发明领域
本发明涉及筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或肉毒碱转运蛋白拮抗剂的方 法、用于实施肉毒碱转运蛋白激动剂或肉毒碱转运蛋白拮抗剂筛选方法的 试剂盒、制备用于治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的药物的方法、诊断肉毒碱转 运蛋白缺陷的方法、蛋白质用于制备与肉毒碱转运蛋白反应的抗体的用途、 寡核苷酸以及治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方法。
技术背景
人肉毒碱缺陷引起多种严重的症状(Rodriguez P.R.等，1988，Eur.J. Pediatr.，148，193-197)。其中最严重的症状有心肌疾病、慢性肌无力和昏 迷等，它们是由低血糖或禁食后的生酮作用衰竭引起的，这是组织特别是 肝、肾、心、肌肉和肠中肉毒碱血清水平低的后果。
肉毒碱缺陷症推测是肾和肠中肉毒碱转运蛋白缺陷的结果(Rodriguez P.R.等，1988)。肾和肠中肉毒碱转运系统的紊乱可能引起脂肪酸转运和降 解的紊乱，导致多种严重症状，特别是渐进性肌无力(可通过脂质肌病和 肉毒碱低肌肉水平诊断)、心肌疾病和呼吸障碍、低血压、呼吸功能不全、 低血糖、肝肿大、肝衰竭、心率失常、意识丧失、肥厚型心肌疾病或扩张 型心肌疾病、婴儿猝死、昏迷、肝功能紊乱、横纹肌溶解、外周神经病变、 视网膜病变、肝病、伴有面中部发育不全的先天性畸形、肾囊肿、张力失 常、新生儿心肌疾病、小头畸形、畸形。全身性肉毒碱缺陷是遗传性疾病， 其症状经常在新生儿和幼儿时期就已发生。
到目前为止，仅有促成罕见的常染色体隐性形式遗传性肉毒碱缺陷的 机制是已知的，其中肉毒碱转运蛋白hOCTN2的突变造成肉毒碱水平的降 低(Nezu J.I.等1999，Nature Genet 21：91-94)。然而，hOCTN2(其氨基 酸序列可自NCBI数据库中以登录号NP_003051获得，对应于本文的SEQ ID NO：12)并不以组织特异性方式在肠和肾中合成，而是在人体中广泛合 成。因此，介导从饮食中摄取肉毒碱和通过从肾滤液中回收肉毒碱在肾中 建立体内稳态(Rodriguez P.R.等，1988)的主要机制仍然未知。
此外，OCTN2不足以在肠和肾中介导肉毒碱摄取，因为它只在肠和 肾上皮的腔侧被检测到，而在需要将肉毒碱转运到血管的远侧则没有 (Lahiouji K等2002，Biochim Biophys Acta 1558：82-93)。很有意义的是， 有关于患全身性肉毒碱缺陷的患者只能通过静脉内施用肉毒碱治疗而不能 通过饮食施用肉毒碱治疗的报道(Rodriguez P.R.等1988，Eur.J.Pediatr. 148：193-197)。
因此，hOCTN2缺陷不是大多数肉毒碱缺陷综合症的适宜标志。
另外，蛋白CT2(其氨基酸序列可在NCBI(美国国家生物技术信息 中心，National Center for Biotechnology Information USA)以登录号 NP_149116获得，对应于本文的SEQ ID NO：14)是只在睾丸中形成的人 肉毒碱转运蛋白。因此，其缺陷不能解释全身性肉毒碱缺陷的症状。
WO 2001077174公开了与本文SEQ ID NO：1对应的蛋白质，但是没 有提供关于该蛋白质作为肉毒碱转运蛋白的信息。以登录号XM_291120 在NCBI数据库获得的氨基酸序列(对应于本文的SEQ ID NO：10)包含 SEQ ID NO：1的完整氨基酸序列和位于SEQ ID NO：1的氨基酸296和 297之间包含39个氨基酸的附加序列(对应于SEQ ID NO：10的氨基酸 297至335)，因此是SEQ ID NO：1的剪接变体。U.S.5,559,021公开了与 本文的SEQ ID NO：1共享47％氨基酸序列同一性的大鼠蛋白质 AAW07635(rB21a)，但是没有提供关于该蛋白质作为肉毒碱转运蛋白的信 息。与AAW07653相对应的人序列以登录号AJ276207见于NCBI数据库， 它与本文的SEQ ID NO：1共享46％的氨基酸序列同一性，然而它被认为 是神经递质转运蛋白。CN 1287170公开了蛋白AAG64193，它与本文的 SEQ ID NO：1共享47％的氨基酸序列同一性，然而它被认为是人神经物 质运输蛋白。EP 881290公开了AAW73376蛋白，即人HPDDV78，它与 本文的SEQ ID NO：1共享46％的氨基酸序列同一性，然而它被认为是神 经递质转运蛋白。本文包括的小鼠和大鼠氨基酸序列SEQ ID NO：2和 SEQ ID NO：3形成公共数据库中可获得的部分序列，但它们未被注释并且 未被认为构成肉毒碱转运蛋白。
从上文可见，没有已知的肠或肾组织特异性合成的肉毒碱转运蛋白， 因此也没有已知的其缺陷能解释大多数肉毒碱缺陷综合征的酶。
因此，目前尚没有在肉毒碱转运蛋白水平上检测大多数肉毒碱缺陷综 合征的诊断方法，而是必须等待相关酶的检测。此外，目前没有在相关紊 乱酶活性的水平上治疗全身性肉毒碱缺陷的治疗方法。目前仅有的治疗方 法是施用肉毒碱，这经常具有肉毒碱从肠的摄取降低或甚至丧失的问题。
发明内容
由此看来，需要提供诊断和治疗肉毒碱缺陷的新方法。因此，本发明 的目的在于提供诊断肉毒碱缺陷的新方法。本发明的另一目的涉及治疗肉 毒碱缺陷的新治疗方法。本发明的又一目的在于诊断肉毒碱缺陷相关疾病 的新方法和治疗肉毒碱缺陷相关疾病的新治疗方法。
本发明提供在肠和肾(特别是人、小鼠和大鼠)中以组织特异性方式 形成的肉毒碱转运蛋白的良好用途。本发明检测的人肉毒碱转运蛋白包含 氨基酸序列SEQ ID NO：1，密切相关的小鼠肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序 列SEQ ID NO：2，密切相关的大鼠肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。本发明尤其涉及开发影响肉毒碱转运蛋白活性的药物的方法和 相关测试试剂盒、制备用于治疗肉毒碱缺陷的药物的方法、制备针对肉毒 碱转运蛋白的抗体的方法、肉毒碱缺陷的诊断方法、用于检测编码肉毒碱 转运蛋白的核酸的寡核苷酸以及用于治疗肉毒碱缺陷的治疗方法。
本发明的第一个优选实施方案涉及筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗 剂的方法，其中所述方法包含以下步骤：(a)提供肉毒碱转运蛋白，(b)提供 测试化合物，和(c)测量肉毒碱转运蛋白的活性。
优选地，筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法包括(a)提供含有 编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的细胞、组织样品或生物，(b)对所述细胞、 组织样品或生物提供测试化合物，和(c)测量肉毒碱转运蛋白的活性。优选 地，测量肉毒碱转运蛋白的活性包括测定编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子 的表达和/或对所述细胞、组织样品或生物提供肉毒碱转运蛋白的底物，并 测量该底物通过肉毒碱转运蛋白穿过所述细胞、组织样品或生物的脂膜的 转运。测定编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的表达优选包括测定核酸分子 的转录活性和/或测定肉毒碱转运蛋白的蛋白质量。
或者，筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法优选包括(a)提供包 含于脂膜之中的肉毒碱转运蛋白，所述脂膜将含有水性介质的两相隔开， (b)对所述至少一相提供测试化合物，和(c)测量肉毒碱转运蛋白的活性，其 中测量肉毒碱转运蛋白的活性包括对至少一相提供肉毒碱转运蛋白的底物 并测量底物穿过所述脂膜的转运。
优选对测试化合物测试对于肉毒碱转运蛋白的激动剂或拮抗剂活性。 优选对多种测试化合物筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂。肉毒碱转运 蛋白的适当底物优选为肉毒碱、去甲肾上腺素、甲基苯基吡啶、肌酸或5- 羟色胺。
优选通过测定肉毒碱转运蛋白对底物的转运率来测量肉毒碱转运蛋白 的活性。优选测定底物穿过脂膜的转运率。优选测定底物从一相至另一相 的转运率。优选地，脂膜分隔实验装置的两个腔，或者封闭形成脂囊泡膜 或形成活细胞或重构细胞的质膜。优选地，脂膜含有肉毒碱转运蛋白，其 取向允许将底物从一个腔转运至另一个腔，或者穿过脂囊泡膜或穿过脂膜 转运。优选地，测定底物穿过脂膜的转运率优选包括测量穿过脂膜转运的 底物量。
优选地，通过测量存在测试化合物时肉毒碱转运蛋白对底物的转运率， 并将其与不存在测试化合物时肉毒碱转运蛋白对底物的转运率进行比较， 来测定测试化合物对于肉毒碱转运蛋白活性的激动剂或拮抗剂活性。方法 优选包括对照测量，其中测量没有肉毒碱转运蛋白时底物通过脂膜的转运。
