具有异养硝化好氧反硝化性能的土壤杆菌及其在含氮废水处理中的应用.pdf

本发明涉及一株具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌菌株(Agrobacterium sp.)及其在含氮废水处理中的应用。该菌株LAD9其特征在于：其16S rRNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330。其保藏号为CGMCC No.2962。本发明的土壤杆菌不但具有异养硝化的能力，同时具有好氧反硝化的能力。在处理含氨氮废水时，只需要一个好氧阶段，即可将氨氮转化为气体产物；脱氮效率高，操作便捷，与传统生物脱氮工艺相比较具有巨大的经济效益。

1.  具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：该土壤杆菌菌株的16S rRNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330，其保藏号为CGMCC No.2962。

2.  如权利要求1所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：该土壤杆菌是从处理垃圾渗滤液的固定化曝气生物滤池中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。

3.  根据权利要求1所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：在30-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢。

4.  根据权利要求1所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于该菌株的生长细胞、细胞悬浮液能分别以氨氮为唯一氮源，有机物为碳源进行异养硝化-好氧反硝化作用，从而将氨氮去除。

5.  根据权利要求1所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于该菌株的生长细胞、细菌悬浮液能分别以硝酸盐氮或亚硝酸盐氮为氮源，有机物为碳源进行好氧反硝化作用，从而在好氧条件下将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮去除。

6.  如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9在处理含氮废水中的应用，其特征在于在含氮废水中加入土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，并且进行曝气，维持溶解氧在2～6mg/L之间，即可实现废水中氮素的去除。

7.  以权利要求1-5中任一个所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)为活性成分制备的微生物菌剂。

