mpa，干燥时间12小时，温度25℃)即得到含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1b，产率95％。IR(KBr，cm^‑1)：3419，2951，1678，1524，1458，1376，1202，1132，1051，898，834，799，721.¹H‑NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝0.79(m，6H)，0.96‑2.40(m，30H)，3.34‑3.62(m，18H)，4.14(t，4H)，4.50(m，1H)，5.28(s，2H)，5.37(s，1H)，5.45(s，1H)，6.25(s，1H)，8.10‑9.10(br，4H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃，TMS)：δ＝14.5，16.2，17.1，19.3，20.8，28.0，28.8，29.6，30.2，31.3，31.8，32.0，36.7，36.9，38.5，39.7，40.2，41.6，46.1，46.6，49.9，53.4，56.4，62.1，64.2，66.8，74.5，80.7，109.2，115.1，118.0，122.2，139.8，156.4，156.9，161.8，162.1.HRMS‑ESI of C₄₇H₇₁F₉N₆O₁₃：1097.4935[M‑H]^‑.Found：1097.4849[M‑H]^‑

    实施例7：含阳离子脂质1a的转基因载体(简称T‑1a)的制备 

    原料包括实施例5制备的含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1a、胆固醇和无水氯仿，阳离子脂质1a 0.01mmol(0.0107g)，胆固醇0.01mmol(0.0039g)，无水氯仿0.5mL。在室温(25℃)、常压下将所述阳离子脂质1a、胆固醇和无水氯仿加入反应容器中，当阳离子脂质1a、胆固醇完全溶解后，用旋转蒸发仪(转速为60r/min)蒸出氯仿得到脂质体膜，再经真空干燥(真空度0.095Mpa，干燥时间12小时，温度25℃)去除残留氯仿得到干燥脂质体膜，以上述阳离子脂质1a的摩尔量(0.01mmol)计算，向此干燥脂质体膜加入高纯灭菌水2.5mL 配成4mmol/L的溶液，搅拌3小时，继后将所配制的溶液在4℃冰箱内放置12小时，再经冰盐浴冷冻固化‑水浴60℃解冻液化，如此共5次，最后在功率为100兆、水浴温度为50℃的超声波水浴中超声1小时即得到含阳离子脂质1a的转基因载体T‑1a，放置于4℃冰箱内保存备用。 

    实施例8：含阳离子脂质1b的转基因载体(简称T‑1b)的制备 

    原料包括实施例6制备的含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1b、胆固醇和无水氯仿，阳离子脂质1b 0.01mmol(0.0079g)，胆固醇0.01mmol(0.0039g)，无水氯仿1mL。在室温(25℃)、常压下将所述阳离子脂质1b、胆固醇和无水氯仿加入反应容器中，当阳离子脂质1b、胆固醇完全溶解后，用旋转蒸发仪(转速为60r/min)蒸出氯仿得到脂质体膜，再经真空干燥(真空度0.095Mpa，干燥时间12小时，温度25℃)去除残留氯仿得到干燥脂质体膜，以上述阳离子脂质1b的摩尔量(0.01mmol)计算，向此干燥脂质体膜中加入高纯灭菌水2.5mL配成含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质4mmol/L的溶液，搅拌3小时，继后将所配制的溶液在4℃冰箱内放置8小时，再经冰盐浴冷冻固化、水浴40℃解冻液化6次，最后在功率为100兆、水浴温度为40℃的超声波水浴中超声1.5小时即得到含阳离子脂质1b的转基因载体T‑1b，放置于4℃冰箱内保存备用。 

    实施例9：转基因载体的细胞毒性实验 

    1材料和方法 

    1.1材料和仪器 

    转基因载体T‑1a、T‑1b：由上述实施例7、实施例8制备。 

    MTT：购于美国Sigma公司，使用时用PBS配制成5mg/mL溶液，pH值7.4，经0.22μm滤膜过滤。 

    A549和293细胞株：来源于美国ATCC。 

    Bio RAD model 550酶标仪：美国Bio‑RAD公司生产。 

    1640培养基：美国Gibico公司生产 

    DMEM培养基：美国Gibico公司生产 

    CO₂培养箱：法国JOUAN公司生产。 

    细胞培养板：美国Corning公司生产。 

    溶剂DMSO：美国Sigma公司生产。 

    胰酶：美国Amresco公司生产。 

    PBS缓冲：由国产分析纯试剂配制为PH值7.4 

    1.2方法 

    将上述实施例7制备的转基因载体T‑1a用含抗生素1640完全培养基(青霉素100IU/mL+链霉素100mg/mL)稀释为含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1a 25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、175μg/mL、200μg/mL的不同浓度的溶液； 