在本发明的任何实施方案中，肉毒碱转运蛋白的底物是由肉毒碱转运 蛋白转运、优选由植物或动物肉毒碱转运蛋白转运、优选由哺乳动物肉毒 碱转运蛋白转运、优选由人、小鼠或大鼠肉毒碱转运蛋白转运、特别是由 人、小鼠或大鼠肾或肠肉毒碱转运蛋白转运的任何底物。优选的，底物是 由以下肉毒碱转运蛋白转运的任何底物：包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或由包含SEQ ID NO：4的核酸分子编码 的肉毒碱转运蛋白，或者本发明的任一实施方案中公开的肉毒碱转运蛋白。 优选底物为肉毒碱、去甲肾上腺素、甲基苯基吡啶、肌酸和/或5-羟色胺。 更优选底物为肉毒碱。
在本发明的实施方案中，肉毒碱优选包括L-肉毒碱和/或D-肉毒碱， 优选L-肉毒碱。优选地，肉毒碱包括肉毒碱衍生物和/或肉毒碱类似物。 优选地，肉毒碱衍生物包括肉毒碱代谢物和肉毒碱缀合物。优选地，肉毒 碱代谢物包括通过体内L-肉毒碱或D-肉毒碱的化学改变形成的生理肉毒 碱代谢物，如乙酰肉毒碱。优选地，肉毒碱缀合物包括与效应分子偶联的 L-肉毒碱、D-肉毒碱或肉毒碱类似物。优选地，效应分子是通过肉毒碱转 运蛋白与肉毒碱一起共转运通过脂膜的化学化合物。优选地，效应分子为 药物。优选地，偶联可以是任何化学键，优选共价键、离子键或范德华键。 优选地，肉毒碱类似物是具有与肉毒碱类似的化学结构而使其可以被肉毒 碱转运蛋白转运的化学化合物。
本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法优选包括对测试化 合物测试增强肉毒碱转运蛋白活性的激动剂作用。或者包括对测试化合物 测试抑制肉毒碱转运蛋白活性的拮抗剂作用。优选的，本发明筛选肉毒碱 激动剂或拮抗剂的方法适用于筛选大量测试化合物，其中对单个测试化合 物的测试需时很短，并且优选对单个测试化合物的测试是经济的，并且仅 需少量试剂特别是测试化合物。
本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法中测试的测试化合 物优选为小分子，优选是与蛋白质或酶辅因子结合的效应化合物的候选者。 测试化合物优选为这样的效应化合物的候选者，所述效应化合物能与包含 氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的蛋白质或 本发明实施方案中公开的任何肉毒碱转运蛋白结合。
优选地，测试化合物是能与蛋白质或酶辅因子结合的效应化合物的候 选者，其中所述蛋白质或酶辅因子与包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的蛋白质或本发明实施方案中公开的任何肉毒 碱转运蛋白结合的化合物结合，或为其候选者。
优选地，测试化合物是能与转录因子或翻译因子结合的效应化合物的 候选者，优选其中转录因子或翻译因子提高或降低包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的蛋白质的合成，或者提高或降 低本发明实施方案中公开的任何肉毒碱转运蛋白的合成。
优选地，测试化合物是能直接或间接提高或降低转录因子或翻译因子 的合成或活性的效应化合物的候选者，优选其中转录因子或翻译因子提高 或降低含有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3 的蛋白质的合成，或者提高或降低本发明实施方案中公开的任何肉毒碱转 运蛋白的合成。
优选地，测试化合物是任何化合物，如天然存在化合物或与天然存在 化合物相同或相似的化学合成化合物或在自然界中不存在的任何化学合成 化合物。
天然存在化合物优选是可从多细胞或单细胞生物中检测或分离的化合 物，特别是可以从动物、植物、真菌、酵母、细菌或其他含细胞微生物或 病毒中检测或分离的化合物。优选通过组合化学合成在自然界中不存在的 化学合成化合物。其优选含有前导结构，所述前导结构来自天然存在的化 合物，优选来自能与蛋白酶或酶辅因子结合的效应分子的候选者。
优选地，根据本发明方法鉴定或在本发明实施方案中使用的肉毒碱转 运蛋白激动剂或拮抗剂分别增强或抑制个体(优选健康个体)肾或肠肉毒 碱转运蛋白的活性。优选地，肉毒碱转运蛋白激动剂增强患肉毒碱转运蛋 白缺陷的个体中肉毒碱转运蛋白的活性。优选地，肉毒碱转运蛋白激动剂 增强肉毒碱转运蛋白数量降低的个体中肉毒碱转运蛋白的活性。优选地， 肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂分别增强或降低个体中肉毒碱转运蛋白遗 传变体的活性。优选地，肉毒碱转运蛋白激动剂增强与肉毒碱缺陷相关的 肉毒碱转运蛋白遗传变体的活性。优选地，肉毒碱转运蛋白拮抗剂降低肉 毒碱转运蛋白活性提高或肉毒碱转运蛋白量增加的个体中肉毒碱转运蛋白 (优选肾或肠肉毒碱转运蛋白)的活性。优选地，本文所述的肉毒碱转运 蛋白活性指肉毒碱转运蛋白对底物的转运率、肉毒碱转运蛋白的量和/或编 码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的表达强度。
优选地，本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法中提供的 肉毒碱转运蛋白也可用于本发明的任何其他实施方案。肉毒碱转运蛋白优 选为植物或动物肉毒碱转运蛋白，优选哺乳动物肉毒碱转运蛋白，优选人、 小鼠或大鼠肉毒碱转运蛋白，优选肾或肠肉毒碱转运蛋白，优选肠肉毒碱 转运蛋白。
优选地，肉毒碱转运蛋白包含本发明的氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。优选地，肉毒碱转运蛋白为健康个体的 肾或肠中产生的高亲和力肉毒碱转运蛋白。优选地，肉毒碱转运蛋白包含 人肾和肠的高亲和力肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：1。优选 地，肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，它是SEQ ID NO：1 的功能性剪接变体，包含位于SEQ ID NO：1的氨基酸296和297之间的 39个氨基酸的附加序列(对应于SEQ ID NO：10中的氨基酸297至335)。
优选地，肉毒碱转运蛋白是健康动物的肾或肠中产生的直系同源小鼠 或大鼠高亲和力肉毒碱转运蛋白。优选地，肉毒碱转运蛋白分别包含小鼠 或大鼠肾和肠高亲和力肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO：3。
优选地，肉毒碱转运蛋白是包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO：3相关的氨基酸序列的相关肉毒碱转运蛋白。优选地，肉毒碱 转运蛋白含有与SEQ ID NO：1相关的氨基酸序列。优选地，肉毒碱转运 蛋白含有与SEQ ID NO：10相关的氨基酸序列。
优选地，相关肉毒碱转运蛋白含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10至少之一具有至少30％序列同一性的氨 基酸序列，并且对至少一种底物(优选肉毒碱，优选L-肉毒碱)而言具有 包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10(优选SEQ ID NO：1)的 肉毒碱转运蛋白的底物转运活性的至少10％、优选至少30％、更优选至少 50％、更优选至少70％。
优选地，相关肉毒碱转运蛋白包含以下蛋白质的氨基酸序列：以登录 号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开 的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人 HPDDV78。
优选地，相关肉毒碱转运蛋白包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10至少之一具有至少60％序列同一性的氨 基酸序列，并且对至少一种底物(优选肉毒碱、优选L-肉毒碱)而言具有 含有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10(优选SEQ ID NO：1)的 肉毒碱转运蛋白的底物转运活性的至少10％、优选至少30％、更优选至少 50％、更优选至少70％、更优选至少80％或至少90％。
优选地，肉毒碱转运蛋白包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10至少之一具有至少85％、优选至少86％、优 选至少86.5％序列同一性的氨基酸序列，并且对至少一种底物(优选肉毒 碱、优选L-肉毒碱)而言具有含有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO： 10(优选SEQ ID NO：1)的肉毒碱转运蛋白的底物转运活性的至少10％、 优选至少30％、更优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少80％或 至少90％。
优选地，肉毒碱转运蛋白含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10至少之一具有至少95％、优选至少95.4％序 列同一性的氨基酸序列，并且对至少一种底物(优选肉毒碱、优选L-肉毒 碱)而言具有含有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO：10的肉毒碱转运蛋白的底物转运活性的至少10％、优选 至少30％、更优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少80％或至少 90％。