具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌及其在含氮废水处理中的应用
技术领域
本发明涉及一株土壤杆菌菌株，特别是涉及一种在好氧条件下即可将废水中的氨氮转化为气体产物的土壤杆菌及其在含氮废水处理中的应用。
背景技术
氮元素在废水中的主要存在形式有分子态氮、有机态氮、氨态氮、亚硝态氮、硝态氮，以及部分存在于硫氢化物和氰化物中的氮。在未处理的原废水中，有机氮和氨氮是氮的主要存在形式。由于氨氮的毒性作用、硝酸盐的致癌作用以及氮化物对生态系统、河流、湖泊、近海海洋的酸化和富营养化作用，如何经济、高效地去除水中的氮素的污水处理技术已成为水污染控制领域的研究重点和热点。
在目前已应用的多种脱氮方法中，生物脱氮仍是废水脱氮处理的主要手段。传统的废水脱氮工艺是：污水中的有机氮化合物在生化过程中首先转化为氨氮，氨氮在硝化过程中由自养菌将其转化为硝酸盐和亚硝酸盐；然后由反硝化菌在缺氧条件下将硝酸盐和亚硝酸盐还原转化为气体产物而使废水脱氮。硝化是反硝化的前提，但反硝化过程才真正达到废水中的含氮化合物脱除的目的。由于硝化细菌具有强烈的好氧性，硝化过程必须好氧；而传统反硝化菌在有氧条件下即以氧气为电子受体进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，获取合成细胞体的能量，因此传统反硝化菌仅能在缺氧环境下才能进行反硝化。根据传统生物脱氮理论而发展起来的生物脱氮工艺通常将硝化和反硝化分别在好氧区与缺氧区进行，形成分级硝化反硝化工艺，因此必须分别建造硝化池和反硝化池，这样就使得分级硝化反硝化工艺存在很多不足之处：(1)硝化菌群增殖速度慢，且世代时间长，难以维持较高的生物浓度；造成系统水力停留时间较长，有机负荷较低，增加了基建投资和运行费用；(2)反硝化脱氮系统需要厌氧环境，为获得良好的脱氮效果，必须进行硝化液回流，增加了动力消耗及运行费用。
针对传统工艺中的缺陷和不足，国内外一直进行着解决这些问题的研究，努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。20世纪80年代以来生物学家研究发现一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。与自养型硝化细菌相比，异养型硝化细菌的生长速率快，细胞产率高。此外，研究报道证实一些菌株在好氧的条件下也能够进行反硝化作用。事实上，研究者已经从土壤和活性污泥中分离出许多好氧反硝化细菌，如ThiosphaeraPantotropha，Diaphorobacter，Comamonas，Paracoccus Denitrifications，AlcaligenesFaecalis和Microvirgula Aerodenitrificans等。这些发现为实现废水的脱氮处理提供了一种新的思路。
需要指出的是，随着研究的深入，人们又发现了一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。然而，很少有对兼有异养硝化-好氧反硝化能力细菌的报道，将这类特殊细菌应用于废水脱氮处理过程的实际应用更是空白。因此发掘更多的具有这种功能的细菌，并将其应用于实际的含氮废水的处理过程，对弥补传统生物脱氮过程中的不足具有划时代的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生物脱氮过程中必须采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题，提供一种具有天然生长优势的高效的具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株——土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，及其在含氮废水的处理中的应用。
本发明所提供的菌株，具有以下特征：在37℃下，营养琼脂培养基上培养24h后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢；该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330。
根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)。
本发明通过的土壤杆菌，于2008年3月19日，在北京保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.2962。
本发明通过下述技术方案予以实现：
具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：该土壤杆菌菌株的16S rRNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330，其保藏号为CGMCC No.2962。
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：在33-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢。
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于该菌株的生长细胞、细胞悬浮液能分别以氨氮为唯一氮源，有机物为碳源进行异养硝化-好氧反硝化作用，从而将氨氮去除。
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于该菌株的生长细胞、细菌悬浮液能分别以硝酸盐氮或亚硝酸盐氮为氮源，有机物为碳源进行好氧反硝化作用，从而在好氧条件下将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮去除。
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9在处理含氮废水中的应用，其特征在于在含氮废水中加入土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，并且进行曝气，维持溶解氧在2～6mg/L之间，即可实现废水中氮素的去除。
以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)为活性成分制备的微生物菌剂。
本发明的土壤杆菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：
1.本发明的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)的生长细胞、细胞悬浮液均能分别以氨氮和硝酸盐氮为唯一氮源生长，能够在有氧存在的条件下进行异养硝化-好氧反硝化作用，是一株新发现的具有同步硝化反硝化能力的细菌。该菌株的这种特性，可以将其直接接种于含氮废水中，只需通过好氧阶段即可实现氮素的去除；解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题；另外，简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有巨大的经济效益和环保效益；
2.该菌株适用于各种含氮废水的脱氮处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益；
3.本发明的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)接种于含有氨氮和有机碳的废水中，可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，12h内氨氮和总氮的去除率分别达到100％和86.54％，氨氮降解速率达7.95mgN/L·h。