    将上述实施例8制备的转基因载体T‑1b用含抗生素1640完全培养基(青霉素100IU/mL+链霉素100mg/mL)稀释为含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1b 25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、175μg/mL、200μg/mL的不同浓度的溶液。 

    用胰酶消化收取对数生长期A549细胞株，调整细胞数量约为每孔1.5×10⁴个在96孔细胞培养板上培养。37℃、5％CO₂条件下培养约24h，使细胞生长至70％‑80％汇合度，弃孔内原有培养基，用缓冲液PBS(PH值7.4)洗1～2次，在每孔中分别加入含不同浓度含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1a、1b的转基因载体溶液T‑1a、T‑1b 100μL，每个浓度梯度设置四个平行孔；采用不含转基因载体T‑1a、T‑1b的含抗生素1640培养基100μL作为对照，考察其在上述实验条件下的细胞毒性。在37℃、5％CO₂条件下继续培养24h后用缓冲液PBS(PH值7.4)洗涤1～2次，再向每孔加入100μL无血清无抗生素1640培养基[含20μL MTT溶液(5mg/mL in PBS，pH 7.4)]，孵育4h，移除培养基。生成的蓝紫色结晶用150μL DMSO溶解。在吸收波长490nm处用酶标仪测定溶液吸光值。转基因载体T‑1a、T‑1b组细胞与对照组细胞的相对存活率按下式计算： 

    [A]test/[A]control×100 

    上式中，[A]test为测试孔的吸光值，[A]control为对照孔的吸光值。 

    HECK293细胞中的毒性实验根据以上类似步骤进行。 

    2实验结果和讨论 

    经过在A549和HECK293细胞中测定上述两种转基因载体T‑1a和T‑1b的细胞毒性，发现两种转基因载体T‑1a和T‑1b在两种细胞中的细胞毒性都非常低，尤其是转基因载体T‑1a，在HECK293细胞中接近无毒。本发明仅提供了两种转基因载体T‑1a和T‑1b在HECK293细胞中的细胞毒性实验结果(见附图1)，如图1可见，当本发明所述含氨基甲酸酯和环状多胺的阳离子脂质1a、1b的浓度接近150μg/mL时，对于转基因载体T‑1a，80％以上的细胞都能存活，对于转基因载体T‑1b，，40％以上的细胞都能存活，而在进行转染时的阳离子脂质浓度远远低于此浓度，因此本发明所述转基因载体的细胞毒性非常低，具有潜在开发价值。 

    实施例10：转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的凝胶电泳实验 

    1材料和方法 

    1.1材料和仪器 

    转基因载体T‑1a、T‑1b：由上述实施例7、实施例8制备。 

    pEGFP‑N1质粒：购于美国Clontech公司 

    琼脂糖：美国Amor公司生产。 

    TAE缓冲液：由分析纯化学试剂配制。 

    电泳仪：美国Bio‑RAD公司生产。 

    凝胶成像系统(GelDoc 2000)：美国BIO‑RAD公司生产。 

    染料Goldview：上海赛百盛基因技术有限公司生产。 

    葡萄糖溶液：太极集团西南药业股份有限公司生产。 

    1.2方法 

    1.2.1转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒复合物的制备 

    取10个EP管标记为1号～10号，在标记为1号～5号的EP管中分别加入转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1的转基因载体T‑1a并用葡萄糖溶液(0.36mM/L)定容至50ul。在标记为6号～10号的EP管中分别加入转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1的转基因载体T‑1b并用葡萄糖溶液(0.36mM/L)定容至50ul。另取一个EP管标记为11号，加入含有100μg pEGFP‑N1质粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul，轻柔吹打混匀，然后从11号管分别取50ul pEGFP‑N1质粒的溶液依次加入上述10个EP管中，于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的100ul脂质体与pEGFP‑N1质粒的复合物溶液4℃孵育过夜。 