优选地，肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列通过所谓保守性氨基酸取代而 有别于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10 的氨基酸序列，所述保守性氨基酸取代为技术人员所公知，并认为对蛋白 质的活性没有或几乎没有影响，因而对肉毒碱转运蛋白的活性没有或几乎 没有影响。优选地，肉毒碱转运蛋白通过氨基酸取代有别于SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10，技术人员在考虑下 文图3中公开的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之间的 氨基酸序列比对后认为所述氨基酸替换对肉毒碱转运蛋白的活性没有影响 或几乎没有影响。
优选地，本发明任何实施方案中使用的肉毒碱转运蛋白由编码肾和/ 或肠中产生的人肉毒碱转运蛋白的核酸分子编码。优选地，所述核酸分子 在肾和/或肠中组织特异性表达。优选地，核酸分子编码的人或小鼠或大鼠 肉毒碱转运蛋白包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/ 或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
优选地，核酸分子包含SEQ ID NO：4，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的人肾和肠肉毒碱转运蛋白。优选地，核酸分子包含SEQ ID NO：5， 其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的直系同源小鼠肾和肠肉毒碱转运 蛋白。优选地，核酸分子包含SEQ ID NO：8，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的直系同源大鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白。
优选地，核酸分子包含SEQ ID NO：9，它是SEQ ID NO：4的功能性 剪接变体，编码氨基酸序列SEQ ID NO：10。SEQ ID NO：9包含在SEQ ID NO：4的核苷酸887和888之间插入的117个核苷酸(对应于SEQ ID NO： 9的核苷酸888至1004)。
优选地，肉毒碱转运蛋白由包含SEQ ID NO：15的人肾和肠肉毒碱转 运蛋白mRNA编码。SEQ ID NO：15包含SEQ ID NO：4的开放读框和额 外的非翻译5’和3’侧翼序列。本发明首次提供了包含SEQ ID NO：15的完 整mRNA，其编码包含SEQ ID NO：1的肉毒碱转运蛋白。SEQ ID NO：15 包含开放读框SEQ ID NO：4(编码SEQ ID NO：1)、5’侧翼区(包含SEQ ID NO：15的核苷酸1至45)和的3’侧翼区(包含SEQ ID NO：15的核苷酸1951 至5175)。
优选地，肉毒碱转运蛋白由技术人员可检测的核酸分子编码，其中技 术人员使用例行实验检测由包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15相似序列的核酸分子所编码的肉 毒碱转运蛋白。优选地，肉毒碱转运蛋白由与SEQ ID NO：4相似的核酸 序列编码。优选地，核酸分子与SEQ ID NO：9相似。优选地，核酸分子 与SEQ ID NO：15相似。
优选地，通过检测含有已知序列的核酸分子的例行实验可检测编码肉 毒碱转运蛋白的核酸分子。优选地，通过检测含有与已知序列相似(优选 与已知核酸序列相关，优选与已知核酸序列同源)序列的核酸分子的例行 实验可检测编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子。
优选地，肉毒碱转运蛋白由与编码氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核酸分子相似的核酸分子编码。
优选地，如果核酸分子包含具有可检测程度的序列同源性(这是技术 人员易于鉴别的)、优选具有可检测程度的序列同一性的序列，则它与编 码本发明任一实施方案的肉毒碱转运蛋白的核酸分子相似。优选地，如果 核酸分子编码包含与可用于本发明的肉毒碱转运蛋白具有可检测程度序列 同源性(优选具有可检测程度的序列同一性)的序列的蛋白质，则核酸分 子与编码本发明任一实施方案的肉毒碱转运蛋白的核酸分子相似。优选地， 无需过度劳动就可以在杂交实验中检测核酸分子之间的序列同一性和序列 同源性，其中在严格或非严格条件下允许互补碱基配对。
优选地，如果核酸分子与包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15或其互补序列的核酸分子杂交， 或者与其包含至少18个核苷酸、优选至少25个核苷酸、优选至少50个核 苷酸的片段或其互补序列杂交，则它与编码本发明实施方案的肉毒碱转运 蛋白的核酸分子相似。优选使用非严格条件，更优选使用严格条件。以类 似的方式确定编码氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO：10的核酸分子的相似性。
优选地，编码本发明实施方案的肉毒碱转运蛋白的核酸分子可被技术 人员检测，其中技术人员在检测中使用SEQ ID NO：15的5’侧翼区或SEQ ID NO：15的3’侧翼区，优选3’侧翼区。优选使用SEQ ID NO：153’区的 片段，所述片段优选包含至少18个核苷酸，优选至少25个核苷酸，优选 至少50个核苷酸。优选使用非严格条件，更优选使用严格条件。检测优选 包括杂交测定或PCR分析，二者均基于熟知的互补碱基配对概念。
杂交的非严格条件和严格条件是技术人员所公知的。优选地，非严格 条件包括3×SSC、0.5％N-十二烷基肌氨酸钠，60℃。优选地，严格条件包 括1×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，65℃。优选地，20×SSC包含 3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0。
在涉及提供包含于脂膜中的肉毒碱转运蛋白的本发明筛选肉毒碱转运 蛋白激动剂和拮抗剂的方法中，肉毒碱转运蛋白优选包含于细胞膜中，优 选线粒体内膜或质膜。合适的膜脂可以是天然存在的细胞膜膜脂和/或自然 界中未知但为化学家已知的形成膜的脂类。
优选地，脂膜包含形成膜的脂类，所述膜中可包含肉毒碱转运蛋白。 这些脂类是技术人员所公知的。优选地，可以使用脂类形成脂质体。优选 地，脂类是细胞膜的组分或来自细胞膜(优选质膜或线粒体内膜)。优选 地，脂类与生物膜的脂类相同或具有相似的化学结构，并能够在水性介质 中形成具有两个亲水表面的脂双层或脂单层。
优选地，包含肉毒碱转运蛋白的脂膜将含有水性介质的两相分开。优 选地，两相为实验装置的两个缓冲液池。
包含肉毒碱转运蛋白的脂膜优选包括重构细胞膜。重构细胞膜优选来 自活细胞。形成重构细胞膜的方法为技术人员所公知。
优选地，肉毒碱转运蛋白包含于脂囊泡膜中。优选地，脂囊泡包含脂 质体或封闭的重构细胞膜。可通过任何合适的方法形成脂质体或重构细胞 膜。优选地，通过使包含至少一类膜脂和肉毒碱转运蛋白的混合物暴露于 超声波或者通过使混合物通过小径出口(特别是注射器)引入缓冲溶液来 形成脂质体或重构膜囊泡。优选地，通过打开活细胞、提供肉毒碱转运蛋 白和重新封闭脂膜来产生重构细胞。在细胞的打开和重新封闭过程中细胞 质可以损失或无损失，因此包含肉毒碱转运蛋白的重构质膜可以属于活细 胞或者是所谓的血影膜(ghost)。
在优选的实施方案中，肉毒碱转运蛋白包含于测试细胞的质膜中。优 选地，测试细胞表达编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子，其中优选植物或动 物肉毒碱转运蛋白，优选哺乳动物、优选小鼠或大鼠肉毒碱转运蛋白，优 选人肉毒碱转运蛋白，优选肾或肠肉毒碱转运蛋白，优选人、小鼠或大鼠 肾或肠肉毒碱转运蛋白
优选地，测试细胞表达编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子，所述肉毒碱 转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635 (rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即 EP 881290中公开的人HPDDV78，优选测试细胞表达编码SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO：1或 SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO：1的核酸。优选地，测试细胞表达包含 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的核酸分子。优选地，测试细胞包含与转录激 活子序列有效连接的任一所述核酸分子，优选与转录激活子序列有效连接 的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15，优选SEQ ID NO：4 或SEQ ID NO：15。优选地，测试细胞包含可翻译RNA分子，所述RNA 分子包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15相应的序列。优选地，测试细胞包含显微注射 的cRNA分子，所述cRNA分子包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或 SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15相应的序列。