4.废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物，亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累较少；
5.将该菌株接种到含有硝酸盐氮的废水中，可以利用硝酸盐为唯一氮源进行新陈代谢，28h内硝酸盐氮的去除率达到100％，降解速率为5.44mgN/L·h，说明菌株具有较强的好氧反硝化能力。这种特性使该菌株的实用性大大增强。
附图说明
附图1为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)的显微镜照片；
附图2为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)对氨氮的降解曲线；
附图3为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)对硝酸盐氮的降解曲线。
在图2和图3中：
横坐标为：以小时表示的时间；
左纵坐标为：以mg/l表示的浓度；
右纵坐标为：OD₆₀₀为菌体光密度；
NH₄⁺-N为氨氮；
TN为总氮。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
实施例1
具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：该土壤杆菌菌株的16S rRNA基因具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1418bp，在Genbank中的登录号为FJ639330，其保藏号为CGMCC No.2962。
实施例2
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：该土壤杆菌是从处理垃圾渗滤液的固定化曝气生物滤池中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。
实施例3
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：在30℃下，营养琼脂培养基上培养2d后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢。
实施例4
如以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株LAD9，其特征在于：在40℃下，营养琼脂培养基上培养3d后，菌落凸起，全缘光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm，单个成对排列，不形成芽孢。
实施例5
具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株的分离纯化方法，该方法有以下步骤：
1)从垃圾渗滤液组合处理系统中取出载体样本；
2)接种到装有100mL富集培养液的500mL锥形瓶中：每L含0.95gNaNO₃，0.7g蛋白胨，0.5g牛肉膏，0.15g尿素，0.04g NaCl，0.15g KH₂PO₄，0.02g KCl，0.03gMgSO₄·7H₂O，0.20g CaCl₂·2H₂O，pH 7.0-7.5；
3)用纱布包好瓶口，于30℃，140rpm摇床振荡培养4d；
4)以此摇瓶中的菌液为菌种源，取出10mL接种至新鲜的装有150mL富集培养液的锥形瓶中，培养条件相同，每隔4d转接一次；
5)转接4次后，对培养液进行10倍梯度稀释，稀释液均匀涂布在营养培养基上：每L含1.5g KNO₃；1.0g KH₂PO₄；0.06g FeSO₄·7H₂O；0.2g CaCl₂·2H₂O；1.0gMgSO₄·7H₂O；8.5g琥珀酸钠；18g琼脂；pH 7.0，30℃恒温培养3d；
6)从菌落数为100左右的平板上挑选形状不同的菌落反复划线纯化，并进行显微镜观察直至获得单菌落作为初筛菌种；
7)对获得的初筛菌种进行性能测试；
8)由此分离出一株高效的具有异养硝化-好氧反硝化能力的细菌，命名为LAD9。
实施例6
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)脱氮条件的确定
碳源的范围
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)LAD9在含有不同碳源(葡萄糖，无水乙酸钠，琥珀酸钠，酒石酸钾钠)的培养基中30℃，160rpm摇床培养5d，氨氮均被降解。说明菌株LAD9能够以上述的碳源进行生长。
温度的范围
Agrobacterium sp.LAD9在15～40℃均能够生长良好，在30～35℃之间脱氮效果最佳。
pH的范围
Agrobacterium sp.LAD9在pH为5～12的条件下都能够进行生长，在偏碱性的条件下脱氮效果最佳。
实施例7
以上所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)为活性成分制备的微生物菌剂。
实施例8
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)的鉴定
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)是从处理垃圾渗滤液的固定化曝气生物滤池中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。
其生理生化特征如下：接触酶、氧化酶、尿素酶反应结果为阳性；不能够进行纤维素和淀粉水解反应；MR结果呈阴性，VP结果呈阳性；能够利用丙酸盐并且在2％NaCl的盐度条件下能够进行生长。
利用上海申能博彩公司生产的3S离心柱型DNA提取试剂盒提取菌株LAD9的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，采用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增产物送交上海生物工程技术有限公司测序，测序结果见序列表所示。
利用BLAST软件对测序结果进行分析比对，最终鉴定菌株LAD9为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)。
实施例9
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株的异养硝化-好氧反硝化性能测定
在以氨氮为氮源，琥珀酸钠为有机碳源的条件下，实施土壤杆菌(Agrobacterium sp.)对氨氮的异养硝化去除和同步硝化反硝化能力测定。具体实施步骤如下：
将土壤杆菌(Agrobacterium sp.)接种于1L含0.5g KNO₃和0.35g NH₄Cl的LB培养基中(每升含NaCl 5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.5％的NaCl洗涤三次，制成光密度OD₆₀₀为1-2的菌悬液。
取10mL所制备的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌悬液，加入三个含有90ml测试培养基(每L含0.25g NH₄Cl，1.0g KH₂PO₄，0.06g FeSO₄·7H₂O，0.2g CaCl₂·2H₂O，1.0g MgSO₄·7H₂O，pH 7.0～7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