    1.2.2琼脂糖凝胶的制备 

    将0.40g琼脂糖加入到100mL锥形瓶中，再加入40mLTAE缓冲液，加热使琼脂糖颗粒完全溶解，得无色透明液体。冷却至50℃‑60℃，按照染料Goldview∶TAE缓冲液＝1∶20(体积比)的用量加入染料Goldview，混匀后缓慢倒入带有梳子并事先调节为水平的制胶槽中。室温静置，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子，并将带有凝胶的制胶槽放入电泳槽中，加入TEA缓冲液，TEA缓冲液的量以没过胶面1mm为宜，令样品孔自然充满TEA缓冲液。 

    1.2.3转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的电泳实验 

    分别取上述制备的转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物(装于标记为1号～10号的EP管)和pEGFP‑N1质粒空白对照10ul与1.67ul 6xloading buffer混匀加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳槽，室温(25℃)下100V电压电泳约30min后停止，取出凝胶在凝胶成像系统中曝光后采图。 

    2实验结果和讨论 

    实验结果见图2和图3。由图2可见，当转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为2∶1时，部分pEGFP‑N1质粒滞留在加样孔，部分pEGFP‑N1质粒由负极向阳极移动，表明阳离子脂质转基因载体T‑1a能部分包裹pEGFP‑N1质粒，当转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为4∶1时，pEGFP‑N1质粒全部被滞留，表明转基因载体T‑1a能全部包裹pEGFP‑N1质粒。 

    由图3可见，由图2可见，当转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质 量比为2∶1时，部分pEGFP‑N1质粒滞留在加样孔，部分pEGFP‑N1质粒由负极向阳极移动，表明阳离子脂质转基因载体T‑1b能部分包裹pEGFP‑N1质粒，当转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为4∶1时，pEGFP‑N1质粒全部被滞留，表明转基因载体T‑1b能全部包裹pEGFP‑N1质粒。 

    实施例11：转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的的粒径和Zeta电位实验 

    1材料和方法 

    1.1材料和仪器 

    转基因载体T‑1a、T‑1b：由上述实施例7、实施例8制备。 

    pEGFP‑N1质粒：购于美国Clontech公司。 

    葡萄糖溶液：太极集团西南药业股份有限公司生产。 

    纳米粒度及电位分析仪(ZEN 3600)：Malvern Inc公司生产。 

    1.2方法 

    1.2.1转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒复合物的制备 

    取10个EP管标记为1号～10号，在标记为1号～5号的EP管中分别加入转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1的转基因载体T‑1a并用葡萄糖溶液(0.36mM/L)定容至50ul。在标记为6号～10号的EP管中分别加入转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1的转基因载体T‑1b并用葡萄糖溶液(0.36mM/L)定容至50ul。另取一个EP管标记为11号，加入含有100μgpEGFP‑N1质粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul，轻柔吹打混匀，然后从11号管分别取50ulpEGFP‑N1质粒的溶液依次加入上述10个EP管中，于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的100ul脂质体与pEGFP‑N1质粒的复合物溶液4℃孵育过夜。 

    1.2.2转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的粒径和电位实验 

    将上述转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物分别用葡萄糖溶液(0.36mM/L)定溶至1mL。用纳米粒度及电位分析仪测其粒径和Zeta电位。 

    2实验结果和讨论 

    实验结果见图4和图5。由图4可见，转基因载体T‑1a与pEGFP‑N1质粒的复合物在转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为2∶1时，粒径较大，约230nm，当T‑1a阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为4∶1和6∶1时，粒径较小，约为120nm；而转基因载体T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物在转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为2∶1时，粒径高达570nm，当阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为8∶1时粒径较小，约为180nm。因此当两种阳离子脂质1a或1b与pEGPF‑N1质粒的质量比在4∶1～10∶1时适合用于细胞转染实验。 

    由图5可见，转基因载体T‑1a、T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物在阳离子脂质转基因载 体T‑1a、T‑1b中阳离子脂质1a、1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为1∶1时，电位为负值，而当阳离子脂质1a、1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为4∶1以上时，电位都在20mV～30mV之间，此时因为复合物带正电荷，有利于转染过程中复合物与细胞壁的静电结合靠近，增加复合物进入细胞的几率。而较大的质量比有可能使游离的脂质体增加而增加细胞毒性，因此这里采用阳离子脂质1a或1b与pEGPF‑N1质粒的质量比在4∶1～10∶1时较好，这与上面的粒径结果一致。 