优选地，测试细胞在其质膜中包含功能性肉毒碱转运蛋白。优选地， 肉毒碱转运蛋白穿过质膜转运选自肉毒碱、去甲肾上腺素、甲基苯基吡啶、 肌酸和/或5-羟色胺的底物。优选地，肉毒碱转运蛋白将底物转运至测试细 胞之中。优选地，测试细胞为细菌或真核细胞，特别是酵母细胞。优选地， 测试细胞属于原代细胞系或永生化细胞系。优选地，测试细胞为非洲爪蟾 (Xenopus laevis)卵母细胞。优选地，非洲爪蟾卵母细胞包含注射的 cRNA，所述cRNA包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15、 优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的序列。
优选地，使用肉毒碱转运蛋白的可检测底物。可检测底物优选允许在 测试细胞内进行检测。优选地，可检测底物允许对测试细胞内累积的小量 可检测底物进行定量。
本发明对测试化合物进行肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂活性筛选的 方法优选包括测量肉毒碱转运蛋白穿过脂膜(特别是穿过脂膜进入细胞) 转运的可检测底物量，其中穿过脂膜的底物量指示肉毒碱转运蛋白的活性。
优选地，可检测肉毒碱转运蛋白底物为放射性标记的底物、链霉抗生 物素蛋白标记的底物或生物素化的底物，或与抗体反应的底物。
优选地，以化学化合物文库的形式提供用于筛选肉毒碱转运蛋白激动 剂或拮抗剂活性的测试化合物。根据本发明，术语“化学化合物文库”指汇 集自任何多种来源(包括化学合成分子和天然产物)或通过组合化学技术 产生的多种化学化合物。
优选地，本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法是自动化 的，优选在机器人系统中进行。
本发明的第二个优选实施方案涉及实施本发明筛选肉毒碱转运蛋白激 动剂或拮抗剂方法的试剂盒，所述试剂盒包括含有肉毒碱转运蛋白的脂膜 和肉毒碱转运蛋白的可检测底物。本发明的试剂盒优选允许筛选包含于测 试化合物组(特别是化合物文库)中的测试化合物。
优选地，本发明试剂盒中提供的肉毒碱转运蛋白为人、小鼠或大鼠肉 毒碱转运蛋白。优选地，肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获 得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质 AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优 选SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10，优 选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO：1。优选地，肉毒 碱转运蛋白由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的核酸分子编码，或由编 码至少一种所述蛋白质的核酸编码。优选地，脂膜分隔实验装置中的两个 相(特别是两个缓冲液池)，或者封闭形成脂囊泡或形成活细胞或重构细 胞的质膜。优选地，肉毒碱转运蛋白包含于脂囊泡膜中。优选地，肉毒碱 转运蛋白包含于测试细胞的质膜中。
优选地，本发明的试剂盒包括肉毒碱转运蛋白的可检测底物，特别是 放射性、链霉抗生物素蛋白标记或生物素化底物或可用抗体检测的底物。 优选地，试剂盒包括与底物反应的抗体。优选地，底物为肉毒碱、去甲肾 上腺素、甲基苯基吡啶、肌酸和/或5-羟色胺。优选地，底物为肉毒碱。
在本发明的任何实施方案中，“抗体”这一表述包括含有与本文所示抗 原的反应性的任何单克隆抗体、抗血清(特别是多价抗血清)、抗血清级 分、抗体片段、重组产生的抗体或抗体片段。
优选地，本发明的试剂盒包括本发明筛选肉毒碱激动剂或拮抗剂方法 的任何组分或要素。
本发明的第三个优选实施方案涉及制备用于治疗肉毒碱转运蛋白缺陷 的药物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)使用本发明筛选肉毒碱 转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法鉴定肉毒碱转运蛋白激动剂，(b)提供 足量的所述激动剂，和(c)将所述激动剂与一种或多种可药用载体或辅助 物质配制在一起。
优选地，所述方法涉及制备用于治疗肾或肠肉毒碱转运蛋白的肉毒碱 转运蛋白缺陷的药物。优选地，所述方法涉及制备用于治疗全身性肉毒碱 缺陷的药物。
优选地，所述方法涉及制备用于治疗肉毒碱、去甲肾上腺素、甲基苯 基吡啶、肌酸和/或5-羟色胺转运缺陷的药物。优选地，所述方法涉及制备 用于治疗由本发明的人或动物肉毒碱转运蛋白所转运的底物缺陷的药物， 所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质 AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质 AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1，或者所述肉毒碱转运蛋白由包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO：15的核酸分子编码，或由编码至少一种所述蛋白质的核 酸编码。优选地，所述方法涉及制备用于治疗由具有与本发明肉毒碱转运 蛋白相似的氨基酸序列的任何肉毒碱转运蛋白所转运的任何底物缺陷的药 物，所述缺陷可以如本文所公开进行检测，或者可以由技术人员基于本文 的公开内容无需过度实验负担地检测。
优选地，本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂的任何方面还涉及以下步 骤：鉴定本发明方法的肉毒碱转运蛋白激动剂以用于制备治疗肉毒碱转运 蛋白缺陷的药物。
在制备药物的方法中，足量的激动剂优选为治疗有效量，优选为药物 单位给药剂量的治疗有效量。优选地，治疗有效量在治疗上足以用于治疗 肉毒碱转运蛋白缺陷，所述肉毒碱转运蛋白缺陷由患者中功能性肉毒碱转 运蛋白量的降低引起，或者由患者中活性降低的肉毒碱转运蛋白变体引起。
任一特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括已鉴定 的肉毒碱转运蛋白激动剂的活性、剂型、患者的年龄、体重和性别、治疗 的持续时间和医药领域所熟知的其他因素。优选地，单位剂量在治疗上足 以用于治疗成人、儿童、幼儿、新生儿或用于治疗妊娠期的未出生儿童。
以单次剂量或分次剂量施用于人或其他哺乳动物的本发明肉毒碱转运 蛋白激动剂的日总剂量在量上可以从例如约0.01至约50mg/千克体重或更 优选地从约0.1至约25mg/千克体重。单次剂量组合物可以含有构成日剂 量的这些量或其因数。一般而言，本发明的治疗方案包括每天以单次剂量 或多次剂量对需要这种治疗的患者施用从约10mg至约1000mg的本发明 肉毒碱转运蛋白激动剂。
优选地，将一种以上肉毒碱转运蛋白激动剂的组合用于制备药物。药 物还优选额外包含肉毒碱。优选地，根据单位剂量药物中包含的肉毒碱转 运蛋白激动剂所介导的肉毒碱转运蛋白活性调整单位剂量的药物中所包含 肉毒碱的量。
就药物的产生而言，优选将本发明的肉毒碱转运蛋白激动剂与一种或 多种可药用添加剂或辅助物质配制在一起，所述添加剂或辅助物质为例如 生理缓冲液如氯化钠缓冲液、软化水、稳定剂如蛋白酶或核酸酶抑制剂、 优选抑酶肽、ε-氨基己酸或胃酶抑制剂A、螯合剂如EDTA、凝胶制剂如 白凡士林、低粘度石蜡油和/或黄蜡等(取决于施用类型)。
其他合适的添加剂为例如洗涤剂如Trion X-100或去氧胆酸钠以及多 元醇如聚乙二醇或甘油、糖如蔗糖或葡萄糖、兼性离子化合物如氨基酸(如 甘氨酸或尤其是牛磺酸或甜菜碱)和/或蛋白质如牛或人血清白蛋白。优选 洗涤剂、多元醇和/或兼性离子化合物。
生理缓冲液优选具有约6.0-8.0的pH(特别是约6.8-7.8的pH，尤其 是约7.4的pH)和/或约200-400毫渗透压摩尔/升(优选约290-310毫渗 透压摩尔/升)的摩尔渗透压浓度。通常使用适当的有机或无机缓冲液调整 药物组合物的pH，例如优选使用磷酸缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基 甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉 代-1-丙磺酸)。各缓冲液的选择通常取决于所需的缓冲液摩尔浓度。例如， 磷酸缓冲液适于注射和输注溶液。