实验结果见附图2。由附图2可见，菌株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)对氨氮仍有较强的降解能力，异养硝化速率高。在最初的8h内，氨氮的去除率即达到100％，降解速率为7.95mgN/L·h。从菌株的生长曲线看，在最初的2h内菌株处于静止期，随后的2-6h菌株进入对数生长期，氨氮的降解非常迅速，其降解曲线几乎呈直线下降；此后，微生物生长进入内源呼吸期，菌体几乎没有出现增长。
在反应12h内，总氮的去除率也达到86.54％。大部分的氨氮通过同步异养硝化和好氧反硝化作用被去除，残留的氮素主要以硝酸盐氮的形式存在。其可能的降解途径是将氨氮转化为硝酸盐氮进而将硝酸盐氮还原为气体产物，与传统理论不同的是这两个过程由同一株菌株独立完成。
由此可以看出菌株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)具有较强的异养硝化-好氧反硝化能力。
实施例10
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌株的好氧反硝化性能测定
在以硝酸盐氮为氮源，琥珀酸钠为有机碳源的条件下，实施土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)在好氧条件下对硝酸盐氮的生物去除。具体实施步骤如下：
取10mL按照实例2的方法所制备的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)菌悬液，加入三个含有90ml测试培养基(每L含1.0g KNO₃，1.0g KH₂PO₄，0.06g FeSO₄·7H₂O，0.2g CaCl₂·2H₂O，1.0g MgSO₄·7H₂O，pH 7.0～7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
实验结果见附图3。由附图3可见，菌株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)在好氧的条件下仍对硝酸盐氮有较强的去除能力，28h内实现了对硝酸盐氮100％的去除，去除速率为5.44mgN/L·h；总氮的去除率也达到88.07％。从细菌生长曲线看，在前4h内，微生物处于停滞期，生长速度缓慢，几乎没有对硝酸盐的降解；此后微生物进入对数生长期，硝酸盐氮的浓度几乎呈直线下降；大约在24h后，100％的硝酸盐氮被降解，微生物进入内源代谢，总氮浓度基本没有变化。
实施例11
土壤杆菌(Agrobacterium sp.)处理含氮废水
在水样中加入土壤杆菌(Agrobacterium sp.)，含量为10¹²个细菌/毫升废水，pH为7，氨氮含量120mg/L，COD值为500mg/L，180rpm摇床培养40h，氨氮的去除率在90～95％以上。
应当说明的是，以上实施例只是为了对本发明作进一步详细的描述，不是用来对本发明进行限定的，在不脱离本发明的构思和精神的范围内，本领域普通技术人员，可以进行各种改进或变化，仍然属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<160>1
<210>1
<211>1418
<212>DNA
<213>土壤杆菌(Agrobacterium sp.)
<400>1
1    TGGGGGCGGC TTACACATGC AGTCGACGCC CCGCAAGGGG AGTGGCAGAC
51   GGGTGAGTAA CGCGTGGGAA CATACCCTTT CCTGCGGAAT AGCTCCGGGA
101  AACTGGAATT AATACCGCAT ACGCCCTACG GGGGAAAGAT TTATCGGGGA
151  AGGATTGGCC CGCGTTGGAT TAGCTAGTTG GTGGGGTAAA GGCCTACCAA
201  GGCGACGATC CATAGCTGGT CTGAGAGGAT GATCAGCCAC ATTGGGACTG
251  AGACACGGCC CAAACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGGACAA
301  TGGGCGCAAG CCTGATCCAG CCATGCCGCG TGAGTGATGA AGGCCTTAGG
351  GTTGTAAAGC TCTTTCACCG GAGAAGATAA TGACGGTATC CGGAGAAGAA
401  GCCCCGGCTA ACTTCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGAA GGGGGCTAGC
451  GTTGTTCGGA ATTACTGGGC GTAAAGCGCA CGTAGGCGGA TATTTAAGTC
501  AGGGGTGAAA TCCCAGAGCT CAACTCTGGA ACTGCCTTTG ATACTGGGTA
551  TCTTGAGTAT GGAAGAGGTA AGTGGAATTC CGAGTGTAGA GGTGAAATTC
601  GTAGATATTC GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGGCTTAC TGGTCCATTA
651  CTGACGCTGA GGTGCGAAAG CGTGGGGAGC AAACAGGATT AGATACCCTG
701  GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAATGTTAG CCGTCGGGCA GTATACTGTT
751  CGGTGGCGCA GCTAACGCAT TAAACATTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA
801  AGATTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT
851  GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGCAGAACC TTACCAGCTC TTGACATTCG
901  GGGTTTGGGC AGTGGAGACA TTGTCCTTCA GTTAGGCTGG CCCCAGAACA
951  GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC
1001 CCGCAACGAG CGCAACCCTC GCCCTTAGTT GCCAGCATTT AGTTGGGCAC
1051 TCTAAGGGGA CTGCCGGTGA TAAGCCGAGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA
1101 AGTCCTCATG GCCCTTACGG GCTGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGTGGT
1151 GACAGTGGGC AGCGAGACAG CGATGTCGAG CTAATCTCCA AAAGCCATCT
1201 CAGTTCGGAT TGCACTCTGC AACTCGAGTG CATGAAGTTG GAATCGCTAG
1251 TAATCGCAGA TCAGCATGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC
1301 ACCGCCCGTC ACACCATGGG AGTTGGTTTT ACCCGAAGGT AGTGCGCTAA
1351 CCGCAAGGAG GCAGCTAACC ACGGTAGGGT CAGCGACTGG GGTGAAGTCG
1401 TAACAAGAGC CATGCCTA