    实施例12：转基因载体的体外基因转染实验 

    1材料和方法 

    1.1材料和仪器 

    转基因载体T‑1a、T‑1b：由上述实施例7、实施例8制备。 

    pEGFP‑N1质粒：购于美国Clontech公司 

    A549细胞株；来源于ATCC。 

    PBS缓冲：由国产分析纯试剂配制。 

    1640培养基：GIBICO公司生产。 

    DMEM培养基：GIBICO公司生产 

    胰酶：美国Amresco公司生产 

    转基因载体Lipofectamine 2000：美国invitrogen公司生产 

    细胞培养板：美国Corning公司生产。 

    倒置荧光显微镜：日本Olympus公司生产。 

    EndoFree Plasmid Kit：TIANGEN公司生产。 

    CO₂培养箱：法国JOUAN公司生产。 

    生物安全柜：法国JOUAN公司生产。 

    1.2方法 

    1.2.1转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的制备 

    取4个EP管标记为1号～4号，在标记为1号～2号的EP管中分别加入转基因载体T‑1a中阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为6∶1、8∶1的转基因载体T‑1a并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定容至100ul。在标记为3号～4号的EP管中分别加入转基因载体T‑1b中阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为6∶1、8∶1的转基因载体T‑1b并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定容至100ul。另取一个EP管标记为5号，加入含有32ugpEGFP‑N1质粒的溶液，并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定容至400ul，轻柔吹打混匀，然后从5号管分别取100ulpEGFP‑N1质粒的溶液依次加入上述4个EP管中，于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的200ul脂质体与pEGFP‑N1质粒的复合物溶液室温孵育20分钟备用。 

    1.2.2转基因载体与pEGFP‑N1质粒复合物的体外转染实验 

    用胰酶消化收取对数生长期A549细胞株，调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上培养。37℃、5％CO₂条件下培养约24h，使细胞生长至70％‑80％汇合度，弃孔内原有培养基，用PBS洗1～2次，分别加入上述4管中复合物溶液100ul，使每种材料与pEGFP‑N1质粒同质量比的处理组均有两个复孔，再补充不含血清及抗生素的新鲜1640培养基使每孔内的总体系为250ul。37℃、5％CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基，用PBS洗涤1～2次重新加入含有10％血清的新鲜1640培养基在相同条件下培养24h，其后取出细胞板在倒置荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达情况，并采图。 

    按照上述实施例12中1.2.1的方法制备转基因载体Lipofectamine2000与pEGFP‑N1质粒的复合物，按照上述实施例12中1.2.2的方法将转基因载体Lipofectamine2000与pEGFP‑N1质粒的复合物在A549细胞中进行体外转染实验。 

    使用类似的操作步骤进行以上所述转基因载体T‑1a和T‑1b在HECK293细胞中的体外转染实验，并记录实验数据。 

    2实验结果和讨论 

    分别在A549细胞和HECK293细胞中做了上述两种转基因载体T‑1a和T‑1b的转染实验，结果两种转基因载体T‑1a和T‑1b在两种细胞A549细胞和HECK293细胞中都具有较好的转染能力，尤其是转基因载体T‑1b在A549细胞中和HECK293细胞中的转染效率在优化条件下超过了市售转染载体Lipofectamine 2000，本发明提供了转基因载体T‑1b及市售转基因载体Lipofectamine 2000在A549细胞和HECK293细胞中质量比都为8∶1时的转染结果(见图6、图7、图8和图9)。由图6和图7可见，转基因载体T‑1a与pEGFP‑N1质粒的复合物在阳离子脂质1a与pEGFP‑N1质粒的质量比为8∶1时，在A549细胞中有明显转染效果，且转染效率高于Lipofectamine2000；由图8和图9可见，转基因载体T‑1b与pEGFP‑N1质粒的复合物在阳离子脂质1b与pEGFP‑N1质粒的质量比为8∶1时，在HECK293细胞中转染效率也高于Lipofectamine2000。