可以以常规方式施用药物组合物，如通过口服剂型的方式如片剂或胶 囊、通过粘膜方式如通过鼻腔或口腔、以dispositories的形式植入皮肤下、 通过含有本发明药物组合物的注射剂、输注剂或凝胶的方式。适当时，还 可以以脂质体复合体的形式外用和局部施用药物组合物。此外，可以通过 经皮治疗系统(TTS)进行治疗，它使得可以时序控制地释放药物组合物。 可以例如EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1中了解TTS、
如果仅需对机体施用相对小量的溶液或悬液(如约1至约20ml)， 则一般使用注射液。如果需要施用较大量的溶液或悬液(如1升或更多升)， 则一般使用输注液。与输注液相反，由于在注射液的情况下仅施用几毫升， 因此就痛觉而言，注射中血或组织液的pH和渗透压的微小差异使其不被 察觉或仅以不显著的程度被察觉。因此在使用前稀释本发明的制剂一般不 是必要的。然而，对于施用相对大量的情况，应该在施用前将本发明的制 剂快速稀释至获得至少大致等渗溶液的程度。等渗溶液的实例为0.9％浓度 的氯化钠溶液。对于输注的情况，可以使用如无菌水进行稀释，并通过例 如所谓的分流术进行施用。
药物组合物可以制备用于口、鼻、直肠、肠胃外、阴道、外用或阴道 给药。肠胃外给药包括皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内给药。
此外，本发明还涉及肉毒碱转运蛋白的激动剂和拮抗剂，它们可使用 本发明筛选肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的方法进行鉴定。
本发明第四个优选的实施方案涉及诊断动物(优选人患者)中肉毒碱 转运蛋白效率的方法。优选地，所述方法包括测定得自动物或人患者的组 织样品中肉毒碱转运蛋白的量，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号 AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的 蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人 HPDDV78，优选包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或 SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO： 1。
优选在诊断方法中使用与肉毒碱转运蛋白反应的抗体。优选使用本发 明的抗体。优选测定与抗体反应的蛋白质的存在与否，其指示着组织样品 中肉毒碱转运蛋白的存在与否。
在优选的实施方案中，使用与肉毒碱转运蛋白缺陷相关肉毒碱转运蛋 白变体反应的抗体。(使用抗体测定肉毒碱转运蛋白或其变体的量的)本 发明诊断方法包括本领域的任何免疫学方法或在未来可用的方法，其中使 用抗体测定其抗原的量。优选地，本发明涉及使用本领域已知的ELISA 试验来确定组织样品中肉毒碱转运蛋白或其变体的存在与否。优选使用 ELISA试验来确定得自患者的组织样品中肉毒碱转运蛋白与健康个体相 比的相对量。优选地，本发明涉及本领域已知的Western分析，其中可以 测定组织样品中肉毒碱转运蛋白或其变体的量和大小。
在优选的实施方案中，诊断方法为使用组织样品进行的体外诊断方法， 所述组织样品在本发明的诊断方法之前由动物或人患者获得。
在另一优选的实施方案中，诊断方法包括额外的起始步骤，其中组织 样品得自动物或人患者。优选地，诊断方法包括至少一个在动物或人患者 体内进行的步骤。
本发明的第五个优选实施方案涉及蛋白质或其片段用于制备与肉毒碱 转运蛋白反应的抗体的用途，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获 得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质 AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78优选 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10、优选SEQ ID NO：1，所述肉毒碱转运 蛋白分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635 (rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即 EP 881290中公开的人HPDDV78、优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10、 优选SEQ ID NO：1。优选使用与肉毒碱转运蛋白缺陷相关的肉毒碱转运蛋 白变体。
本发明抗体的制备涉及本领域可用或在未来可用的任何抗体生产方 法。本发明抗体的制备涉及本文提到的“抗体”的任何意义的表述。
优选将与动物或人患者的肉毒碱缺陷相关的肉毒碱转运蛋白变体用于 制备抗体。与肉毒碱缺陷相关的肉毒碱转运蛋白变体为患肉毒碱缺陷(优 选全身性肉毒碱缺陷)的动物或优选人患者的组织样品中包含的肉毒碱转 运蛋白。肉毒碱转运蛋白变体优选包含于来自肾或肠的组织样品中。
本发明的第六个优选实施方案涉及确定与肉毒碱转运蛋白缺陷相关的 肉毒碱转运蛋白变体，其中所述方法包括以下步骤：(a)测定编码与肉毒 碱转运蛋白缺陷相关的变体的核酸序列，所述变体为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的 大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193 或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1的变体，和(b)推导所述 肉毒碱转运蛋白的所述变体的氨基酸序列。
优选使用含有肉毒碱转运蛋白变体的动物组织样品或人组织样品测定 核酸序列。优选测定组织样品中包含的核酸分子的核酸序列。优选地，核 酸序列对应于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO： 15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15，或者核酸编码肉毒碱转运蛋 白变体，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO： 2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白 质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质 AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或 SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO： 10，优选SEQ ID NO：1。
优选使用任一本领域测定核酸序列的方法(特别是使用DNA测序方 案)或任何未来可用的测定核酸序列的方法进行核酸序列的测定。
优选使用本领域已知的明确的所谓遗传密码从编码肉毒碱转运蛋白变 体的核酸序列推导肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列，遗传密码为编码蛋白质 的核苷酸序列开放读框中每个核苷酸碱基三联体指定一个单个氨基酸。
本发明的第七个优选实施方案涉及诊断肉毒碱转运蛋白缺陷的方法， 其中方法包括测定组织样品中编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的量，所述 肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635 (rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即 EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10， 优选SEQ ID NO：1，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1。优选测定编码包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8 或SEQ ID NO：15、优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的核酸的量。
优选测定DNA分子的量。优选测定RNA分子的量。优选测定包含 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优选 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的DNA分子的量或相应RNA分子的量。 优选测定编码氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635 (rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即 EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10， 优选SEQ ID NO：1，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1的DNA分子的量或相应RNA分子的量。
优选地，诊断方法包括使用任何本领域已知方法或未来可用的方法测 定核酸分子的量，所述核酸分子包含已知序列或与已知核酸序列具有可检 测的相似性。优选地，诊断方法包括在编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子与 本发明的互补核酸探针之间进行互补碱基配对的步骤。
优选地，本发明的核酸探针包括这样的核酸分子，所述核酸分子包含 编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的互补序列。优选地，核酸探针包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的互补序列。优选地，核酸探针在非严格条件下 (优选在严格条件下)与编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子杂交。优选地， 核酸探针包括至少含有18个核苷酸的寡核苷酸。
优选地，本发明的核酸探针与核酸分子变体杂交，所述核酸分子变体 编码与肉毒碱转运蛋白缺陷相关的肉毒碱转运蛋白变体。优选地，核酸分 子变体包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO： 15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的变体。
优选地，互补碱基配对不仅指编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子与包含 互补序列的核酸探针之间的碱基配对，还指核酸分子的变体与核酸探针之 间的碱基配对，其中核酸探针仅与该核酸分子变体部分地互补。优选地， 互补碱基配对使得可以检测任何编码肉毒碱转运蛋白变体的核酸分子，所 述核酸分子与编码健康个体肉毒碱转运蛋白的核酸分子具有可检测的相似 性。
优选地，涉及核酸分子或核酸分子编码的肉毒碱转运蛋白或其任何变 体(特别是与肉毒碱转运蛋白缺陷相关的任何变体)或其任何直系同源或 同源变体的本发明任何实施方案还指包含相似序列(特别是如本文所述的) 的核酸分子。相似序列优选以互补碱基配对杂交。相似序列优选在非严格 条件下杂交，优选在严格条件下杂交。
优选地，诊断方法涉及本领域核酸分子的杂交方法，特别是本领域的 Southern杂交方法用于检测组织样品中编码肉毒碱转运蛋白的DNA分子 或本领域的Northern杂交方法用于检测组织样品中编码肉毒碱转运蛋白 的RNA分子。优选地，与组织样品中的DNA分子或RNA分子杂交的本 发明核酸探针为DNA芯片的组分。优选地，诊断方法包括与本发明核酸 探针杂交之前进行的从组织样品中提取DNA分子或RNA分子的步骤。
优选地，诊断方法涉及扩增组织样品中编码肉毒碱转运蛋白的核酸分 子的步骤。优选地该方法涉及本领域已知的用于扩增核酸分子的聚合酶链 式反应(PCR)。优选扩增组织样品中包含的DNA分子。或者，在将RNA 分子反转录成DNA分子的额外起始步骤之后，扩增组织样品中包含的 RNA分子。
本发明的第八个优选实施方案涉及包含SEQ ID NO：6或包含SEQ ID NO：7的互补序列的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸使得可以有利地分离肾 和肠的人高亲和力肉毒碱转运蛋白的基因。
优选地，在本发明诊断肉毒碱转运蛋白缺陷的方法中使用包含SEQ ID NO：6或包含SEQ ID NO：7的互补序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸优选用 作聚合酶链式反应(PCR)的引物。所述寡核苷酸优选用作DNA阵列的 组分。
本发明的第九个优选实施方案涉及测定编码与肉毒碱转运蛋白缺陷相 关的肉毒碱转运蛋白变体的核酸分子变体的方法，其中所述方法包括以下 步骤：(a)使用本发明第七个优选实施方案中诊断肉毒碱转运蛋白缺陷的 方法从组织样品中分离编码肉毒碱转运蛋白变体的核酸分子，和(b)测 定所述核酸分子的核酸序列。
本发明的第十个优选实施方案涉及治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方法， 其中所述方法包括将编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子引入细胞，所述肉毒 碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635 (rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即 EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10， 优选SEQ ID NO：1。优选将包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的DNA 分子引入细胞。优选地，所述DNA序列包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO： 5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO： 15有效连接的转录启动子序列。
本发明的第十一个优选实施方案涉及治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方 法，其中所述方法包括增强细胞中编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的转录 活性，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质 AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质 AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或 SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1。优选增强包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的细胞基因的活性。
在本发明治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方法中，引入了核酸分子或增强 了编码肉毒碱转运蛋白的核酸分子的转录活性的细胞优选为肾细胞、肠细 胞、肠细胞、肝细胞、心细胞和/或肌细胞。
优选地，本发明治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方法涉及治疗肉毒碱、去 甲肾上腺素、甲基苯基吡啶、肌酸和/或5-羟色胺转运蛋白或这样的蛋白质 所接纳的任何底物的缺陷，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、以登录号AJ276207获 得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质 AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中公开的人HPDDV78，优 选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1。优选地，所述 方法涉及治疗全身性肉毒碱缺陷。
优选地，本发明治疗肉毒碱转运蛋白缺陷的方法为在体外处理细胞的 体外方法。优选在本发明治疗方法的步骤之前从患者分离细胞。
本发明治疗方法的其他优选的实施方案涉及将编码肉毒碱转运蛋白的 核酸分子引入人体(优选肾和肠)包含的细胞中，所述肉毒碱转运蛋白包 含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 10、以登录号AJ276207获得的大鼠蛋白质AAW07635(rB21a)、CN 1287170中公开的蛋白质AAG64193或蛋白质AAW73376即EP 881290中 公开的人HPDDV78，优选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10，优选SEQ ID NO：1。或者首先在体外操作细胞，接着再转移进人体。
优选地，本发明治疗方法中使用的细胞得自肾或肠，特别是得自肠。
可以以裸露形式、基因转移载体的形式或与脂质体或金颗粒复合将包 含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15，优 选SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：15的核酸分子引入本发明筛选方法的测 试细胞或本发明治疗方法所使用的人细胞之中。
基因转移载体的实例为病毒载体，如腺病毒载体或逆转录病毒载体 (Lindemann等(1997)，Mol.Med.，3，466-76；Springer等(1988)Mol. Cell.，2，549-58)。与脂质体的复合体通常得到很高的转染效率，特别是对 于皮肤细胞(Alexander和Akhurst，1995，Hum.Mol.Genet.4：2279-85)。 在脂转染中，通过超声处理脂质体悬液制备由阳离子脂质组成的小单室囊 泡。DNA以此种比例离子结合在脂质体的表面，从而保持正的净电荷并且 所有的质粒DNA都与脂质体复合。除了Feigner，P.L.等(1987)，Proc.Natl. Acad.Sci USA，84，7413-7414使用的DOTMA(1，2-二油酰氧丙基-3-溴化 三甲铵)和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)以外，现已合成了大量脂质制 剂并测试了其在多种细胞系转染中的效率(Behr等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA，86，6982-6986；Gao和Huang(1991)，Biochim.Biophys.Acta， 1189，195-203；Feigner等(1994)J.Biol.Chem.，269，2550-2561)。脂质制剂 的实例为DOTAP N-[1-(2，3-油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸甲酯铵或 DOGS(二(十八烷基)氨基甘氨酰精胺)(dioctadecylamidoglycylspermine)。
提高核酸进入细胞的转移辅助物质可以是例如与DNA或合成肽-DNA 分子结合的蛋白质或肽，其使待转运的核酸可以进入细胞核(Schwartz等 (1999)Gene Therapy 6：282；Branden等(1999)Nature Biotech.，17，784)。 辅助物质还包括能够使核酸释放到细胞质的分子(Planck等(1994)J.Biol. Chem.，269，12918；Kichler等(1997)Bioconj.Chem.，8，213)或例如脂质 体(Uhlmann和Peyman(1990)，同前)。
可以通过将上文所述核酸应用于金颗粒并使用所谓的“基因枪”将这些 颗粒射进组织或细胞中来获得另一种特别适合的形式(Wang等(1999)J. Invest.Dermatol.112：775-81，Tuting等(1998)J.Invest.Dermatol.111： 183-8)。
在下文的附图、序列和实施例中，参照附图1和2以及实施例更详细 地描述了本发明的一些优选实施方案。然而优选实施方案的细节并不旨在 限制本发明。相反，本发明涉及包含与本文的实施方案中的明确表述不同， 但可由技术人员无需过度努力而发现的细节的任何实施方案。
附图说明
图1显示举例说明本发明方法中涉及的肉毒碱转运蛋白对于不同底物 的活性的直方图。图1显示测定包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的肉毒碱 转运蛋白对下述底物的活性的实例：L-肉毒碱(柱1)、去甲肾上腺素(柱 2)、甲基苯基吡啶(柱3)和5-羟色胺(柱4)。在图1中，左侧柱(1)到(4) 表示肉毒碱转运蛋白对各个底物的转运率(pmol小时-1卵母细胞-1)。右侧 柱(1)到(4)表示不含肉毒碱转运蛋白的合适对照的转运率。
包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的肉毒碱转运蛋白具 有与图1中所示包含SEQ ID NO：1的肉毒碱转运蛋白相当的活性。包含 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的肉毒碱转运蛋白还转运 肌酸。
图1显示使用非洲爪蟾卵母细胞得到的结果，在所述细胞中注射了包 含SEQ ID NO：4的cRNA和放射性标记底物L-肉毒碱(柱1)、去甲肾 上腺素(柱2)、甲基苯基吡啶(柱3)和5-羟色胺(柱4)。示于每个柱 右半边的对照包括使用以水代替cRNA注射的非洲爪蟾对每个底物进行的 对照实验。
图2显示举例说明本发明方法涉及的肉毒碱转运蛋白的动力学的图。 图2显示了测定包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的肉毒碱转运蛋白对底物 L-肉毒碱的动力学的实例。肉毒碱转运蛋白对底物去甲肾上腺素、甲基苯 基吡啶、5-羟色胺和肌酸显示相当的动力学。包含氨基酸SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：3的肉毒碱转运蛋白显示与图2所示相当的动力学。在图2 中，图的x轴表示肉毒碱浓度(μmol/升)而y轴表示肉毒碱转运蛋白的转 运率(pmol小时-1卵母细胞-1)。
如图2所示，肉毒碱转运蛋白对L-肉毒碱转运的浓度依赖性的测定显 示了适用于Michaelis-Menten动力学的肉毒碱转运饱和度。在图2展示的 实例中得到了15μM的KM值。因此，本发明方法中使用的肉毒碱转运蛋 白(特别是包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO： 3或由SEQ ID NO：4编码的肉毒碱转运蛋白)是高亲和力肉毒碱转运蛋 白，例如已经描述在肾和肠中用于肉毒碱转运(Lahjouji K，MaIo C， Mitchell GA，Qureshi IA，2002，Biochim Biophys Acta，1558，82-93)。
图3显示包含密切相关的小鼠、大鼠和人肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨 基酸序列比对，所述肉毒碱转运蛋白分别包含SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：1，各包含634个氨基酸。单个肉毒碱转运蛋白的相 应氨基酸位置在图3中排列在彼此下方，标记了在一条序列的给定位置或 全部三条序列的给定位置出现的氨基酸取代，这样可以观察相关蛋白质中 所谓的保守区和观察更多可变区。
从图3中的序列同一性很容易得出，全部三种蛋白质都密切相关，但 小鼠与大鼠蛋白彼此间的相关性比人肉毒碱转运蛋白更为密切。此外，技 术人员不需要过度劳动就可以从图3得出，所示序列的相关性超越了序列 同一性，并在序列的相应位置包含所谓的保守性氨基酸取代。如本领域所 熟知的，保守性氨基酸取代包含将给定序列位置处氨基酸取代为功能上相 似的氨基酸，其中氨基酸的功能与其侧链基团的化学特性有关，特别是与 电荷、酸性或碱性、亲水性、疏水性、硫含量、芳香性或大小，特别是小 侧链基团有关。
此外，技术人员不需要过度劳动就可以从图3得到包含任意数目的氨 基酸的序列基序，所述基序是包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3中的两种或三种的氨基酸序列组的特征性序列，或者是单个肉毒 碱转运蛋白，优选SEQ ID NO：1的特征性序列。优选地，特征性序列基 序包含在蛋白质中较少出现的至少一个(优选包含至少两个氨基酸的一组) 氨基酸。技术人员熟悉不需要过度劳动地鉴定包含非常见氨基酸的特征序 列基序。
此外，技术人员还考虑了关于本文图4、5和6中提供的相似氨基酸和 高度相似氨基酸之间氨基酸取代的附加信息，图4、5、6分别显示SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3之间以及 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之间的氨基酸序列比对。
优选地，本发明任一实施方案中使用的肉毒碱转运蛋白为包含氨基酸 序列基序的肉毒碱转运蛋白，所述氨基酸序列基序是包含SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3全部三种肉毒碱转运蛋白的特征性序列， 或者是包括两种所述肉毒碱转运蛋白的任意组的特征性序列，或者是单个 所述肉毒碱转运蛋白(优选SEQ ID NO：1)的特征性序列。优选地，肉毒 碱转运蛋白包含由于其与序列基序的相似性而无需过度劳动即可鉴定的氨 基酸基序，所述序列基序是图3中所示全部三种肉毒碱转运蛋白的特征性 序列，或者是包括两种肉毒碱转运蛋白的任意组的特征性序列，或者是单 个肉毒碱转运蛋白(优选SEQ ID NO：1)的特征性序列。
图4显示包含密切相关的人和小鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序 列比对，它们分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，共享86.9％的氨 基酸序列同一性。用短划标出相同的氨基酸，用单点标出功能相似的类似 氨基酸，用双点标出在功能和/或结构上几乎相同的高度相似氨基酸。
图5显示包含密切相关的人和大鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序 列比对，它们分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3，共享86.7％的氨 基酸序列同一性。用短划标出相同的氨基酸，用单点标出功能相似的类似 氨基酸，用双点标出在功能和/或结构上几乎相同的高度相似氨基酸。
图6显示包含密切相关的小鼠和大鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸 序列比对，它们分别包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，共享95.4％的 氨基酸序列同一性。用短划标出相同的氨基酸，用单点标出功能相似的类 似氨基酸，用双点标出在功能和/或结构上几乎相同的高度相似氨基酸。
图7显示包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10的氨基酸序列比对。 SEQ ID NO：1包含人肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列，而SEQ ID NO：10包含SEQ ID NO：1功能性剪接变体的氨基酸序列。SEQ ID NO：10 包含SEQ ID NO：1完整并相同的氨基酸序列以及包含39个氨基酸的附加 氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：10的氨基酸297至335)，所述附加氨 基酸序列插入在相应于SEQ ID NO：1的氨基酸296和297之间的位置。
图8显示包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9的核酸序列比对。SEQ ID NO：4编码SEQ ID NO：1的人肾和肠肉毒碱转运蛋白氨基酸序列，而 SEQ ID NO：9编码SEQ ID NO：1功能性剪接变体的氨基酸序列，即SEQ ID NO：10的氨基酸序列。SEQ ID NO：9包含SEQ ID NO：4完整的相同 核酸序列以及包含117个核苷酸的附加核酸序列(对应于SEQ ID NO：9 的核苷酸888至1004)，所述附加核酸序列插入在相应于SEQ ID NO：4 的核苷酸887和888之间的位置。
图9显示SEQ ID NO：5。
图10显示SEQ ID NO：6和7。
图11显示SEQ ID NO：8。
图12显示SEQ ID NO：11(NM_003060)。
图13显示SEQ ID NO：12(NP_003051)。
图14显示SEQ ID NO：13(NM_0033125)。
图15显示SEQ ID NO：14(NPJ49116)。
图16显示SEQ ID NO：15。
序列说明
SEQ ID NO：1包含人肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2包含小鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列，它是 SEQ ID NO：1的直系同源物。
SEQ ID NO：3包含大鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的氨基酸序列，它是 SEQ ID NO：1的直系同源物。
SEQ ID NO：4包含编码人肾和肠肉毒碱转运蛋白的开放读框DNA序 列，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：5包含编码小鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的开放读框DNA 序列，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。
SEQ ID NO：6显示来自SEQ ID NO：4起点的本发明寡核苷酸，其用 于克隆SEQ ID NO：4(正向克隆引物)。
SEQ ID NO：7显示来自SEQ ID NO：4末端下游的本发明寡核苷酸， 其作为反向引物用于克隆SEQ ID NO：4。
SEQ ID NO：8包含编码大鼠肾和肠肉毒碱转运蛋白的开放读框DNA 序列，所述肉毒碱转运蛋白包含氨基酸SEQ ID NO：3。
SEQ ID NO：9包含SEQ ID NO：4和附加序列，所述附加序列包含插 入在SEQ ID NO：4的核苷酸887和888之间的117个核苷酸。SEQ ID NO： 9在NCBI数据库(美国国家生物技术信息中心)以登录号XM_291120 提供。
SEQ ID NO：10包含由SEQ ID NO：9编码的氨基酸序列，其包含SEQ ID NO：1和附加序列，所述附加序列包含插入在SEQ ID NO：9的氨基酸 296和297之间的39个氨基酸。SEQ ID NO：10在NCBI数据库以登录号 XP_291120提供。
SEQ ID NO：11包含编码在人体内广泛表达的人肉毒碱转运蛋白 OCTN2的DNA序列。SEQ ID NO：11在NCBI数据库以登录号 NM_003060提供
SEQ ID NO：12包含SEQ ID NO：11编码的氨基酸序列，其在NCBI 数据库以登录号NP_003051提供。
SEQ ID NO：13包含编码仅表达于人睾丸的人肉毒碱转运蛋白“CT” 的DNA序列。SEQ ID NO：13在NCBI数据库以登录号NM_0033125提 供。
SEQ ID NO：14包含SEQ ID NO：13编码的氨基酸序列，其在NCBI 数据库以登录号NP_149116提供。
SEQ ID NO：15包含对应于人肾和肠肉毒碱转运蛋白mRNA的DNA 序列，包含SEQ ID NO：4、额外的5’侧翼序列和额外的3’侧翼序列。
实施例描述：
鉴定和克隆肾和肠肉毒碱转运蛋白的基因
令人吃惊的是，已经发现包含SEQ ID NO：4的核酸分子以组织特异 性方式在人肾和人肠中强表达。SEQ ID NO：4编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的肉毒碱转运蛋白。
使用来自人肾的cDNA作为模板以及包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7互补序列的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应(PCR)中扩增包含SEQ ID NO：4的DNA分子，所述寡核苷酸引物得自以登录号AK09054在数据 库公众可获得的DNA序列。
使用卵母细胞的转运测量
使用非洲爪蟾卵母细胞在所谓的“示踪剂通量法”中进行放射性标记化 合物的转运测量，其中测量底物穿过卵母细胞膜进入胞质的转运率。
注射爪蛙(非洲爪蟾)卵母细胞
用包含SEQ ID NO：4的cRNA分子注射非洲爪蟾卵母细胞。
在Sylgard沟中排列待注射的卵母细胞。使用硅酸硼制作的玻璃毛细 管(Hildenberg，Malsfeld；内径：0.5mm；外径1.0mm)进行注射，所述 玻璃毛细管在炽热螺旋状缠绕丝内进行精细拉伸。为了吸出和压进样品溶 液，使用得自Drummond公司的显微注射泵。用矿物油(Sigma 400-5重 白油，□＝0.88g/ml)无气泡地填充毛细管并装入与机械手一起提供的微泵。
用镊子小心地打破注射毛细管仍熔融的尖端，以允许泵出油并吸进期 望体积的RNA。在无菌矿物油膜下将RNA吸进注射毛细管，以避免RNA 的浓度提高和被污染物降解。将注射毛细管以90°角置于卵母细胞表面并 轻压插入卵母细胞。尖端进入细胞质的深度不应大于100-200μm。注入物 体积不超过50nl(0.9μl的卵母细胞体积的约5％)。在施加期望的体积 后5-10秒钟将注射毛细管停留在卵母细胞内，以允许压力补偿并避免注入 物通过打开的孔洞漏出。
防止泄漏的其他措施为在注射前至少10分钟在含有130而不是10nM NaCl的ORi中(即在高渗溶液中)“预收缩“卵母细胞。卵母细胞可能 丢失大量的卵黄，因此可能要排出部分注射液。
在18℃将经注射的卵母细胞保持在含有卡那霉素(50mg/L)的培养 基ORi中直至测量底物摄取。弃去受损的、发生剧烈的变化或随后受到严 重损伤的细胞。
72小时后，利用卵母细胞进行肉毒碱转运蛋白激动剂或拮抗剂的筛 选。
培养基ORi溶液
标准缓冲液为含有110mM NaCl、3mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2和5mM MOPS的卵母细胞Ringer溶液ORi。
需要时加入50mg/l的庆大霉素。
测定底物摄取
用200μl底物溶液填充用卵母细胞匀浆处理的聚苯乙烯孔。用于测定 之前先用ORi溶液洗涤卵母细胞两次。反应混合物中使用8至10个卵母 细胞以进行统计学评估。将卵母细胞加入底物溶液后，将反应混合物温和 混和并孵育。在22℃温育1小时。为了终止反应，加入1ml冰冻ORi。 在15ml冰冻ORi中洗涤卵母细胞四次。接着将卵母细胞单个转移进6ml 计数瓶中。加入100μl 5§SDS溶液破坏卵母细胞质膜。轻柔地摇动瓶以破 坏质膜。通过摇动30至45分钟使质膜完全破坏。将裂解液与2ml闪烁混 合物混合。在包含发光校正和外标准的液闪数器中测量裂解液的放射性。 每个瓶计数5分钟。
为了测量加入卵母细胞后的底物浓度，从反应混合物中移去2×10μl 溶液，加入100μl 5％SDS溶液并用计数器进行评估。在转运率的计算中 考虑得到的值。
测定KM值
为测定浓度依赖性底物摄取，制备所研究底物的系列稀释液，并如此 分配放射性，从而在上清液中对每个反应混合物的计数在10000和20000 cpm之间。就KM测定而言，测量底物摄取一小时。此外，使用注入H2O 的卵母细胞进行测量，以测定背景即非特异性底物摄取，例如扩散和内源 转运蛋白介导的摄取。计算转运率并对底物浓度作图，并按照 Michaelis-Menten方程进行数学修正。